omgaE.Z.N.A.质粒试剂盒操作规程说明书(译版)
1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落,接种含适当选择性抗生素的2-5ml的LB或YT培养基进行培养。37℃强力摇动(~300rpm)孵育20-24h。使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。此类菌株包括DH5α和JM109。
2. 将1.5-5.0ml细菌菌液室温13,000 g离心3min。轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。
3. 加入200μl 的溶液Buffer T 1/Rnase A重悬沉淀,涡旋或用移液器反复吹打。充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。
4. 加入200μl溶液Buffer T 2,倒置、转动试管5-10次使之轻轻混匀,得到透明的裂解产物。室温孵育5min。不要用力混合,以免使染色体DNA断裂,减低质粒的纯度。该步反应不要超过5min。溶液II不用时要拧紧瓶盖,以免试剂被空气中的CO2酸化。
5. 加入200μl溶液Buffer T 3,立即倒置试管15-20次混匀,直至白色絮状沉淀物形成。冰上孵育5min。为避免形成局部沉淀,加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。
6. 4℃13,000 g离心10分钟。白色沉淀物形成,立即进行下一步操作。
7. 小心翼翼的吸取上清液,加入到新的1.5ml离心管(不是试剂盒提供的)中。加入200ul 用异丙醇稀释的BAC 结合液(缓冲液),颠倒3-5次充分混匀。BAC 结合液使用前必须用96%-100%的异丙醇稀释,详细的说明见瓶壁或第三页说明书
8.加入样本DNA(HiBind DNA MicroElute)到提供的2ml收集管中。
9. 室温8000g离心30s,丢弃收集管,将离心柱放入新的收集管中。
10. 将收集柱放回收集管并加入750ul SPM buffer(用乙醇稀释),室温8000g离心30s,丢弃收集管,将离心柱放入新的收集管中。
11. 将空柱子以最大速度离心2min,使柱子的基质干燥。此步骤为关键操作,不可遗漏。
12. 将柱子放入干净的1.5ml微量离心管中。将20-50μl(取决于终产物的期望浓度)洗脱液(Elution Buffer)或无菌去离子水直接加入柱子基质上,使之于室温下静置5min。
13.最大速度离心2min洗脱DNA。可以进行二次洗脱,以收集残存的DNA。
14. -20℃保存洗脱的DNA。
15. DNA的产量和质量:分别在波长260nm和280nm处测定样品适当稀释液的吸光度。DNA的浓度计算如下:
DNA浓度=A260×50×(稀释倍数)μg/ml
A260/A280的比率可以反映核酸的纯度。比值大于1.8表明核算的纯度在90%以上。或者,DNA的产量(及质量)有时可以通过琼脂糖胶/溴乙锭电泳与已知浓度的DNA样品相比较更好的予以确定。通常情况下洗脱的大部分DNA是超螺旋单体形式,但也可能存在串联体形式。
适用于BACs,PACs,P1s和质粒分离步骤(标准)(D2156-00,D2156-01,D2156-02)彭伟
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