南京林业大学_植物组织培养笔记(完整)

第一章 绪论 第一章 绪论 植物繁殖方式：分株、播种、压条、扦插、嫁接、组培繁殖 一、组培的概念： 狭义：在无菌条件下，将离体的植物组织小块，在适宜的人工培养和环境条件下进行无菌培养，使培养体逐步分化出器官，一个组织或单个细胞（甚至用原生质）接种到培养基，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等人进行培养，使其形成完整植株的过年。） 广义：通过无菌操作，把植物体的一个器官、一种组织或单个细胞（甚至原生质）接种到培养基，在人工控制的条件下（营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其成为完整植株的过程。 狭义与广义：组织范围不同。 二、组培发展史 诞生 1、植物组织培养技术的诞生可以追溯到19世纪末20世纪初。 2、1839—1840年，施莱登和施旺创立了“细胞学说”。 3、1902年，德国 生理学家 Haberlandt 提出了高等植物细胞全能性理论。 4、1934年，美国 White 利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，离体根的培养获得成功。 5、1943年White 发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 了《植物组织培养手册》 6、1962年 Marshing和Shong发明了MS培养基。 Gautherer White Nobecount 一起被誉为组织培养学科的奠基人。 组培发展 1、1948年 Skoog和崔徵通过对烟草茎切断和髓培养组织研究确定了腺嘌呤，生长素是控制芽和根的生长。 2、1956年 Miller等发明了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素。 3、50年代至今，组培迅速发展 1971年， Takebe在烟草上首次使用原生质体获得自身植株。 1962年，印度Guha 毛叶曼陀罗 花药培养 1973年，Carlson 两个烟草物种原生质体融合 1983年，Zambryski 用根癌农杆菌转化烟草 转基因植物 1978年， Murashige 提出“人工种子”的概念。 三、组培术语 1、外植体（explant）:从植物体分离下来用于离体培养的材料； 2、愈伤组织（callus）:在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，躲在植物体切面产生。 3、分化（differentiation）:细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。 4、脱分化(differentiation)：原已分化的细胞，失去原有的形态功能，又恢复到没有分化的雾组织的细胞团和愈伤组织，（即转变为分生状态）这个过程称为脱分化。 5、再分化（redifferentiation）:在一定的培养条件下，经过脱分化的组织和细胞，经重新分化而产生新的组织和器官（如由愈伤组织形成芽、根或胚状体），称为再分化。 6、胚状体（embroid）：在组织培养中，从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。 7、初代培养(first culture)：外植体的第一次培养。 8、继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料。 9、植物细胞全能性（totipotent）:植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育为完整植株的潜能。因为每个细胞都是来自于受精卵，所以有与受精卵具有相同的遗传物质。 10、生根培养： 11、驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。 组培的一般过程： 初代培养—继代培养—生根培养—驯化培养 四、组培的分类 1、按培养基分类 培养体：固体 液体（静止、旋转、纸桥、震荡） 2、根据外植体分类：植株培养 器官培养：根系培养、茎段培养、叶片培养、花器培养、果实培养、种子培养 组织培养：分生组织培养、薄壁组织培养、疏导组织培养 胚胎培养：看护培养、平板培养、悬浮培养、微室培养 原生质体培养：非融合培养、融合培养 五、组培的特点： 1、培养条件可以人为加以控制； 2、繁殖系数大，培养周期短； 3、管理方便，有利于实现工厂化生产和自动化控制。 六、组培的应用 （一）快繁 突出优点“快” 应用：工厂化育苗（industrializing propagation）：兰花、桉树、非洲紫罗兰、大花蕙兰 体胚发生：枸杞、核桃、苹果、青扦 （二）植物脱病毒（virus free）：马铃薯、甘薯、草莓、苹果、香石竹等。通过托病毒可以保持园艺植物的优良性状。 （三）种质保存：加入冷冻保护剂，有利于细胞，胚状体，试管苗，愈伤组织等的长期保存。 （四）植物育种： 1.单倍体育种：通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株。 2.胚培养，子房培养，胚珠培养 3.突变体的选择和应用 4.体细胞杂交和遗传 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 5.遗传转化与基因工程 （五）有用化合物的工程化生产 生产化合物：强心苷、吲哚生物碱、喜树碱、银杏黄酮和内酯 七、组培的生理依据 1、植物细胞的全能性 2、激素在分化过程中的作用 在分化过程中植物激素的作用是明显的，合适的激素配比在器官分化有重要作用。 第2章​ 实验室的设备和操作 一、实验室的设计 洗涤室—准备室— 无菌操作室—培养室—观察室 （1）​ 洗涤室（cleaning room）大型水槽，最好是白瓷水槽、铺垫橡胶、上下水道要畅通、塑料筐 （2）​ 准备室 洗涤室+配置室=准备室（化学实验室） 1.设备及器具： 1）​ 大型工作台：用于配置培养基母液和培养基等，其高度应方便配制工作； 2）​ 药品柜：用于放置常用药品。 3）​ 普通冰箱 4）​ 电子分析天平和托盘天平 用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品准确为0.0001g。 5）​ 电蒸馏器 6）​ 电炉或微波炉：用于琼脂的溶解 7）​ 酸度计 8）​ 培养基分装设备 9）​ 高压灭菌锅：必备的 10）​ 恒温培养箱：生化培养箱、光照培养箱、人工气候室、植物生长箱 11）​ 烘箱：用于干燥需要保持80—100℃；干热灭菌需要保持150℃，达1—3h。 2.灭菌室 （三）接种室（无菌操作室tranafering room） 宜小不宜大，一般8平方米，吊装1—2盏紫外线灭菌灯。 超净台（cleaning table）：有水平式，垂直式、单人操作和双人操作。 解剖镜：通常放大5—80倍；带有照相装置。 无菌操作的器具：酒精灯、镊子、解剖刀、解剖刀片、医用剪、广口瓶 （四）培养室（culturing room）: 作用：用于培养接种的植物材料，培养室要求具有一定的照明及控温、控湿设备（全自动）。 具有以下条件 1、温度：15℃或23—28℃左右，安装空调设备； 2、湿度：70%—80%之间，可安装加湿器； 3、光照：1500—3000lx; 4、时间：10—16h，控制日照时间，可安装定时开关；注意长日照植物与短日照植物对光的需求。 5、培养架 6、摇床及转床 二、玻璃器皿及用具：试管、三角瓶、培养皿等。 （一）对玻璃器皿的要求：1、耐腐蚀，耐高温，高压；2、透明 3、易于放外植体（口径大） （二）规格要求：1、长试管：2.0x15cm;2.5x15;3.0x15。 2、三角瓶：一般用于液体培养，50—250ml口径在2.5—3.0cm 3、培养皿：用于固体培养基，特别用于转基因植物叶片培养 4、T型试管和L型试管 5、培养瓶 6、封口瓶塞：要求 具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染 7、选瓶机 （三）其它工具 细菌过滤器：用于一些被高温破坏，不能进行高压灭菌的物质，如：吲哚乙酸、玉米素等 孔径在45um左右 细胞计数器：血板计数板 烧杯、量筒、移液管、移液器 （四）接种工具 消毒器具、长短镊子（25cm）、解剖刀、剪刀、接种针、酒精灯、接种铲、过滤网 第二节 培养基 一、培养基的成分 培养基（culture medium）是植物组织培养的重要基质。只有筛选出合适的培养基，培养才有可能成功。 培养基的成分主要有：水、无机盐、有机化合物、生长调节物、天然附加物、支持物 （1）​ 水分：蒸馏水或重蒸水 （2）​ 无机盐：是植物生长所必须的化学元素，主要包括大量元素和微量元素。 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S等 微量元素：小于10-5-10-7mol，碘、铁、硼、锌、铜、锰、钴、钠 配制铁时需要用Fe2（SO4）3和FeCl3在pH5.2以上 （3）​ 有机化合物（organic compound）：有机营养包括糖、维生素、肌醇及氨基酸 （1）糖类：植物组培时，光合作用很弱，需在培养基添加糖类。 作用：1）作为生长发育所需的碳源和能量；2）维持一定的渗透压（1.5-4.1大气压之间）。 最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖也是较好的碳源，麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组培中也有应用。 糖浓度：1）蔗糖使用浓度在2%—3%，常用3%，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%。 （2）维生素：常使用浓度1—1.0mg/l之间，以B族维生素为主。如：维生素B1、B6、B9、VB5、VH、VM、VC（抗坏血酸）等。 （3）肌醇（环己六醇）：用量一般为50—100mg/l。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁形成有作用。 （4）氨基酸：是蛋白质的组成成分。 常用的氨基酸有甘氨酸。其它精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、丙氨酸等也常用，另外多种谷氨酸混合 如水解络氨酸（可促进胚胎发生）。 （四）生长调节物：生长素 细胞分裂素 1）生长素类：在组培中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂，伸长生长。 吲哚乙酸（IAA）：可人工合成，其活力较低，高温高压易分解。 萘乙酸（NAA）：在组培中的启动能力要比IAA高出一倍，可以人工合成耐高温高压，不易被分解破坏。 NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA吲哚丁酸：促进发根能力较强的生长物质。 2，4—D：促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。 GA：用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。 2）细胞分裂素(cytokinin)：腺嘌呤的衍生物，6—BA、KT（激动素）、ZT（玉米素）、TDZ ZT的活性最强，单非常贵，常用G-BA。 作用：（1）诱导芽的分化，促进侧芽的萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用； （2）促进细胞分裂与扩大； （3）抑制根的分化。 多用于诱导不定芽的分化……浓度甚微，0.05~5mg/L。 （五）培养材料的支持物 （1）琼脂：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在6—10g之间（0.6—1.0%）；影响琼脂的凝固能力的因素：与原料、厂家的加工方式有关；与高压灭菌时的温度、时间、PH值等因素有关。长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱使琼脂发生水解，时间过久，琼脂变褐，会逐渐丧失凝固能力。PH在5.8左右。 优点：操作简便，通气问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 易解决，便于经常观察研究等。 缺点：培养物接触面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用；同时培养物排出的代谢物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。 （2）其他支持物：玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出有害物质。 （六）附加物：天然复合物，其成分比较复杂，大多含氨基酸，激素，酶等一些复杂化合物。 1）椰乳：使用最多，效果最大。10%~20%。 2）水解酪蛋白：100-500 mg/L 。 3）酵母提取物：0.01%-0.05%。YE：主要用于细菌培养。 4）麦芽提取物：0.01%-0.5%。 5）苹果和番茄的果汁等。 二、培养基的种类 基本培养基 完全培养基 按照培养基对植物的作用可分为：空白培养基（不加人激素的培养基）、诱导培养基（使植物细胞脱分化）、分化培养基（使脱分化的细胞再分化出根茎等器官）、生根培养基 常用的培养基：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM—8P培养基等 按培养基物理性状分：固体培养基和液体培养基（精致培养、振荡培养） 1）MS培养基：高盐培养基。1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特别是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较为合适。 2）B5培养基：低盐培养基。1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。 3）White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又做了改良，称White改良培养基，提高了MgSO4的浓度并增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。 4）N6培养基：1974年由中科院植物所朱至清等为水稻等禾谷类植物而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花药培养、细胞及原生质体培养。 5）KM-8P培养基：1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质的融合培养。 三、培养基的配制： （一）母液的配制和保存 为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液。易于低温保存。一般为10~200倍。 MS培养基母液的配制： 母液1：为大量元素，包括 硝酸铵：33000mg、硝酸钾：38000mg、氯化钾-2H2O：8800mg、硫酸镁-7H2O：7400mg。配成20倍的母液，各化合物分别溶解后在顺次混合并加水至1000ml。 母液2：为微量元素，包括KI 166mg、硼酸 240mg、MnSO4-4H2O 4460mg、ZnSO4-7H2O 1720mg、钼酸钠-2H2O 50mg、CuSO4-5H2O 5mg、CoCl-6H2O 5mg。配成200倍的母液，化合物分别溶解后混合，加水至1000ml。 母液3：为铁盐，配成200倍母液，FeSO4-2H2O 5560mg、Na-EDTA-2H2O 7460mg。这两种化合物各用450ml蒸馏水溶解，然后混合并调节PH值为5.5，再加水至1000ml。 母液4：为维生素类，氨基酸母液包括肌醇20000mg，烟酸100mg、盐酸吡哆醇 100mg、盐酸硫胺素20mg、甘氨酸 400mg 形成200倍母液，各种化合物分别溶解再混合并加水至100ml。 注意事项：①配制好的母液分别贴上标签，注明母液号，日期及配制1L所得的能量；②放在冰箱内可保存几个月；③维生素和氨基酸类即母液4易发生霉菌，一次不易多配。④液体培养基的配制方法与固体相同。 （二）激素母液的配制 每种激素必须单独配制成母液，浓度单位mg/L（ppm），用时根据需要取用。因为激素用量少，一次可配成50ml或100ml。 各种激素配法：1）①将IAA、IBA、GA等先溶于少量的95%的酒精中，再加水定容一定浓度。②NAA先溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容到一定浓度。③2，4—D可用少量1molNaOH,溶解后，再加水定容到一定溶度。④将KT和BA先溶于少量1mol的HCl中再加水定容。⑤将玉米素（ZT）先溶于少量95%酒精，再加热水到一定浓度。 2）配制的激素浓度一般为200mg/L(ppm); 3）配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称，配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量。 （三）工作培养基的配制 1、基本培养基配制： 1L MS培养基：母液1—50ml；母液2—5ml;母液3—5ml;母液4—5ml; 2、激素配制：一般生长素浓度的使用为0.05—5mg/L，细胞分裂素0.05—10mg/L； 3、母液一般配制100—200mg/L；培养基中添加的量：如要求NAA2.0，母液为200mg/L，配制1L培养基所取的量为100×2/200=10（ml） 4、定容至1000ml; 5、添加蔗糖溶液30g、琼脂6—7g; 6、调节PH值（较为关键）一般在5.8左右，因培养材料来源而异，大多数为5.6—6.0，用1N氢氧化钠和1N盐酸调整，高压灭菌后，PH值会向偏酸的侧移动0.1—0.3。 PH影响培养基的硬度 PH>6.5培养基会变硬，PH<5.0培养基不易凝固； 7、加热溶解； 8、分装； 9、灭菌。 配制培养基的注意点：1）在使用提前配制好的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； 2）用量筒或移液管取培养基母液之前，必须用所取的母液将量筒或移液管润洗2次； 3）量取的顺序写在纸上，量取一种，划掉一种，以免出错。 第四节 灭菌及无菌操作 植物组织培养成败的关键：保证无菌，避免污染。 1、​ 器皿和用具的洗涤（P28）： 玻璃器皿洗涤方法：先用碱洗，即用肥皂粉刷洗，用清水清洗，晾干。 难洗的器具：需用铬酸-硫酸混合洗涤液浸泡，浸泡后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。 2、​ 培养基灭菌及培养基、植物材料的消毒 （一）培养基的灭菌（高压灭菌） 一般程序： 1.按实验需求配制…… 2.……加水，防止干烧。 3.将培养基瓶，所用的培养皿，接种用的器具，蒸馏水等需要灭菌的东西放入锅内。 4.关上锅盖，拧紧。 5.打开电源，开始加热，至100℃，3~5min。 6.灭菌锅自动关上排气阀，开始加压，温度继续上升，温度到达121℃。 7.维持此温度，压力维持0.1~0.2MPa下，保持10-20分钟。 8.时间到后自动降压降温至100℃，压力为零。 9.在94℃时切断电源，可打开锅盖，取出培养基冷却，灭菌完毕。 灭菌最少时间： mL min 20~50 15 75~150 20 250~500 25 1000 30 注意事项：①在灭菌之前一定要检查锅中的水位，严禁干烧，以免造成事故。 ②灭菌前还需检查排气阀是否关上。 ③只有当锅中压力为零时才能打开锅盖，否则会有危险。 ④锅内应留有空隙，不能太满。 ⑤灭菌时间不宜过长，也不可以超过灭菌锅规定的压力范围。 （二）物体表面灭菌 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌。 范围：桌面、墙面、双手、材料表面。 消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭，洗衣粉；吐温-80。 （三）接种工具灭菌 用前干热灭菌 160-180℃，1.5-2.0h 用前湿热灭菌 121℃，20-30min 接种前用酒精棉球檫试，侵入95%酒精液中，并在酒精灯上灭菌。 （四）实验服、口罩、滤纸灭菌 湿热灭菌 121℃，20-30min …… （五）接种室灭菌 紫外灯照射（接种室、超净台、接种箱）：波长260nm，距离小于1.2m，2.-30min。 臭氧灭菌机：1~2h。 熏蒸灭菌：5-8mL/m3甲醛+5g/m3高锰酸钾；冰醋酸。 接种台喷雾消毒：75%酒精。 （六）培养室灭菌 新建培养…… 隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地一次，用高锰酸钾擦。 三、无菌操作 灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面积和孔隙内一切微生物或生物体，即所有有生命的物质全部杀死。 消毒：杀死、 消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。 灭菌剂名称 使用浓度% 清洗难易 灭菌时间 灭菌效果 酒精 70-75 易 0.1-3 好 Ca(ClO)2 9—10 易 5—30 好 氯化汞 0.1-0.2 较难 2-10 最好 常用化学消毒剂： 酒精灭菌的原理： 1)​ 酒精具有较强的穿透能力和杀菌力，它使细菌蛋白质变性。使用的浓度一般为70—75%。 2)​ 处理时间15—30s，不宜太久，因此细胞容易收缩脱水。它具有浸润和灭菌双重作用，适用于表面消毒； 3)​ 在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，可提高杀菌效果。 植物材料消毒程序：1）清洗（流动自来水冲洗数小时，洗衣粉毛刷等清洗）；2）灭菌剂浸泡灭菌；3）无菌水清洗4、5次擦干；4）加表面活性剂（吐温-20或吐温-80，加强表面活性剂，磁力搅拌，超声振荡）。 常规二次消毒法：材料先放入70%的乙醇中，约30s后再在0.1%的氯化银中浸泡，2—0min，或在2%次氯酸钠中浸泡20min,然后用无菌水冲洗3、4次。 四、广谱实验法 在广谱试验中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机物质、生长素、细胞分裂素 4类物质各3种浓度的自由组合即构成了3项包括81个处理的实验。 第五节 培养条件 1.光照：组织培养中有的材料需要在按条件下培养，有的需要在光条件下。 2.温度： 低温：使培养物生长停顿。 高温：不利于培养物生长，…… 变温：…… 3.湿度：70%~80% 思考题： 1.一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？ 2.组织培养常用的设备有那些？各有何用途？ 3.组织培养的条件有那些？ 第三章 第一节 植物外植体选择及其消毒 1、外植体的特点： 植物生长都要经过幼年期和成年期两个大的阶段。幼年期是植物早期生长阶段。成熟过程发生在幼态组织中。植物组织一旦进行细胞“决定”，并就如成熟态，则一般不可以逆转，而且具有很强的稳定性。这种稳定性可以通过许多代细胞分裂而传递，类似一种“记忆”功能。 成熟度分布：对于同株植物从幼年到成年转变是由茎基部向顶部转变的，即木本植物基部通常是幼年期，顶部是成熟期，中部则是中间类型。 植物的微体快繁，一般称为微繁殖，分为四个阶段：1）选择、2）增殖、3）壮苗和生根、4）试管苗的移植 复壮：P54 完全复壮：由成熟组织或细胞经胚胎发生形成正常的幼态植株。有性生殖产生的合子是自然的完全复壮。 部分复壮：树木器官、组织细胞中仅仅有某些成熟特性消失和某些幼态特性重现，发生变化的特征和发生变化的过程可能各不相同，但组织或细胞在一定程度上恢复了形态发生能力。 复壮措施：1）栽培技术措施：将成熟枝条的接穗嫁接到幼嫩砧木上。反复修剪和强修剪以矮化母株可能提高复壮程度。2）物理化学措施：NaOH、H2SO4、萜烯、抗菌素等化学处理。3)组织培养措施：幼年部位的外植体要比成年部位外植体容易组织培养成功。对于取自成熟植株的外植体组织培养时可采取以下方法：外植体小型化、离体培养物的连续培养、组织培养中使用的培养基添加剂（激素等）。 2、外植体的种类：1）带芽外植体：顶芽、腋芽、根茎连接处的萌蘖等。2）胚：指天然状态和试管中精卵融合受精后形成的各个时期的胚。 3、外植体选择的特点：①选用实生苗组织②植物的种质：成年优树作为供体母树（如抗逆性、产量高、品质好等）③各器官的生理、发育年龄、幼态区的分布（分布部位）④外植体的增殖能力⑤注意取材时的季节和时间。春季较好，秋季较差，雨季不易成功⑥选取材料的大小：茎段0.5-1cm，脱毒苗外植体0.2-0.5cm。 4、外植体的消毒： 植物材料的预处理：1）修剪树木组织。2）先培养在无糖的培养基中。3）避免在雨天取样。 5、茎、叶的消毒：①用流水冲洗②洗后先用70%乙醇浸20-30秒钟③再置于第二种消毒药剂浸泡消毒④无菌水洗4~5次。 6、果实种子的消毒（基本同上） 7花药的消毒：将幼穗或花蕾进行体表灭菌即可。 第二节 外植体的增殖 芽增殖的2种途径： 器官发生的途径：不定芽：直接再生不定芽和愈伤组织不定芽（间接再生） 定芽： 一、带芽外植体的增殖（定芽） 外植体的来源：包括顶芽、腋芽、根茎连接处的萌壁。 1、​ 嫩梢扦插繁殖：芽生芽、枝生枝 一个月内增殖3~4代。关键是芽位的选择，以上部3-4节的茎段或顶芽较好。 2、​ 丛生芽增殖：茎尖、带腋芽的茎段或初代培养的芽，可使腋芽不断萌发，生长，形成丛芽，将丛生芽分离分割，再增殖为丛生芽。 3、​ 定芽快繁的优点：能保持遗传的稳定性，不易受培养条件的影响而发生变异。 4、​ 激素的浓度： 细胞分裂素：6-BA、PBA、KT、ZT、TDZ等 0.1~10mg/L、 生长素：NAA、IAA、IBA等。 5、​ 影响定芽增殖的因素 1）​ 与基本培养基配方有关；2）与激素配比有关；3）与外植体的生理发育年龄有关。 2、​ 不定芽： 1不定芽：除叶腋或茎尖以外，任何部位（非正常部位）产生出来的芽叫做不定芽。 形成不定芽的类型：不定芽的形成常随植株种类不同有极大差异。 直接再生：不定芽在外植体的表面直接产生； 间接再生：先诱导产生愈伤组织，然后愈伤组织上分化出不定芽。 2、不定芽的历程 1）外植体经脱分化过程； 2）由已脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞。 3、遗传的稳定性 不通过愈伤组织而直接形成不定芽的途径可保持原品种特性遗传稳定性强。而进过愈伤组织阶段，特别是多次继代的愈伤组织。 3、​ 体胚的发生 合子胚：精子与卵子结合形成合子，合子发育成胚，即由受精卵形成的胚。 体细胞胚（体胚）：不定胚或胚状体。 植物的体细胞胚发生：是指双倍体或单倍体的体细胞胚（非合子细胞）在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程，即利用各种体细胞组织，通过立体培养方式，诱导产生细胞配的过程和技术。 体细胞胚含义：1）体细胞是组织培养的产物；2）体细胞胚起源于非合子细胞（体细胞）；3）体细胞胚的形成经历胚胎发育过程。 胚发生过程：球形胚、心性胚、鱼雷形胚和子叶形胚直至成熟胚。 经体细胞胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体。 体胚发生的起源部位：1）由外植体表皮细胞直接产生胚状体；2）由外植体组织内部细胞产生胚状体。3）由愈伤组织的表面产生胚状体；4）由胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体；5）单个游离细胞产生胚状体。 体胚发生的主要形式： （1）直接产生：是指体细胞胚不经过愈伤组织阶段而从外植体上发育而成。 （2）间接产生：对外植体中已分化，诱导处理主要是促进脱分化，进行发育命运的重决定，诱导出胚性细胞。 两者的区别：后者要经历一个愈伤组织阶段（单细胞或原生质体）培养的中间阶段。 影响胚状体发生的内外因子： （1）基因型：杂种的外植体要诱导频率高；不同基因型：杂种的外植体要诱导频率高，一般都归因于基因型的影响，单倍体、二倍体、三倍体。 （2）外植体及生理状态：生理状态和发育程度、幼胚、下胚轴、子叶最佳。 34种针叶树体胚发生中由18种以未成熟胚，15种以成熟胚。 （3）培养基成分： 氮素：如以硝酸氮为唯一氮源的White培养基，则几乎不能诱导出胚状体； NH4/硝态氮：适当的比值为15：34 氨基酸：谷氨酰胺 K：K浓度增加，促进体胚发生。 铁盐：胡萝卜球形胚，缺铁不能发育到心形胚阶段； 其它无机盐：Mg、Zn 蔗糖：提高糖浓度增加，可增加体胚的发生。 激素： （1）不加任何激素 柑橘、枸骨叶冬青； （2）需加入2，4-D，对禾本科植物的体胚诱导特别重要； （3）只需加入细胞分裂素就可以诱导体胚发生； （4）分裂素与生长素混合；脱落酸和赤霉素抑制胚状体的发育，但在培养的后期可添加。①可抑制不正常胚状体的形成，防止胚状体的畸形胚形成。②特别是在胚状体发育的后期使用脱落酸较有利。 （5）渗透压 影响植物体细胞胚胎发生的效果，通过增加糖浓度，提高渗透压； （6）其它条件：加活性炭、光强、温度都会影响体胚的发生。蓝光新兴胚的发育。低温处理。 5、胚状体的形态特征 胚状体发育早期与发育的芽在外观上，1971年Haccius提出一个对胚状体鉴别较为合适的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 1）均具有两级性：有发育得早期，在方向相反的两端分化出茎端和根端； 2）胚状体的维管组织与母体植物或外植体的微管组织没有结构上的联系，所以通过震荡或镊子轻轻拨就可与其他组织分开。 3）与胚的发育不同，具有单极性的芽或根往往与母体植株或愈伤组织形成的维管束相连，因而不易分离。 6、人工种子： 由于胚状体具有两性的结构，可以直接形成再生植株，而其他再生途径必须经过多次续代，诱导生根，才能形成小植株，胚状体的再生途径比较节省人力物力。 分类： 第一类是裸露的或休眠的繁殖体。如适当干燥的体细胞胚。休眠的额微鳞茎和微块茎等，它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 第二类是人工种皮包被的繁殖体。一些体细胞胚、原球茎等虽不能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持较好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 第三类 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚，不定芽茎尖等，均需要先包埋，在液态凝胶中，再经过人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽率。 人工种子的制备：体细胞胚状体的诱导和发生时制备人工种子的基础。由种皮、胚、胚乳构成。体细胞胚胎外部包上人工胚乳、人工种皮就可以制备人工种子。 人工种子的应用：1）可大量繁殖转基因植株；2）快捷高效的繁殖方式，缩短育种时间；3）人为赋予种子多种优良品质；4）固定杂种优势，天然种子是有性繁殖。 优点：数量多、速度快、结构完整，再生率高等。而且为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达…… 第四节 植物离体快繁的常见问题 一、污染 污染的种类： 1.、细菌性污染 2、真菌性污染 3、内生细菌污染 1）概念：植物组织中普遍存在内生细菌； 植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌。 普遍性：金线莲：组培中的污染率达到50%；仙客来 块茎80%。 2）症状：表面细菌引起的污染通常在2-3天，就能在外植体周围或培养基表面，出现明显的或不明显的细菌菌落； 3）危害性：内生菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率低。 4、细菌污染及内生细菌污染的防治措施 对母树的预处理：1）改善植株的栽培环境；2）促发新枝；3）黄化处理；4）用抗生素进行预处理；5）改进灭菌方法；6）添加抗生素多次消毒，使用混合消毒液含PVP（聚乙烯）。 二、褐变 （一）产生原因：植物体内含有多酚氧化酶，当切割材料时，激活了组织中的多酚氧化酶，或破坏了组织中酶底物与酚类化合物被氧化，产生带棕褐色的醌类物质，这种醌类物质能毒害整个组织叫做褐变。 （二）影响褐变的因素：P80 1）基因型 木本植物比草本植物易引起褐变；2）外植体的生理状态；3）培养基；4）温度和光照；5）外植体大小；6）外植体组织的受伤程度；7）材料转移；8）用于外植体体表灭菌的化学药品。 （三）克服外植体产生河边的措施：1）选择适宜的外植体和培养条件（选旺盛生长的外植体）2）还原性物质或吸附剂（柠檬酸、硫代硫酸钠、活性炭）3）对培养材料进行预处理（基乙烯吡咯烷酮预处理（PVP），螯合剂螯合Cu2+）4）选择合适的培养条件：选择适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平以及pH值、低温按培养等可以防止褐变的发生。5）连续转移。 三、玻璃化苗：P182 （一）概念：试管玻璃化苗：即玻璃苗，就是试管苗的茎、叶变成透明水浸状，生长畸形，增殖系数明显下降，难以诱导生根，即使诱导生根，其根系质量极差，移植成活率极低。 （二）玻璃化苗的特征：1）矮小肿状，呈半透明玻璃状；2）有时发育出大量短而粗的茎、扁平、节间很短；3）叶片没有功能性气孔，由于保卫细胞的功能。 （三）产生原因：1）低温；2）水势和相对温度；3）培养时的过高温度；4）培养基中较低的琼脂以及铵态氮，硝态氮的比例不协调。 （四）防治玻璃苗的具体措施：1）降低细胞分裂素激素水平，添加ABA，可减轻玻璃化现象；2）减少培养瓶内的湿度，及培养基的含水量；3）纯化培养物；4）避免高温；5）提高培养基中琼脂含量，可达到1.1%；6）调整培养基供氮形势，减少铵态氮，提高硝态氮浓度；7）降低培养基温度；8）适当提高无机盐的含量，适当延长光照。 四、白化苗 在禾谷类作物培养中普遍存在的大量的白化苗，绿苗较少的现象。 26℃增加到35℃时白化苗增加。降温是有利于叶绿体的发育。 思考题： 1.灭菌与消毒的区别？Why？ 2.常用的灭菌方法各有哪些优缺点？ 3.采用高压蒸汽灭菌时，应注意哪些事项？ 4.根据发育方向，初代培养课分为几种？ 5.组配成苗途径有几条？ 6.理解无菌操作的意义及途径？ 7.污染、褐变和玻璃化产生的原因及预防对策？ 第四章 植物微繁脱毒技术 一、病毒存在的危害 1、大多数不通过种子传播； 2、通过营养体进行传递，在母株内逐代积累。例：葡萄扇叶病毒使葡萄产量减少10-18%。 二、根除病毒的途径： 1、病毒病害与细菌和真菌病害不同，不能用药物处理； 2、消除营养体的病原菌； 3、用组培的办法消除。 三、病毒的分布特点： 1、感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异； 2、越靠近茎顶端区域的病毒感染深度越低，生长点（约0.1-1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少； 3、在老组织中较多；病毒数随着茎尖的距离的加大而增加。 4、在茎尖存在高水平的内源生长素，可以抑制病毒的感受； 分生 四、分生组织少毒的原因 1、在植物体内，病毒易于通过维管系统而移动，但分生组织中，不存在维管系统。 2.在旺盛的茎尖分生细胞中，代谢活动很高，病毒无法进行复制。 3.存在一种病毒纯化系统，分生组织不易受感染。 4.高水平的内源生长素，可以抑制细菌的感染。 五、热处理脱毒： 1、温汤浸渍处理：在50℃左右的温水中处理3-5min; 2、热空气处理：对活跃生长的茎尖效果较好。切取茎尖分生组织进行离体培养，生长室温度35-40℃。 三、茎尖培养脱毒 茎尖概念：茎尖培养按取材大小，可分为茎尖分生组织和普通组织培养两种类型。 茎尖培养无病毒的程序：热处理从受侵染的植株截取并单个茎段—剥去茎尖—茎尖培养—由茎尖培养出再生植株—病毒检验—症状（指示植物、电子显微镜、血清检验等）—获得无病毒植株—原种的保存（离体无性繁殖，在隔离区内大量繁殖）。 （一）茎尖分生组织：指茎顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm 分生组织能逃避病毒侵染的原因： 1）​ 在植物体内，病毒易于通过维管束而移动，但在分生组织中，不存在维管系统； 2）​ 在旺盛的茎尖分生细胞中，代谢活动很高，病毒无法进行复制； 3）​ 存在一种病毒纯化系统，分生组织不易受感染； 4）​ 在茎尖存在高水平的内源生长素，可以抑制病毒的感染。 （二）普通茎尖培养：指带有叶原基的较大茎尖，其大小从几毫米到几十毫米。 特点：操作方便，易成活，成苗时间短，所得的植株也可能是无病毒的。目前采用较大一点的生长锥（0.1-0.2mm，带1-2个叶原基）并结合热处理，得到很好的效果。 四、热处理结合茎尖培养 (一) 1）进行热处理 热空气： (二)茎尖培养的操作： 1、​ 取材和消毒：茎尖生长期间，预先喷几次药，选用剪去2-3cm的壮芽，消毒过程同其他； 2、​ 操作：在超净工作台上，把已经消毒过的芽放在解剖镜下仔细剥离，直到显出圆滑生长点。 3、​ 培养 一般用MS培养基。（1）培养的茎尖颜色逐渐变绿，体长，基部逐渐增大，有时形成少量愈伤组织；（2）3-4周后，即可看到由叶原基生长形成小叶和明显伸长的茎；（3）将茎尖转入无生长调节物的基本培养基中，继续培养，最后发育成完整小植株。 培养中可能出现的问题及解决方法： 1）​ 若生长过自己，应降低生长素浓度或降低温度； 2）​ 生长太慢的茎尖，应适当调节激素比例。 五、通过愈伤组织培养再生植株去病毒 通过实验发现，感染了TMV的烟草，培养的愈伤组织中只有40%的细胞带有这种病毒，说明愈伤组织中的某些细胞是不带病毒的，可通过愈伤组织培养再生植株的方法，获得无病毒植株。 （1）病毒在植物体内是不均匀的进入愈伤组织； （2）有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征，抗病毒浸染的细胞可能与敏感型细胞一起存在母体组织中。 六、植物脱毒的检测和保存 鉴定病毒的简便方法：1、视觉观察法：观察植物的叶子和茎有无该病毒有的症状。缺点：由于寄主植物的病毒症状要相当长时间才能表现出来，这段时间内无法鉴定是否病毒已去除。 灵敏的测试方法： 1、汁液传染：在供试植物上取下叶片，置于等体积的(w/v)的磷酸缓冲液(0.1mol/L)研磨后待用；用金刚砂轻轻擦破指示植物（对待定病毒极易感染的植物）叶表皮，再用供试植物的液汁涂抹，几分钟后用水浇去残留接种物。 2、叶片嫁接法：取供试植物叶片为接穗叶柄用刀削成楔形，去掉指示植物顶端一小片叶，迅速将接穗小叶嫁接到指示植物上，并用塑料带绑缚结合处，一般4-6月固可鉴定处有无病毒。 3、抗血清反应鉴定法：用已知的病毒的抗血清可以鉴定未知的病毒种类，抗血清鉴定是一种高度专业化型的试剂，特异性高，测定速度快，几小时或几分钟就可完成鉴定，是最有效的病毒鉴定方法。 常用：试管沉淀实验、点滴沉淀实验、凝聚沉淀实验 4、电子显微镜法：在电镜下可观察到病毒颗粒的大小，形成和结构，需要较高的病毒浓度，对不表现可见症状的潜伏病毒，血清和电镜法唯一可行。 5、酶联免疫法 原理：把抗原与抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来，形成一种酶标记的免疫复合物，非常灵敏，能检测出10^5数量级的病毒浓度。可同时检测大量的样品。 七、无毒原种苗的保存 1、隔离种植保存:通常无毒原种要在隔离区域或隔离虫网室内种植保存。 2、离体保存：通过组织培养，大量繁殖，长期保存于试管中。 思考题： 1、茎尖培养的意义； 2、茎尖培养的程序； 3、怎样检测植株有没有病毒？ 第五章 悬浮细胞培养技术 概述 植物细胞培养是植物生物工程的基础，如植物基因工程要在细胞或个体水平上表达；人工种子，要进行同步培养;原生质体融合，近几十年发展起来利用细胞培养技术生产次生代谢物的技术都离不开细胞培养技术，此外在植物遗传、农林、园艺等学科等得到广泛的应用。 细胞培养包括：悬浮细胞培养（cell suspension culture）单细胞培养（single cell culture）。 悬浮细胞培养：是将植物细胞和小细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养。其目的是使细胞能保持较好的分散状态。 具有以下特征：（1）具有较高的分散程度。（2）细胞形态的一致性，大小均一，具有明显的细胞核和致密的细胞质。（3）较低的分化程度（4）有规律性，通常为24~72小时的细胞加倍周期，（5）对外源激素需求一定程度的驯化（6）细胞全能性暂时性消失。 单细胞培养技术：是将植物的单细胞置于特殊的条件下培养，培养的细胞通过分裂形成细胞团，再经细胞分化形成胚状体、或根、茎、叶等器官，最后长成植株。 第一节 植物愈伤组织培养 一、愈伤组织的概念：愈伤组织（（callus)原是指在植物受伤后伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中则是指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。 二、愈伤组织的培养的意义： (1) 愈伤组织培养是一种最常见的培养形式，除茎尖分生组织和一部分器官培养以外，其他几种植物组织培养形式最终都要经历愈伤组织才能形成再生植株． (2)愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源． (3) 由外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始． 三、愈伤组织形成 植物细胞可以摆脱原来的遗传控制和生理制约，在一定条件下，发生回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程，即脱分化过程． 植物细胞的全能性，可以脱分化之后再次分化为完整的植株（即再分化）。 脱分化后的细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织．几乎所有高等植物的各种器官离体后都可以脱分化形成愈伤组织。 四、愈伤组织的类型（由异质细胞集合而成） 松脆愈伤组织、致密愈伤组织、有胚性无胚性、优良的愈伤组织 特点：高度的胚性或再分化能力、容易散碎，易于建立优良的悬浮系、旺盛的自我增殖能力，扩大规模、胚性的保持力强，可以长期保持易于遗传操作。 五、愈伤组织形成历程 诱导期(induction stage): 通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使接种的外植体的合成代谢加强，迅速积累蛋白质和核酸． 此期间细胞体积变化不大。诱导期长短与种类、生理状态和外部因素有关。如菊芋只需要一天诱导时间 分裂期(division stage)，顾名思义是指经诱导后，外植体开始迅速分裂，结构疏松，个体小，缺少组织结构，生理生化都发生变化． 形成期(formation stage)，是指经诱导、分裂后，形成了无序结构愈伤组织的时期．即由有序化的过程，化不同为均一的过程． 这个时期愈伤组织特点的有： （1）大而不规则，高度液泡化，组织较为松散。 （2）表面以下约5~10个细胞是细胞生长中 心，这些区域是愈伤组织的愈伤组织生长 的中心部位 分化期(diffrentiation stage)：是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。 分化期愈伤组织主要表现在有： （1）细胞分裂部位和方向发生改变，表层细胞分裂减慢，进入组织内部细胞的分裂。 （2）分化组织瘤状结构和微管组织形成。 （3）细胞体积不再减小 （4）出现各种类型的细胞 （5）生长的愈伤组织一般呈黄色或白色、绿色 或浅绿色。 六、愈伤组织的继代培养： 一般将愈伤组织长到2-3cm2 时将其分离，切成4-8块继续培养。生长迅速的愈伤组织多呈浅色、质地松软。若是愈伤组织分化再生须选择生长慢的愈伤组织。 继代周期：一般4~6周，或3~4周。若继代周期长，愈伤组织会出现褐化。如银杏需在18天内继代一次。 发生部位：愈伤组织生长只发生在不与琼脂接触的部位，接触部位上、极少有增殖。因而会使愈伤组织小块变成不规则馒头状的组织快。 七、愈伤组织培养条件与定向培养 愈伤组织培养条件： 1外植体 （1）基因型对愈伤组织器官分化有决定性的作用。 （2）通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织差别均不大。但油菜的花器官较叶、根易于分化成苗 （3）幼嫩的外植体易于诱导愈伤组织也易于分化成植株。 2培养基 （1）生长调节剂的影响最大。2，4-D 是最有效的愈伤组织诱导剂。浓度一般在0.1~10mg/L，生长素/分裂素型的比例决定愈伤组织器官的分化 （２）无机盐 （３）有机物 （４）培养基的物理性质：固态、液态，ＰＨ等 3培养条件：光照、温度２２～２５度 不同用途愈伤组织的定向诱导 愈伤组织生长类型： （1）生长素型，愈伤组织较为松脆，生长在旺盛是进行悬浮培养最适合的材料。 （2) 生长素/分裂素型 （3) 细胞分裂素型，愈伤组织较为坚硬。坚硬的愈伤组织细胞间被果胶质紧紧粘着，生长慢，不能形成很好的悬浮系统。，但易分化苗。 控制愈伤组织定向转变的因子主要是激素和氮源。 还原态氮促进分裂作用。硝态氮抑制分裂。 八、愈伤组织生长规律: 继代后在3-7天内即可恢复生长 2~3周内愈伤组织处于旺盛时期 生长达到顶峰并随之缓慢下来（愈伤组织块达到最大体积。） 即慢 快 慢 继代培养的最合适时间：是在愈伤组织生长快达到最大体积的时间.即在愈伤组织生长即将达到顶峰之前， 九、愈伤组织形态发生方式 １、器官发生发生： （１）愈伤组织形成无根的芽或无芽的根 （２）先形成芽再在芽基部生根，较为普遍 （３）先形成根再分化芽，较为困难。 （４）先在愈伤组织临近不同部位分别形成芽和根，再形成植株。 ２、体胚发生: 第二节 悬浮培养体系的建立及培养 一、悬浮细胞的特点 1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 3、悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。 二、起始悬浮液的制备 三、悬浮细胞生长曲线 呈S型生长曲线。 （1）延迟期（lag phase）:细胞分裂少，维持1-2d. （2）对数生长期（exponential growth）:细胞数目上迅速增长； (３)直线生长期（linear growth phase): (4) 缓慢期（滞缓期）(decdlerational phase)：增殖缓慢。 (5)静止期（stationary phase）:细胞增长完全停止. 延迟期的特点：其长短与继代时细胞生长状态和转入的细胞数量有关。细胞数少，延迟期长，密度低，细胞很难生长。 继代的方法和最佳时期 继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 最佳继代时期：若缩短继代时间的间隔，每个2-3d 继代一次，则可使悬浮培养细胞一直保持对数生长。处于静止期的细胞进行继代，细胞会大量死亡和解体。 一般选择对数生长期和直线生长期的细胞进行继代。 四、影响悬浮细胞培养的因素 1. 起始愈伤组织的接种量： 是影响悬浮培养建立质量的第二个主要因素，如烟草中愈伤组织的接种量 为100ml 2~3 g 湿重。 2. 愈伤组织的疏松度（friability ）是建立悬浮细胞培养的关键条件（激素调控） 3. 培养基的成分一般用MS或B5、ER(无机盐较高），然后稍加改变无机及有机成分。低浓度的氮刺激细胞分裂形成小细胞，高氮利于细胞生长。其他成分： 4. 细胞起始密度：起始密度，一般在0.5~2.5×105 细胞/ml ，在培养过程中可增加到1~4×106， 18~25d平均每个细胞分裂4~6次，。 5.培养基的振荡频率：使单细胞或细胞团分散，有利于气体交换。转速一般为60-150r/min.起初机械振荡至少达到100~120转/分，悬浮培养建立后速度可以适当降低。 6.继代周期：一般20d左右。 五 、悬浮细胞的同步培养 细胞同步培养（synchronousdivision）：使细胞分裂的同步化。有物理方法和化学法。 物理方法 （1）体积选择法：根据聚集体大小选择，萝卜体细胞胚同步化达到90%. （2）冷处理法：低温刺激提高同步化程度。 化学方法 （1）饥饿方法 ：培养基中林和糖类物质饥饿可阻止G1期和G2期。重新加入成分可获得同步培养 （2）抑制方法：一些DNA合成的抑制剂，如5-氨基尿嘧啶，或胸苷嘧啶核苷酸抑制处理后 ，使细胞同时处于G1期和 S 期 （3）有丝分裂阻抑：加入秋水仙碱组织细胞停留在中期。 六、 悬浮细胞的生长测定 （1）细胞计数 :计数前需将细胞团中的细胞游离出来。可用5%的三氧化铬20℃下离析6h。 血球计数板的用法： 深度0.1mm,共有25格，每个大格有16个小格，每个区域400个小格，每个小格的面积为1/400mm2 .每次计25个大格中的细胞数。也可计算4个角上的大格数，加中央大格内的细胞数计算：细胞数/ml=5个大格内细胞总数х5 х10000х稀释倍数 （2）细胞密度体积（packed cell volume,PCV）:将一定量的细胞悬浮液放入15ml刻度离心管中，于2000 хg离心5min,以每毫升培养液中细胞总体积的ml 数表示。 （3）细胞鲜重：抽滤去粘着的多余水分，称重。 （4）细胞干重：烘干重（60℃ ） （5）活细胞率的测定：活细胞的百分率可作为细胞悬浮培养时的起始密度的参考。 方法： 0.1%酚藏红花水溶液，丙酮配制二醋酸酯荧光素母液 。活细胞不染色具荧光，死细胞染色不具荧光。 （6）有丝分裂指数：处于有丝分裂的细胞数占总细胞数的百分数。一般为3~5% 荧光素双醋酸酯法（ FDA）法的原理 ​ FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 ​ 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 ​ 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 ​ 荧光素在死细胞中不能积累。 ​ 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。 第三节、植物细胞大规模培养 一、分类：分为分批培养和连续培养 1.分批培养/成批培养（Batch culture） 含义：将愈伤组织培养分散在一定容积的密闭容器中进行培养。一般为100~250ml 的三角瓶，每瓶咱上能够右20-75ml培养基。在培养期间,系统内的培养物既不能添加也不能放出。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 分批培养的特点：在密闭的容器中，培养基体积固定。培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线。必须适当搅拌。当营养物质耗尽时，细胞的分裂即停止，需进行继代。 分/成批培养容器种类：成批培养容器种类很多,如单硫酸瓶培养系统,双硫酸瓶培养系统,旋转烧瓶培养系统、三角瓶等等. 微生物发酵罐进行植物悬浮细胞大规模培养,发酵罐的型号多种多样,体积有大有小,从几十升到上万升 。 2 半连续培养：半连续培养是一种定时进出装置的开放型的成批培养系统.每天或每2d时间收获一部分培养物,然后再加入新鲜培养基,并保持培养细胞数量的恒定.特点：这种培养系统可在较长的时间内使培养细胞处于对数期生长. 3​  连续培养 ：连续培养,包括封闭式和开放式两种培养类型 (1)封闭式连续培养：是使培养细胞保持在一个反应器中,在培养过程中不取出培