primer+5.0简介

primer 5 primer 5.0简介 PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列该软件主要由一下四个主要功能板块组成 GeneTank 序列编辑 Primer 引物设计 Align 序列比较 Enzyme 酶切分析 Motif 基序分析 新版更新 种间交叉引物设计利用来自多个物种的序列设计扩增引物病理检测引物设计可用来在高保守区域设计引物等位基因特效引物设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物 基础指南 这段指南并非详细的说明仅为使用者对PRIMER PREMIER的菜单选项有一个直观的了解四个功能板块都有各自的窗口和菜单正在使用中的窗口就是您所见到的窗口以下列出了各功能板块的主要菜单选项 GeneTank File, Edit, View, Search, Function, Translate, Window,Help. Primer File, Edit, Function, Report, Graph, Window, Help. Enzyme File, Function, Window, Help. Motif File, Function, Window, Help. 使用功能菜单时该菜单所属的窗口就会被激活利用各菜单中的window选项记录的所有打开的窗口可以方便的在各个窗口之间进行切换所有的列表都有复选功能对于windows或Power Mac系统而言在点击同时按住CTRL键即可将当前的选择加入选单按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有选项 GeneTank 利用GeneTank您可以打开DNA或者蛋白质序列也可以选择不同的阅读框架共三种将DNA翻译成蛋白质或利用蛋白序列反推出DNA序列为方便使用软件已经提供了普通密码子列表和几种线粒体密码子列表您也可以输入您自己的其他线粒体密码子列表序列编辑器提供了包括多媒体语言校读在内的完整的序列编辑功能这一功能板块包括以下部分 GeneTank 打开浏览编辑及翻译序列 Translation 将打开的序列翻译或反推成其他序列 Edit Codon Table 编辑翻译所依据的密码子列表 GeneTank窗口 GeneTank的窗口用来显示序列及其文件 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 头信息序列可以3碱基10碱基一组显示您可以将打开的序列翻译或反推成其他序列您也可以使用通常的拷贝剪切和粘贴命令编辑当前序列GeneTank的窗口上也有启用Primer Align Enzyme Motif功能板块的快捷键查看序列点击相应按钮或从View菜单中选择您可以查看文件题头改变5 末端序列起始位置选择3碱基或10碱基一组的显示方式文件题头是指存在于序列文件中位于序列信息上游的文字内容点击header按钮或从View菜单中选择可以显示文件题头信息改变5 末端序列起始位置默认为1 序列将从您指定的5 位置开始显示序列 可选操作 View >Show Header View >Grouping View > 5’ Seq No 某些版本没有这一项 打开已有序列 使用菜单File >Open 可以激活文件选择对话框用来打开您希望处理的包含特定序列的文件如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMER PREMIER会自动识别打开文件中的序列起始位置或是您曾经使用本软件菜单中File > Save命令以PRIMER PREMIER默认格式保存过该文件序列将自动打开如果打开其他格式的序列文件将出现一个可卷动的Import Sequence窗口并显示全部序列在序列第一行的起始处双击则双击处以前的所有信息将被认为是文件题头然后PRIMER PREMIER会自动剔除非序列字符并将序列在GeneTank里打开创建新序列该项功能可以让您手动键入一个新的序列您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定的文件夹内并可以象其他如GenBank格式的文件一样进行操作Windows用户请注意默认设置的DNA序列文件后缀为SEQ 蛋白序列文件后缀为PRO 当然您可以使用其它的任何序列文件类型使用提醒如果您选错文件发现并没有您所希望的序列只需要关闭Import Sequence 窗口重来一次即可保存序列使用本软件保存的序列可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置建议您在诸如以下情况保存序列您需要经常使用同样的序列您已经编辑完一段序列并希望保存结果您已经输入一段新序列编辑序列只需在eneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列而编辑翻译或原始序列十分方便在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列例如如果你在一段蛋白序列上无论该序列是被翻译的或是用来反推DNA的原始序列删除一个氨基酸残基在相应DNA上的对应三位密码子将同时被删除但如果您改变一段翻译出的序列这一改变将仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上编辑序列可以使用直接键入或利用剪贴板通常的剪切拷贝粘贴同样可以方便的在此使用其快捷键分别是CTRL-X, CTRL-C和CTRL-V软件提供三碱基一组的显示方式以利于蛋白相关的工作在键入DNA序列时可以使用A C G T或者附录B所列出的多义碱基在键入蛋白序列时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来当您完成编辑后请注意保存序列 查找 利用GeneTank窗口上的Find 按钮您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定字符查找到第一个后您也可以使用Find Next 按钮在余下的序列中继续查找使用Search菜单选择Go To osition可以将指针移到您指定的位点可选操作某些版本在Edit菜单下 Search >Find Search >Find Next Search >Go To Position 查看不同链 要查看该序列的互补链您只需要点击GeneTank窗口上的A按钮就会显示该序列的互补链此时互补而点击S按钮就能恢复成原来的序列您亦可点击dsDNA按钮以双链形式显示 可选操作 View > Sense Strand View > Anti-sense Strand View > ds DNA 语音校读 在GeneTank打开一段序列后您可以按下语言按钮启用语音校读功能序列将从指针所在的位置开始被依次朗读序列再次按下语音按钮将停止朗读按下键入朗读键将在键入的同时朗读输入的序列再次按下该按钮可以停止键入朗读 可选操作 Function > Speaker 编辑序列比较结果 当一项多序列比较完成后比较结果可以通过编辑来获得更准确的配对通常ClustalW法则能够给出一个准确的比较结果因而手工编辑并非必要但对于个别情况或出于特殊要求可能有这种需要所以本软件也提供这一功能将点击指针指向的碱基可以实施改动按下空格键可以插入一个空隙按下Delete键则可以删除一个空隙一旦比较结果被改动最大和最小同源性参数也会自动改变 粘贴序列窗口 这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去分别为正向As is 反向reversed 互补complemented 以及反向互补reversecomplemented 这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向 参数设置 Preferences 参数设置窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数也可以允许您查看及更改引物评分参数设定二级结构在引物评分中所占的权重系数默认引物长度默认值为25默认引物长度在Primer Premier窗口使用即点即选功能时得到的引物长度该项参数也是Primer Premier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基引物对搜索最大值默认值为100在自动搜索引物时得到的结果数量可以很多由于该软件按照引物评分来衡量引物效率有些引物虽然合乎标准但评分较低可能没有全部列出的必要尽管我们设置了100对引物这一较大的数值您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值核酸浓度默认值为250 pM根据文献7 Freier等提供的计算公式这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓度它即不是引物浓度也不是起始 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 浓度而是PCR产物的浓度由于在PCR过程模板的浓度变化很大很难确定具体数值根据文献11的建议Rychlik等一般经验公式在普通PCR反应中将其当作250 pM 这项数值被用来计算引物的退火温度 单价离子浓度默认值为50 mM这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度离Mg2+离子浓度默认值为1.5 mM这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度总Na+当量这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+离子浓度计算得来计算公式如下Sprt即取平方根 总Na+当量单价离子浓度4 Sqrt 游离Mg2+离子浓度1000这项数值用来计算引物的退火温度自由能计算设置温度默认值为25 °C这项数值用来计算自由能G 自由能计算公式为G= H T S. 评分参数 Rating parameters 评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数二级结构越稳定引物评分就会越低相对于在引物中间形成的二级结构来说3 末端的二级结构对PCR扩增的影响会更大为了将这一效应计算在内软件将3 末端的二级结构的自由能数值G减去1 这一修正会使3 末端的二级结构显得更加稳定这一修正值是根据未公开实验结果制定的您可以根据自己的需要来更改软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值G 如果没有检测到二级结构则该数值为0序列比较 这一部分仅在Primer Premier的Windows版本中使用对于Macintosh系统序列比较是提交到网上完成并下载比较结果在Primer的教程中有关于这方面的完整信息Align 序列比较窗口让您将已经打开的序列进行比较序列选择框显示所有将要比较的序列使用Add 和Delete 按钮可以增加一个序列或移除一个序列使用Options 按钮可以打开序列比较的参数设置窗口序列比较参数设置您可以利用Alignment Parameters 序列比较参数设置窗口来修正ClustalW法则用来优化比较结果的各项参数序列比较可以用两种模式完成一种准确但较慢slow/accurate一种快速但较粗略/approximate 选择不同的模式将会得到不同的结果 SLOW/ACCURATE模式的序列比较参数 这些参数无法改变序列比较的运行速度它们被用来对序列比较评分然后换算为百分比数值即最后显示的百分数并转化为进化树上的进化距离 1 Gap Open Penalty 比较结果中一个空隙的罚分 2 Gap extension penalty 比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分 3 Protein weight matrix 这是描述氨基酸之间的相似性的评分标准 4 DNA weight matrix 为核酸配对制定的评分标准包括IUB多义密码子 FAST/APPROXIMATE模式的序列比较参数 这种同源性评分是由一种快速粗略的通用比较方法计算得来的它包括4项参数有两种方法用以快速获得序列比较结果 1 只计算准确配对的部分k-tuples 2 只计算最佳配对的情况 K-TUPLE SIZE 这是默认的准确配对的片段长度增加这一数值可以提高运行速度对于蛋白序列最大值为2 对于DNA最大值为4 减少这一数值则可以增加灵敏度对于较长的序列例如大于1000字符您可能需要增加默认值GAP PENALTY 这是快速比较种每个空隙的罚分若非设定成很大的值对比较的速度影响不大 TOP DIAGONALS 在一个虚拟的点划分分析法中需要计算的在每个对角线上使用的ktuple配对数量在比较中只有最佳配对的情况才会被使用由这项参数指定其数量增加这一数值可以提高运行速度减少这一数值则可以增加灵敏度 多序列比较参数 这些参数控制最终的多序列比较每个多序列比较包括多个双序列比较的过程按照预定顺序依次进行相应的基本控制参数有两种空隙罚分gap penalty 以及位置同源或替代的权重系数scores for various identical/nonidentical residues 1 和2 GAP PENALTY由菜单选项1和2控制它们设定空隙以及空隙长度造成的罚分增加空隙罚分可以减少比较结果中空隙的数量增加空隙长度的罚分可以使空隙更短末端的空隙不会被罚分 3 DELAY DIVERGENT SEQUENCES 打开这一选项将会先比较同源性高的序列后比较同源性较低的序列该项数值即将特定同源性百分数设定为阀值低于该同源性的序列将会推迟比较 4 The TRANSITION WEIGHT 为碱基转换AG或C T即嘌呤之间和嘧啶之间的替换设定从0到1的权重系数系数0意味将碱基转换看作一个完全的错配系数1意味将其看作一个完全的配对对于远源序列建议将其设置为0 而对于同源性较高的序列将这一系数适当增加会有好处 5 PROTEIN WEIGHT MATRIX 该选项可以打开一个让你选择权重矩阵weightmatrices 的菜单对于蛋白质分析默认的矩阵是由Jorja和Steven Henikoff 创建的BLOSUM系列矩阵请注意是使用一系列矩阵因为到底使用哪一个矩阵取决于序列之间的同源程度进化差异不同所使用的矩阵也不同 6 DNA WEIGHT MATRIX 该选项打开一个菜单选择一个而不像蛋白分析那样是一系列核酸权重矩阵默认的一个是BESTFIT用来比较核酸序列的矩阵 7 在权重矩阵中如果您愿意可以使用正值也可以使用负值如果不使用NEGATIVEMATRIX 负值权重矩阵选项系统将默认使用正值 8 PROTEIN GAP PARAMETERS 蛋白序列空隙参数选项可以打开一个菜单让您可以设置蛋白序列比较结果的空隙罚分参数该选项仅在蛋白序列比较中可用更多信息 如果您想得到关于设置参数和ClustalW法则的更多信息请从以下网址获取由原作者提供 的完整文件www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/clustalw.html 序列翻译 激活序列 在GeneTank窗口的一个列表框内显示了原始序列以及由它翻译出的其他序列产生翻译序列的机制如下 Translated DNA 从原始的蛋白序列推导DNA序列或由原始DNA翻译出蛋白序列再由蛋白序列反推出的DNA序列 Translated Protein 从原始DNA翻译而成蛋白序列或原始蛋白序列翻译出DNA序列再由DNA序列反推出蛋白序列 推导DNA按钮 当前序列为原始或推导DNA时该按钮不可用当前序列为蛋白序列时点击该按钮将会激活一个odon Table Selection窗口您可以选择密码子列表和阅读框架翻译结果中的多义碱基请参照说明书的附录 可选操作 Translate > To DNA 翻译蛋白质按钮 当前序列为原始或推导蛋白序列时该按钮不可用当前序列为DNA序列时点击该按钮同样将会激活Codon Table Selection窗口您可以选择密码子列表和阅读框架如果原序列中存在的多义碱基使密码子无法翻译成为蛋白残基该残基位点会用*号代替 可选操作 Translate > To Protein Edit Codon Table窗口 使用这一窗口您可以创造新的密码子列表删除或编辑已有的密码子列表但PRIMERPREMIER 提供的标准密码子列表是不能编辑的使用ADD 按钮创建新的密码子列表会使用标准列表并初始命名为某一数字> 使用Edit Codon Table Name对注意如果您多次翻译一段序列只有最后一次的翻译结果才能被保留而以前的翻译结果将被忽略 话框可以编辑列表名称使用DELETE 按钮则删除当前列表要改变某一密码子对应的氨基酸只需要用鼠标将其拖放到相应位置就可以点击密码子时鼠标指针会发生变化提示您正对其操作任何拖放操作会改变两行内容一行即某种氨基酸得到一个密码子的同时另一行失去这个密码子 Primer 引物设计 Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎软件包含了强大的自动搜索法则只需要简单的操作就可以得到合适的引物PRIMER PREMIER也提供了人工控制搜索引擎的方法便于根据您的特殊要求制定标准输出的引物通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和二级结构关键参数如Tm值GC含量和自由能G还能以图形显示还有另一个窗口来显示引物的比吸光度activity 单位nmoles/OD和ug/OD 及引物的分子量还可以将当前引物输入数据库打印或填写引物合成定购单为设计用于定点突变的引物该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的引物编辑工具您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物为分析多对反应引物如在复式及巢式PCR中使用function菜单下Multiplex/Nested选项您可以分析所有想用到的引物可以选择事先搜索的引物或手动添加引物软件提供将引物储存到数据库的功能也提供填写引物合成定购单的功能定购单上会自动填入引物序列和其他重要信息该项功能板块由以下部分组成 Preferences 参数设置窗口 Primer Premier 引物设计窗口 Edit Primer 引物编辑窗口 Search Criteria 搜索标准窗口 Search Parameter 搜索参数窗口 Search Results 搜索结果窗口 Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR引物设计窗口 Database 引物数据库窗口 Synthesis Order Form 生成引物合成订单 Reports 结果报告 Graphs 图表 Primer Premier 引物设计窗口 Primer Premier 引物设计窗口是分析引物的关键该窗口包括以下功能即点即选DirectSelect 引物性状列表和二级结构显示具体介绍如下 Direct Select 即点即选框 当您将鼠标指针移至该框中指针将变为铅笔型点击框中任何一处会产生一条起始位置最接近点选位置并与原序列互补的引物所有引物性状将即时更新引物5 和3 末端也会标记上以区分引物的扩增方向如果点选一组序列比较结果引物序列将依据保守序列来确定这使得您很容易知道引物与某一特定序列有哪些错配位点在序列比较中应用即点即选功能在利用高保守序列区域设计引物时Primer Premier会在引物窗口显示序列比较这样您很容易知道引物与每一特定序列有哪些错配位点点击序列任一地方将根据保守序列产生一条引物并加以分析引物也可以被编辑以便同某一特定序列匹配这些可以用来设计针对等位基因的引物通过View 菜单选项可以切换显示多数倾向和少数分歧碱基Majority or MinorityConsensus 切换到显示少数分歧碱基可以看出哪些核苷酸不能很好的与所有序列匹配 性状列表 这一列表显示了当前引物对的各种性状您可以通过以下三种方式选择一对引物作为当前引物对Direct Select框根据上述使用Direct Select的方法选择一条引物切换到另一条互补链选择反向引物得到一对引物对在Search Results 搜索结果窗口里选择一对引物对使用输出命令在数据库窗口里选择一对引物对性状列表能自动更新正反引物的长度起始位置融链温度Tm GC含量GC% 多义性比吸光度Optical Activity 单位ug/OD 对于引物对来说长度条显示了PCR产物的长度而Ta Opt项显示了PCR反应适宜的退火温度各种引物性状计算公式请参阅附录A 二级结构 PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构在左下的两排按钮可以想您显示发现了哪些二级结构而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构除了二级结构图框里也显示二级结构的自由能数值G 单位kcal/mol在PRIMER PREMIER窗口内的图框里显示的是最稳定的二级结构连续碱基配对用实线显示而不连续碱基配对用虚线显示按下按钮All 就会给出当前二级结构的报告您选择正向引物的发卡结构并点击All 就会显示以下内容可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序最稳定的一种排在最前使用卷动条可以看到未显示的部分 除了上述功能这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮Search Criteria 搜索参数窗口Search Results 搜索结果如果已经实施过搜索窗口以及Edit Primer 引物编辑窗口点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示注意如果您想使用上述方法选择一条例如如正向引物而不是一对引物您需要手动回复原来的反向引物来和新引物配对注意如果有至少连续三个碱基配对就会被认为能形成发卡二聚体或错配之类的二级结构 Edit Primer 引物编辑窗口 Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列在windows系统或Power Mac的Command-X Command-C 及Command-V系统中您可以使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切拷贝和粘贴删除当前引物序列并从剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基如果您修改氨基酸残基相应位置可能出现多义密码子 除了上述的引物性状和二级结构资料具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节该窗口也提供了限制性酶分析功能您可以通过点击Enzyme 按钮通过手动或软件提供的筛选 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 来选择一组限制性酶您可以使用Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点通常这项功能可以让您确认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在其他信息如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表请关闭本窗口从主菜单上选择Function >GeneTank激活GeneTank窗口再选择Translate > Change Parameters打开Select Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口 可选操作 Function > Edit Primer Search Criteria 搜索标准窗口 以下是基本搜索标准的详细信息根据PCR引物测序引物或杂交探针的不同要求选择不同的搜索标准是很有必要的 PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准某些用以优化引物扩增能力的标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计这两者需要的是较高的退火温度因此当您选择不同的搜索标准PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求搜索公式中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter 自动搜索参数章节Search Type 搜索类型框将指定您要搜索的是单个引物两条单独引物引物对或为当前引物找寻合适的反向引物默认设置下Search Range 搜索范围是当前序列的全长默认PCR产物长度为100 bp到500 bp 如果您是搜索单个引物该数值将不会起作用您也可以为搜索设定Primer Length引物长度您将会在下一章节了解该项设定的具体作用最后您可以设定Search Mode 搜索模式为自动或手动除非您有很特殊的要求或想完全控制特定的搜索参数建议您使用自动搜索利用PRIMER PREMIER找到多条引物再从中通过详细分析来挑选合适的使用 Search Parameter Windows 搜索参数窗口 搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配您可以在激活False Priming选项后利用Files 按钮选择这些序列文件 Automatic Search 自动搜索 尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值您还是可以选择在自动搜索中需要使用哪些参数点击去掉相应参数左边框中的则该参数在搜索中不会被考虑自动搜索开始的标准很严格但如果没有找到合适的引物则标准会自动降低直到找到合适的引物下列图表中显示了在PCR引物设计中自动搜索初始的严格参数其中Tm值范围是根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的如果您是搜索测序引物则相应参数会有所不同具体列表如下图 Manual Search 手动搜索及引物设计原理 在过去十年中为获得高效扩增PCR方法得到的很大发展我们对引物稳定性二级结构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下大大提高了引物的扩增效率而PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡引物长度引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度对越多数实验适宜引物长度为18到24个碱基等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物也允许您通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度不过长引物通常更易于形成包括发卡结构二聚体自身互补等二级结构理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围如果您改变了它们软件将会自动记录并在下次使用直到您再次改变它们因此您最好根据不同实验的特殊要求输入合适的长度范围PRIMER PREMIER 以最短的指定长度开始搜索引物如果找到的引物的Tm值小于设定范围或GC含量不符合要求它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否符合要求如果引物长度达到最大值还不能符合要求则该引物将会被剔除这种搜索机制保证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物为设计一条高效引物有几个参数必须考虑PRIMERPREMIER搜索所考虑的参数依次如下 Tm 融链温度 PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论nearest neighbor theory 来计算融链其他信息如果您选择手动搜索并点击Stringency 严格度按钮您会得到类似以上的自动更新的图表 温度请参看附录A中关于公式的说明选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度在自动搜索中PRIMER PREMIER使用的范围选择机制如下 首先计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值得出平均值后按照不同的严格度要求确定的波动值根据这一平均值来计算出Tm范围根据已发表的实验数据文献8 PCR反应的合适Tm范围为56到63°C 以上机制是被设计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物 GC% GC含量 对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50% 请参看上文Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具体参数 Degeneracy 多义性 当设计多义引物时应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免3末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸详情请参看本说明的Degeneracy 多义性章节 3’ End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端如果引物3 稳定性强有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸 GC Clamp GC钳 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的一个引物的内部稳定性曲线表 Repeats and Runs 重复和循环 PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物例如引物包含ATATAT这样AT被重复三次那么这个引物将被剔除您可以设定可以接收的碱基重复的数量Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用 Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构并由于发卡结构的形成是分子内的反应仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成发卡结构的稳定性可以用自由能衡量自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应按下按钮All 可以使用PRIMER PREMIER软件中的Hairpin Report功能帮助您回避类似二级结构 Dimer 二聚体 引物之间的配对区域能形成引物二聚体它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增使用Dimer Report功能可以预测二聚体的形成 False Priming 错配 如果引物可以结合除目的位点外的其他区域扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布smear PRIMER PREMIER会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成局部的错配3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量 Pair Rating 匹配度评分 匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始PRIMER PREMIER会计算每一对引物的匹配度100分为满分并按照分数按降序排列计算引物对匹配度以及单个引物评分的公式请参看本说明的附录 Search Results 搜索结果 当您点击搜索程序窗口的OK 按钮接受搜索结果后Search Results 搜索结果窗口将会打开它显示了搜索中找到的所有引物或引物对如果您选择了一条引物或一对引物对在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果与当前的序列配对的引物的位置和序列也会在Direct Select框上显示 可选操作 Function > Search Results 其他信息Search Results窗口的位置和大小是可以调节的这样在其他窗口里您感兴趣的显示 内容如引物分析结果就不会被遮住了 Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物窗口 巢式PCR反应通常能大幅提高灵敏度同时又减少非特异性扩增产物通常在模板DNA浓度太低或不纯时采用您可以使用自动搜索或按您实验的需要搜索然后从中选择一系列合乎要求的引物PRIMER PREMIER可以确认它们是否会形成二聚体来帮助您选择巢式PCR反应引物当您接受搜索结果选择菜单Function >Multiplex/Nested Primers选项即可打开该窗口所有引物与全序列以图形显示在窗口顶部序列上的框架代表窗口中间放大显示的部分序列所在的位置通过拖动横行滚动条可以改变放大显示的区域所有提供的引物以竖线形式在顶部的图框显示以蓝色三角形或红色三角形在下面的放大框中显示蓝色代表正向引物红色代表反向引物点击三角形即选定一条对应的引物应用于您的巢式PCR反应同时三角形由空心变为实心表明已被选中选中的引物会在下面的图框中以图表形式显示您会看到在您选择引物的同时已选引物间可能存在的交叉二聚体也同时显示出来PRIMER PREMIER能即时分析所有的已选引物并显示它们之间间可能存在的交叉二聚体结构您可以继续选择引物直到您找到一组没有或很少有稳定的交叉二聚体的引物要剔除一条已选引物非常简单再次点击对应的实心三角形就可以了您也可以手动添加一条引物这样便于您使用已有的引物或通用引物您也可以手动添加所有的引物并分析它们之间的能否形成交叉二聚体您可以指定输入的寡聚核酸作为正向引物还是反向引物它们的起始位置和序列如果不指定起始位置则默认为5末端第一个碱基如果想删除一条引物只需选定并点击Delete 按钮您可以打印模板序列及所有的引物已选引物显示为实心三角形未选引物显示为空心三角形列表包含的引物以及所有可能的交叉二聚体结构也同样被打印出来 Database 引物数据库窗口 引物数据库可以用来保存引物序列您可以为每一条引物命名并保存在一个原有的或新建的数据库中在数据库窗口中您可以使用Order Primers按钮来定购引物有两种主要方法可以将已选的引物输入到数据库中您可以在Search Results窗口中标记想选择的引物然22后在引物数据库窗口中使用Get Marked Primers按钮将标记的引物全部输入到数据库另一种方法是您直接选择一条或一对引物再利用Current Primer Pair 当前引物对图框将其输入数据库引物数据库可以保存引物的起始位置序列对应链和引物名称选择一条引物使用菜单的编辑选项或点击本窗口的快捷按钮可以编辑引物的起始位置序列对应链即方向和引物名称从下拉菜单里选择一个引物数据库您可以使用Import 按钮输入以往保存的引物并在当前序列上进行分析在引物被选择后您可以使用PRIMER PREMIER窗口对其进行编辑和分析您可以使用Edit Primer窗口上的prime 按钮在当前上序列寻找最佳的结合位点您可以添加一个新的数据库并命名区分这样便于您依照不同的项目或模板序列将保存引物信息您也可以同样便利的删除一个数据库使用Add Primer 按钮可以添加一条新引物同时激活一个窗口用来填写引物名称起始位点对应链和引物序列如果不指定起始位置则默认为5 末端第一个碱基 Reports 分析报告 使用Reports菜单可以提供多种分析报告除了在PRIMER PREMIER窗口下也可以直接打开的二级结构报告也可以提供当前引物的内部稳定性图表和比吸光度报告选择Reports菜单下的Optical Activity选项能打开一个报告窗口显示当前引物对的分子量和比吸光度activity 单位nmoles/OD和ug/OD当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示一条贴近最近的序列的分界线而数据输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示该图表窗口可以调整大小以便看清细节当您选择Reports菜单下的Hybridization Time 杂交时间选项您可以输入引物的长度和浓度点击Analyze 按钮可以得到杂交时间 Synthesis Order Form 合成订单 在搜索及分析完引物后如果您决定定购合成该引物您可以使用软件生成订单为方便您使用软件已经有一个现成的模板您可以创建一个新订单并输入您的地址和其他信息并命名保存您可以使用这个订单作为今后的订单模板Database window 数据库窗口可以用来选择您想合成的引物只需选择您想合成引物点击Order Primer 的快捷按钮PRIMER PREMIER 将在合适的位置自动添加您选择的引物并附上地址及其他信息生成一张订单您可以加上您的注释并将其打印送出您可以保存该订单便于以后查看 Optical Activity 比吸光度 引物对于260nm波长紫外光的吸光度即A260与其浓度成正比1mg/mL的DNA吸光度为0.02 软件也能计算引物的分子量以便计算如何稀释新合成的引物Molecular Weight 分子量正反引物分子量均以grams/mol 克/摩尔为单位这是根据分子量列表计算得出的nmol/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的纳摩尔数量这是根据吸光系数和分子量列表计算得来的ug/A260 在260nm波长紫外光下每单位吸光度代表的引物的微克数量这是根据吸光系数列表计算得来的 Degeneracy 多义性 某些PCR实验需要引物结合到不确定的序列例如下列情况知道表达蛋白的序列但是不知道DNA序列模板DNA测序结果不准确或不完全利用其他生物体已确认的序列来扩增某一编码区利用模板的同源序列设计引物在设计多义引物时除了在上述搜索参数章节提及的一般参数外也要考虑引物的多义性多义性尽可能低的引物有更高的特异性因而更为理想尽量避免3 末端的多义性也很关键因为3 末端即使一个错配也会抑制延伸PRIMER PREMIER 能自动搜索模板序列设计出在3 末端多义碱基比例和数量都较少的引物参见文献13有报道说PCR程序能显著改变多义引物扩增的成功率该种优化程序开始的2 5个循环采用不严格的退火温度然后的25到40个循环使用更为严格退火温度宽松的退火条件可以允许部分配对的引物与模板结合在两个循环后扩增产物的5 末端就与引物一致并能很好的作为以后扩增的模板了此时提高退火温度能得到更高的特异性 Graphs 图表 通过Graph菜单可以获得整个序列Tm 融链温度GC% GC含量和Internal stability内部稳定性的图表Tm是所有可能的引物的融链温度引物长度是由Preferences 默认参数设定的GC%则是所有可能引物的GC含量Internal stability 内部稳定性则是在每一序列位点起始的五聚体的稳定性自由能当您在内部稳定性图表上移动鼠标指针将会显示一条贴近最近的序列的分界线而数据输出窗口也会即时更新而相应五聚体会高亮显示 Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析 PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶的分析功能包含约900种酶同时也提供工具让你您方便的添加其他酶通过从默认群组中选择或剔除限制性内切酶您可以创建一个新的群组使用此外您可以根据限制性内切酶特性使用特征筛选来创建新的群组并作为当前群组来进行限制性内切酶分析限制性内切酶分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序列这一功能板块有下列几个部分 Restriction Enzyme Analysis Window 限制性内切酶分析窗口 Filter Window 特征筛选窗口 Edit Window 编辑窗口 Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析窗口 PRIMER PREMIER 为您提供的限制性内切酶分析功能包含约900种酶您可以启用群组编辑从All Enzymes 全部酶中添加或删除一些酶作为当前使用的群组SelectedEnzymes 框显示了当前使用的群组包含的酶它是全部酶的子集被用来做限制性内切酶的分析有两种方法可以用来选择当前群1 从All Enzymes 框中选择您想添加的酶添加到当前群组中对于windows或PowerMac系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个酶按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有酶使用Add 按钮将选中的酶加入到当前群组在SelectedEnzymes 框中选择酶并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定酶同样在AllEnzymes 框中双击某个酶即为添加在Selected Enzymes 框中双击某个酶即为剔除2 使用特征筛选窗口根据某些特征来选择当前群组具体请看下面的Filter window 特征筛选窗口的章节 Restriction Sites 酶切位点窗口 在Restriction Enzyme Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Restriction Sites窗口可选显示方法有Table 列表以表格形式列出酶识别序列和切割位点以及在待分析序列上的切割位置Sequence 序列显示所有酶在分析序列上的实际切割位点Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的酶切位点Non-cutters 无切点酶列出所有在序列上没有切点或不符合预设参数的酶您通过指定切点数量限制来有选择的显示酶切分析结果例如您点选4 数字框切点多于或等于5个的酶将不会被显示使用菜单的File >Print 您可以打印以Table Sequence 或Non-cutters 形式的分析结果 Edit Enzyme 限制内切酶编辑窗口 想要在All Enzymes群组中修改某一种酶选择该酶并点击Edit 按钮可以激活EditEnzyme 限制性内切酶编辑窗口在这里酶的名称识别位点和热稳定性都可以修改注意如果某个酶的切点多于50个将只显示前50个其余的则被忽略点击Add 按钮可以激活新内切酶窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete按钮则可删除选定的酶点击OK 按钮则保存所有修改并返回Restriction Enzyme AnalysisWindow 限制性内切酶分析窗口 Filter 特征筛选窗口 您可以使用特征筛选窗口根据酶的特征来选择当前群组进行分析选择相应的数字框在4碱基到13碱基的范围内指定酶的识别位点Selected Enzymes框内会即时更新为只包括符合条件的酶列表您可以根据需要指定粘端overhang 类型及粘端序列下面的图表举例说明了粘端类型点选Heat Inactivation 框您也可以指定酶群组是否能被热灭活当您点击OK 按钮后Selected Enzymes框内包含的内切酶列表将成为酶切分析使用的当前群组并将使用该群组进行限制性内切酶分析注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改 Motif Analysis 基序分析 软件为您提供了包括约165种常用基序的分析功能同时也提供工具让你您方便的添加其他基序通过从默认群组中选择或剔除基序您可以创建一个新的群组使用并作为当前群组来进行基序分析基序分析可以采用以下几种格式显示列表图谱或序列这一功能板块有下列两个部分 Motif Analysis Window 基序分析窗口 Edit Window 编辑窗口 Motif Analysis 基序分析窗口 PRIMER PREMIER 为您提供的基序分析功能包含约165种基序您可以启用群组编辑从All Motif 全部基序中添加或删除一些基序作为当前使用的群组Selected Motif 框显示了当前使用的群组包含的基序它是全部基序的子集被用来做基序分析可以用下述方法来选择当前群组从All Motif 框中选择您想添加的基序添加到当前群组中对于windows或Power Mac系统而言在点击同时按住CTRL键即可选择多个基序按住SHIFT键同时点击可以选择两次点击之间范围内的所有基序使用Add 按钮将选中的基序加入到当前群组在SelectedMotif 框中选择基序并点击Delete 按钮可以从当前群组中剔除特定基序同样在All Motif框中双击某个基序即为添加在Selected Motif 框中双击某个基序即为剔除 Motif Sites 基序位点窗口 在Motif Analysis窗口点击OK 按钮可以打开Motif Sites窗口可选显示方法有Table 列表以表格形式列出基序基序序列和数量以及在分析序列上的位置Sequence 序列显示所有基序在分析序列上的位置Map 图谱以长条形式显示序列在其中使用竖线表示所有的基序的位点Motifs Absent 不存在的基序列出所有在序列上没有或不符合预设参数的基序您通过指定基序数量限制来有选择的显示基序分析结果例如您点选4 数字框出现多于或等于5次的基序将不会被显示使用菜单的File >Print 您可以打印以Table Sequence 或Motif Absent 形式的分析结果 Edit Motif 基序编辑窗口 想要在All Motif群组中修改某一种基序选择该基序并点击Edit 按钮可以激活Edit Motif基序编辑窗口在这里基序的名称识别位点和基序说明都可以修改点击Add 按钮可以激活新基序窗口其名称和识别位点采用默认设置点击Delete 按钮则可删除选定的基序点击OK 按钮则保存所有修改并返回Motif Analysis Window 基序分析窗口注意如果某个基序出现多于50次将只显示前50个其余的则被忽略注意您无需每次修改都点击OK 按钮软件能记住您这一次的所有修改点击OK 按钮可以保存所有修改而点击Cancel 按钮则放弃所有修改 Menu Commands 菜单命令 以下功能板块都有自己的主菜单 GeneTank 主菜单 Primer Premier 主菜单 Enzyme Results 主菜单 Motif Results 主菜单 GeneTank 主菜单 File New Sequence 重新打开一个序列空白的GeneTank 窗口 Open Sequence 提示您使用一个文件来打开已有序列 Save 将当前序列保存为一个文件无需经过Import Sequence 窗口确认序列起始位置 您就可以打开一个这样保存的文件 Save As 将当前序列另存为指定文件 Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义 Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出PRIMER PREMIER 最近打开的四个文件列表 Edit 通常的剪切cut 复制copy 和粘贴paste 选项 Preferences 让您选择软件种使用的各种参数某些版本该选项在File主菜单下 View Show Header 显示在GeneTank窗口打开的当前序列的文件题头 Sense Strand 显示当前序列的正链 Anti-sense Strand 显示当前序列的负链 ds DNA 显示当前序列的双链 Grouping 选择3个碱基一组或10个碱基一组的显示方式 5’ Seq no 指定序列5 端起始位置并重新排序某些版本没有该选项但在窗口上有快 捷按钮 Search 注意某些版本没有该主菜单相应选项在Edit主菜单下 Find 从当前位置开始在序列中查找特定序列段 Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置 Go To Position 将指针移动到序列的指定位置 Function Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物 Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析 Motifs 即根据预设参数进行基序分析 Bias majority by 当某一碱基不保守时倾向以哪一序列为准 Speaker 语音校读 这一主菜单下的选项除了当前使用的功能外都可选 28 Translate To DNA 从当前蛋白序列反推DNA序列 To Protein 将当前DNA序列翻译为蛋白序列 Change Parameters 改变翻译的阅读框或密码子列表 Edit Codon Table 添加删除或修改密码子列表 Window 这一主菜单列出除当前窗口外已打开的所有窗口选择其中一个将切换到对应窗口 Help 使用这一菜单查阅帮助文件帮助文件中的信息与本说明大致一样帮助以屏幕格式显示并包含超链接便于您快速转至相关主题也可以使用搜索功能寻找主题 Primer 主菜单 File Preferences 让您选择软件种使用的各种参数 Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义 Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出PRIMER PREMIER Edit Find 在序列中查找特定序列段 Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置 Function Search 打开Search Criteria window 搜索参数窗口设定参数