海藻酸钠固定化果胶酶的研究

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2010年 第 35卷 第 4期 果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总 称[1]。果胶酶是果品加工中重要的酶制剂之一。随 着我国食品工业的迅速发展，对果胶酶的需求量 日益增大，而目前果胶酶多为一次性使用。酶固 定化是酶工程的新技术。固定化酶的最大特点是 可以重复多次使用和回收，能够减少酶的使用量， 便于产物的分离纯化及连续操作，因而可大大降 低生产成本。关于果胶酶的固定化，已有不少研 究和报导 [2-8]，虽然比游离果胶酶在耐 pH 值稳 定性、热稳定性和贮存稳定性等方面均有较大提 高，但仍存在酶回收率不高，酶活力降低等问题， 从而制约了固定化果胶酶在食品工业生产中应用。 载体的性能和固定化 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对于酶的固定化至 关重要。作为酶固定化载体材料要有良好的机械 强度、良好的热稳定性和化学稳定性、良好的抗 微生物特性及酶的结合能力、价廉易得等。海藻 酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖， 它是由 β-(1,4)D-甘露糖醛酸和 α-(1,4)L-古罗糖 醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由 的羧基和羟基，可溶于不同温度的水中，溶于乙 醇、乙醚及其他有机溶剂。海藻酸钠可生物降解， 生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性较 好，是最常用的囊材与载体材料，也常用作固定 化酶的载体[9]。近年以海藻酸钠为载体固定化酶的 Study on immobilization of pectinase on alginate LI Hong-yu, LI Chong-xian, LI Zu-ming (Normal College of Beijing Union University, Beijing 100011) Abstract: In this experiment, taking alginate as the carrier, pectinase was immobilized through crosslinking- absorption method. The influence of main immobilization elements put on the activity of immobilized enzyme was tested, and the fixed conditions was optimized through single -element experiment and orthogonal experiment. The results indicates that, under the density conditions of 2% alginate, 1% calcium chloride and 3% glutaric dialdehyde, the highest activity of immobilized pectinase is found, whose reclaimed rate reaches to 84.4%, with 0.2 mg/mL enzyme density, 3.0 pH, 40 ℃ temperature and the fixed 45 minutes. Key words: pectinase; immobility; alginate 李鸿玉， 厉重先， 李祖明 (北京联合大学师范学院，北京 100011) 摘要： 以海藻酸钠为载体，采用交联吸附法固定果胶酶。通过单因素实验和正交实验考察固定 化主要因素对固定化酶活力的影响，优化固定条件。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，在海藻酸钠浓度为 2%、氯化钙 为 1%、戊二醛浓度为 3%的条件下，采用酶浓度为 0.2 mg/mL、pH值 3.0、温度为 40 ℃、固定 时间为 45 min。固定化果胶酶活力最高，酶活回收率达到 84.4%。 关键词： 果胶酶；固定化；海藻酸钠 中图分类号： TS 201.2+5 文献标志码： A 文章编号： 1005-9989(2010)04-0021-04 海藻酸钠固定化果胶酶的研究 收稿日期： 2009-11-30 基金项目： 北京市教育委员会科技计划面上项目(KM200911417015)。 作者简介： 李鸿玉(1956—)，女，副教授，研究方向为食品化学与应用酶学。 生物工程 ·21· FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2010年 第 35卷 第 4期 研究屡有报道[9-11]，但作为果胶酶固定化载体的研 究很少。本文以海藻酸钠作为载体材料，采用交 联-吸附法固定果胶酶，研究并优化果胶酶固定化 的条件。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂 果胶酶：PC-3 天津市利华酶制剂技术有限公 司；果胶：G5325 厦门兴隆达化学试剂有限公司； 海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；Fe3O4： 自制。 半乳糖醛酸、戊二醛、醋酸、醋酸钠、3,5-二 硝基水杨酸 (DNS)、甲醛、苯酚、氢氧化钠、氨 水、柠檬酸、柠檬酸三钠、亚硫酸钠、酒石酸钾 钠、氯化钙：均为分析纯级。 1.2 主要仪器与设备 离心机 (LX3-64-01 型 )，恒温水浴振荡器 (SHY-2A 型)，分光光度计 (722 型)，烘箱 (DS- 206电热鼓风干烘箱)，pH计 (PHS-25 型)，真空 干燥箱 (ZD79-A )，磁力加热搅拌器 (CJJ78-1)。 1.3 方法 1.3.1 主要试剂配制 1.3.1.1 1%果胶底物 精确称取果胶粉 1 g，用一 定 pH的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，充分搅拌 并定容至 100 mL，4 ℃冰箱冷藏。 1.3.1.2 果胶酶溶液 精确称取果胶酶 1 g，用一 定 pH值的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解并定容至 100 mL，得 10 mg/mL果胶酶溶液。 1.3.1.3 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 取柠檬酸 21.01 g， 用水溶解并定容至 1000 mL。取柠檬酸钠 29.41 g， 用水溶解并定容至 1000 mL。取一定量上述两种溶 液，混匀，用 pH计测定其 pH值，得所需 pH值 缓冲溶液。 1.3.1.4 DNS试剂 将 6.3000 g 3,5-二硝基水杨酸 和 262 mL 2.0 mol/L NaOH 溶液，加到 500 mL 含 有 182.0 g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5.0 g 苯酚、5.0 g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加 蒸馏水定容至 1000 mL，保存于棕色瓶，置冰箱备 用(放置 72 h后使用)。 1.3.2 海藻酸钠微球载体的制备 配制浓度为 2% 海藻酸钠水溶液，用注射器注入到 1% CaCl2水溶 液中，得到颗粒均匀、形状规整的海藻酸钠小球， 水洗至中性，丙酮洗涤，50 ℃真空干燥。取干燥 的海藻酸钠小球加入 3%的戊二醛溶液，使之浸 没，并于 30 ℃振荡 2 h，用水和丙酮反复洗涤， 50 ℃真空干燥，得到交联的海藻酸钠微球。 1.3.3 固定化果胶酶的基本方法 取 0.5 g的交联 好的海藻酸钠微球，加入 0.75 mL 浓度为 10 mg/ mL 的酶液，用一定 pH 的缓冲液定容 25 mL (体系酶浓度为 0.30 mg/mL)。 40 ℃下振荡 45 min，用少量蒸馏水洗掉未固定上的酶，置于 0~ 4℃冰箱保存。 1.3.4 酶活力的测定 1.3.4.1 3, 5-二硝基水杨酸比色法 于甲、乙两支 25 mL 比色管中分别加入 1%果胶底物 5 mL，40 ℃水浴中预热 5 min；向甲、乙管中分别加 pH为 3 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 4 mL，向甲管加入 1 mL稀释酶液，立即摇匀，在 40 ℃水浴中准确 反应 30 min，再向乙管中加 1 mL 稀释酶液并立 即置沸水浴中煮沸 5 min，终止反应，冷却；分 别取甲、乙管中反应液 2 mL 于 2 支 25 mL 比色 管中，再各加 2 mL 蒸馏水、5 mL DNS试剂，混 匀，沸水浴 5 min，取出，立即冷却。加蒸馏水定 容至 25 mL。以 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 空白为基准调零，540 nm 处 测吸光度。 固定化果胶酶酶活测定方法是将方法中的 1 mL稀释酶液替换为相应量的固定化果胶酶。 以每毫升酶液 1 h产生 1 mg半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位计算酶活力： 酶活(mg/h·mL)= (A甲-A 乙) ×Dr×5K×t 式中：A 甲为酶样吸光度； A 乙为酶空白吸光度； K为标准曲线的斜率； 5为测定酶活时取了反应液的 1/5； Dr为稀释倍数； t为反应时间，h。 1.3.4.2 半乳糖醛酸标准曲线的绘制 分别取浓度 为 1.0000 g/L 半乳糖醛酸标准溶液 0、0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，用蒸馏水补至 5 mL，加 5 mL DNS，沸水浴 5 min，冷却后，用蒸 馏水定容至 25.0 mL，以空白为参比调零，用分光 光度计在 540 nm波长下测吸光度。 1.3.5 酶活回收率的计算 酶活回收率(%)=固定化果胶酶的活力 游离果胶酶的活力 ×100 2 结果与分析 2.1 半乳糖醛酸标准曲线 生物工程 ·22· FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2010年 第 35卷 第 4期 按 1.3.4.2方法，由测得数据作半乳糖醛酸标 准曲线，见图 1。标准曲线回归方程为 Y = 0.5379X-0.1086；相关系数 R2=0.9985。 2.2 游离果胶酶活力测定结果 根据 1.3.4 方法测定果胶酶活力为 57613 mg/ h·mL。 2.3 海藻酸钠固定化果胶酶条件的优选 2.3.1 对酶固定化过程中 pH因素的考察 实验分 为 5组，按 1.3.3方法固定化果胶酶时，改变体系 pH值，即各组定容所用缓冲溶液的 pH值分别为 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5。按 1.3.4 方法测定酶活 力，结果见图 2。 图 2表明， pH在 2.5~3.0范围时，固定化果 胶酶活力随着 pH 的增加而增大；pH 为 3.0 条件 下的固定化果胶酶活力最高，为 34769 mg/h·mL， 酶活回收率为 60.3%。pH大于 3.0时，酶活随 pH 增大急剧下降。可见，pH是果胶酶固定化的一个 重要影响因素，体系 pH在 3.0为宜。 2.3.2 对酶固定化时间因素的考察 实验分为 6 组，按 1.3.3方法，体系 pH为 3.0，温度为 40 ℃ 的条件下固定果胶酶，各组固定时间分别为 15、 30、45、60、75、90 min。按 1.3.4方法测定固定 酶活力，结果见图 3。 结果显示，固定时间对固定化酶的活力的影 响较大。固定化时间在 15~45 min时，固定化酶活 力随固定时间的增加明显增大；固定化时间为 45min 时，固定化果胶酶的活力最高，为 38842 mg/h·mL，酶活回收率为 67.4%。当固定时间大于 45 min时，酶活力随固定时间的增加呈下降趋势。 可见，固定时间太长或太短，都会使固定化酶回 收率下降。该实验条件下最佳固定时间为 45 min。 2.3.3 对固定化过程中酶浓度因素的考察 实验 分为 6 组，按 1.3.3 方法，pH 为 3.0，温度为 40 ℃，固定时间为 45 min，改变各组固定化体系酶 的浓度固定化果胶酶，各组的 10 mg/mL酶液加量 分别为 0.125、 0.25、 0.375、 0.50、 0.625、 0.75 mL，对应体系酶浓度分别为 0.05、0.25、0.15、 0.20、0.25、0.30 mg/mL 固定化果胶酶。按 1.3.4 方法测酶活力，结果见图 4。 结果显示，体系酶浓度在 0.05~0.2 mg/mL 范 围内，固定化酶活力随着酶浓度的增加而增大； 酶浓度大于 0.2 mg/mL时，酶活力逐渐下降；酶浓 度为 0.2 mg/mL时，固定化酶的活力最高为 47035 mg/h·mL，酶活回收率为 81.6%。由此可见固定化 体系酶浓度在 0.2 mg/mL为宜。 酶浓度过高或过低都会导致酶活下降。这是 因为戊二醛交联后的海藻酸钠载体上活性基团的 数目是一定的。活性基团未被酶饱和之前，固定 化酶活性随酶浓度的增加而增加；当活性基团结 合了相当多的酶分子后，再增加酶浓度，酶反应 所需的空间受阻，酶活力受到影响。 图 1 半乳糖醛酸标准曲线 半乳糖醛酸/mg 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 吸 光 度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 图 3 固定时间对固定化果胶酶活力的影响 45000 40000 35000 30000 25000 20000 酶 活 /(m g/ h· m L) 固定时时间/min 0 20 40 60 80 100 酶 活 /(m g/ h· m L) 图 4 酶加量对固定化果胶酶酶活的影响 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 酶浓度(mg/mL) 图 2 pH因素对固定化果胶酶活力的影响 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 pH值 酶 活 /(m g/ h· m L) 生物工程 ·23· FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2010年 第 35卷 第 4期 2.3.4 海藻酸钠固定化果胶酶的正交实验 对以 海藻酸钠为载体固定化果胶酶过程中的酶浓度、 pH值、固定温度 3个主要因素，按表 1设定的水 平作正交实验。按 1.3.3 方法，固定时间为 45 min，制备固定化果胶酶。按 1.3.4方法测酶活力， 结果见表 2。 正交实验结果显示，对于所考察的 3个因素， 最佳实验条件是 A2、B2、C3，即酶浓度 0.2 mg/mL、 pH值为 3.0、固定温度为 40 ℃，该条件下酶活力 为 48615 mg/h·mL，酶活回收率达 84.4%。极差分 析表明，3 个因素对固定化的影响显著性依次为 pH值＞酶浓度＞固定温度。 3 结论 以海藻酸钠为载体，采用交联吸附法固定化 果胶酶。实验结果显示，固定化酶的活力受到体 系 pH、固定时间、固定温度、酶浓度等多个条件 因素的影响。在以 2%浓度海藻酸钠制备小球，并 以 3%戊二醛交联处理后的载体，固定化果胶酶的 较优条件是 pH为 3.0、固定时间 45 min、酶浓度 为 0.2 mg/mL、固定温度为 40 ℃，固定化酶的酶 活力为 48615 mg/h·mL，酶活回收率达到 84.4%。 3个主要因素对固定化的影响程度大小依次为 pH 值、酶浓度、固定温度。 参考文献： [1] 薛长湖.果胶及果胶酶研究进展[J].食品与生物技术学报, 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