DNA分子标记技术

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net DNA 分子标记技术1) 刘　明　王继华　王同昌 (哈尔滨师范大学 ,哈尔滨 ,150080) 　　摘 　要 　综述了不同类型的 DNA 分子标记技术 ,对各技术的优、缺点及其应用进行了详细的介绍 ,并对发展 趋势进行了展望。 关键词 　DNA ;分子标记 分类号 　Q75 DNA Molecular Markers/ Liu Ming , Wang Jihua , Wang Tongchang ( Harbin Normal University , Harbin 150080 , P. R. Chi2 na) / / Journal of Northeast Forestry University. - 2003 , 31 (6) . - 65～67 Several kinds of DNA molecular markers are reviewed in this paper , including RFLP , AFLP , SNPs , etc. Their merits and demerits as well as applications and perspective are also discussed. Key words 　DNA ; Molecular markers 　　DNA 分子标记 (DNA molecular marker) 是指可遗传并可检 测的 DNA 序列 ,以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础 , 是 DNA 水平遗传变异的直接反映。DNA 分子标记的检测不 受组织特异性、发育阶段等影响 ,并具有数量大、多态性高、遗 传稳定等优势 ,因此在遗传育种、基因定位、基因克隆等方面 应用广泛。 1 　几种重要的、常用的 DNA 分子标记技术 1. 1 　限制性片断长度多态性 ( restriction fragment length poly2 morphism , RFLP) 1980 年 ,Botstein 等首先提出用 RFLP 构建遗传连锁图[1 ] , 其基本技术原理是基于 DNA 序列的变化引起酶切位点的改 变 ,从而使两个酶切位点间的 DNA 片段长度发生变化。这种 变化经酶切、杂交及放射自显影显示出不同的条带 ,据此对所 比较样本进行多态性分析。其基本操作步骤为 : ①DNA 提取 ; ②限制性内切酶酶切 ; ③电泳分离酶切片段 ; ④转膜 ; ⑤探针标 记 ; ⑥杂交 ; ⑦放射自显影。RFLP 作为分子标记有其独特优 势。第一 ,RFLP标记的等位基因是共显性的 ,对选择隐性基因 极为有利 ;第二 ,RFLP 标记反映基因型差异 ,无表型效应 ;第 三 ,RFLP标记之间相互独立 ,互不干扰。RFLP 在构建基因组 连锁图谱上有重要应用作用。目前较为完善的遗传连锁图谱 大多来自 RFLP分子标记 ,尤其在构建高密度遗传连锁图方面 , RFLP有独特的优越性。此外 ,在亲缘关系鉴定、品种鉴定等方 面 ,RFLP也有广泛应用。但是 ,多数 RFLP位点信息含量较低 ,且 费用昂贵 ,操作复杂 ,不适用于分析样本量较大的群体。 1.2 　随机扩增多态性 ( random amplified polymorphism DNA , RAPD) 1990 年 ,Williams 等和 Welsh 等 [2 ,3 ]共同提出一种新的分 子标记技术 ———RAPD ,它以 PCR 技术为基础 ,以短核苷酸为 引物 ,以 DNA 为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 合成多态性 DNA 片段。RAPD 技术的 1) 黑龙江省科技厅攻关项目 ( GA01B101 - 15) ,黑龙江省自然科 学基金项目 (C00 - 07) 。 第一作者简介 :刘明 ,女 ,1978 年 7 月生 ,哈尔滨师范大学生命科 学与环境学院 ,在读硕士研究生。 收稿日期 :2003 年 9 月 18 日。 责任编辑 :戴芳天。 基本原理是采用合成的单个或成对的随机引物 (约 8～10 个 碱基)对基因组 DNA 进行扩增。模板经变性后 ,在较低温度 下与随机引物形成互补双链结构。如果互补链上相邻两结合 位点间距离在可扩增范围之内 ,则可得到扩增产物。样本间 多态性的产生有以下两种原因 :一是引物结合位点的 DNA 序 列发生变异导致特定扩增条带的出现或消失 ;二是引物结合 位点间发生片段插入或缺失 ,致使扩增产物长度变化或产物 的出现或消失。RAPD 技术具有如下优点 :第一 ,技术简单 , 操作简便 ,检测速度快 ;第二 ,引物序列通用性强 ,无需根据物 种特异性分别设计引物 ;第三 ,成本较低 ,且所需 DNA 样本量 较少。与 RFLP相比 ,RAPD 技术在遗传作图中的应用相对较 晚。在已建立高密度 RFLP 图谱的物种中 , RAPD 可进行补 充。在 RFLP图谱尚不完善的物种中 ,RAPD 技术可进行更为 有效的连锁图谱建立。RAPD 技术的缺点主要在于它是一个 显性标记 ,不能鉴别杂合子和纯合子。此外 ,共迁移及重复性 差的问题也限制了 RAPD 技术的应用 [4 ] 。 1. 3 　特征性片段扩增区域 ( Sequence - characterized amplified regions , SCAR) 针对 RAPD 标记的缺点 ,为提高其在应用中的稳定性 ,可 以将该 RAPD 片段测序 ,根据序列设计特异引物 (约 20 bp 左 右) ,或者对该 RAPD 片段进行末端测序 ,在原 RAPD 所用引 物基础上相应增加约 14 bp ,成为与原来的 RAPD 片段末段互 补的特异性引物。以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增 ,得到 与原来的 RAPD 片段相同的特异条带 ,即 RARD 标记转化为 SCAR 标记。SCAR 标记一般为显性 ,有时也表现为共显性标 记。与 RAPD 标记相比 ,SCAR 具备以下优点[5～7 ] :第一 ,反应 条件严格 ,结果稳定 ,重复性好 ;第二 ,SCAR 标记比 RAPD 标 记信息量大 ;第三 ,易于基因的克隆。因此 ,SCAR 标记克服了 RAPD 标记的缺陷 ,为基因定位与克隆、遗传图谱构建 ,奠定 了试验基础[8 ] 。应用 SCAR 技术已经标记到莴苣抗双霉病基 因[6 ] 、番茄抗线虫基因[9 ] 、豆 Ⅰ基因[19 ]油菜的细胞质雄性不 育育性恢复基因[7 ]等。此外 ,SCAR 分子标记在分子育种方面 也有重要应用[11 ] 。 1. 4 　扩增片段长度多态性 (Amplified fragment length polymor2 phism , AFLP) 荷兰科学家 Zabeau 和 Vos 于 1993 年建立起 AFLP 技术用 于检测 DNA 多态性。AFLP技术的基本原理是以限制性内切 　　第 31 卷 第 6 期 东 　北 　林 　业 　大 　学 　学 　报 Vol. 31 No. 62003 年 11 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Nov. 2003 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 酶切割基因组 DNA ,使切割片段与人工接头相连接 ,在与人 工接头互补的一段核苷酸序列 3’端附加 2～3 个选择性碱基 作为引物 ,进行 PCR 扩增 ,扩增片段经聚丙烯酰胺电泳分离 检测得到样本间差异。对于不同样本的基因组 ,可选择不同 数目及不同 GC 含量的选择性碱基以调整 AFLP 产物条带的 特异性和数量。此外 ,在酶切操作中选取两种基因组中酶切 位点数不同的酶以得到长度适宜的酶切片段。AFLP 技术融 合了 RAPD 与 RFLP两种技术的优越性 ,同时克服了二者各自 的缺点 :与 RAPD 相比 ,其假阳性率大大降低 ,具有较好的重 复性 ;较之 RFLP技术 ,AFLP 的操作则更为简单。因此 ,AFLP 已经成为构建高密度连锁图谱、基因定位、分子育种、基因组 多样性检测等领域的主要分子标记。AFLP 技术的不足主要 表现在 :对基因组 DNA 质量要求较高 ,操作成本也相对较高 , 且所得到的分子标记多为显性标记 [12 ] 。 2 　几种新兴 DNA 分子标记技术 2. 1 　DNA 指纹技术 (DNA finger printing) 1985 年 Jeffreys[13 ]建立了 DNA 指纹图谱检测方法。它依 据真核生物基因组中大量散布的小卫星和微卫星位点制备探 针 ,与酶切后的基因组 DNA 杂交获得特异性的指纹图谱。因 此 ,DNA 指纹技术实际上是一种特殊类型的 RFLP。基因组中 的小卫星由短的核心序列 (通常为十几到几十 bp) 重复串联 而成 ,长度从几十到几千 bp 不等。一个小卫星中的核心序列 拷贝数高度可变 ,具有丰富的限制性片段长度多态性 ,推测是 由于细胞分裂过程中同源小卫星间不等交换等原因造成。微 卫星的串联重复单位比小卫星更短 ,一般为 1～6 bp ,也具有 限制性片段长度多态性。由于这种多态性的存在 ,致使不同 样本的基因组 DNA 经酶切电泳和 Southern 杂交之后 ,得到高 度多态性的条带图谱。这些图谱具有高度的个体或基因型特 异性 ,能提供可靠的遗传标记。DNA 指纹技术具有以下优 点 :第一 ,DNA 指纹大多数是独立遗传的 ,因此 ,一个 DNA 指 纹图谱可同时检测到多个位点的变异 ;第二 ,DNA 指纹图谱 具有高度的个体和群体特异性 ;第三 ,遵循简单的孟德尔方式 遗传。该技术的缺点是涉及到共迁移 ,不利于分析 ,不同个体 间操作要求保持高度一致 ,且所需 DNA 量较大。该技术最主 要应用于法医学鉴定。 2. 2 　简单重复序列 (Simple sequence repeats , SSR) 简单重复序列即微卫星 ,是由 Zietkiewicz[14 ] 等建立的一 种分子标记技术。它同样依赖于基因组中存在的大量的微卫 星序列。与 DNA 指纹技术不同的是 ,SSR 是以 PCR 技术为基 础的。SSR 操作的基本步骤是 : ①从基因组文库中筛选含微 卫星序列的阳性克隆 ,或通过检索数据库获得已知微卫星序 列 ; ②根据微卫星两侧序列在同一物种中的高度保守性设计 引物 ; ③PCR 扩增及电泳检测扩增产物。SSR 扩增产物长度 较短 ,一般在 100～300 bp ,为提高电泳分辨率 ,通常使用聚丙 烯酰胺凝胶电泳。SSR 技术具有其自身独特的优点 :第一 ,微 卫星标记在基因组中分布广泛 ,揭示的多态性十分丰富 ;第 二 ,每一个微卫星位点具有多种等位形式 ;第三 ,微卫星标记 是共显性的 ,并按照孟德尔方式分离 ;第四 ,SSR 操作简单 ,重 复性好 ,且对样本 DNA 的质与量要求均不高。因此 ,在群体 遗传多样性等研究中 ,SSR 技术发挥了重要作用。目前已在 多种植物中建立了 SSR 遗传图谱。但该技术所面临的问题 是 ,需对样本基因组中的微卫星位点进行克隆测序分析 ,已知 的微卫星引物序列并未完全公布 ,因此操作成本可能较高。 此外 ,在 SSR 技术的基础上发展起来一种以扩增 SSR 之间 DNA 片段的新兴的分子标记技术 —ISSR ( Inter simple sequence repeats) ,同样具有孟德尔式遗传、稳定性多态性良好等特点 , 但常为显性标记[15 ] 。 2. 3 　单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism , SNPs) 单核苷酸多态性是指基因组 DNA 中某一特定核苷酸位 置上发生变化引起的多态性 ,比微卫星标记密度更高 [16 ,17 ] 。 SNPs在基因或基因组中分布不均 ,表现为非转录区多于转录 区 ,转录区中同义突变多于非同义突变 ,推测为选择性压力造 成。对 SNPs 的研究根据对象不同可分为两大类。第一类 ,研 究已知 SNPs 在特定群体中的分布以确定其与特定遗传性状 的联系。第二类 ,寻找与特定表型相关联的未知 SNPs。对 SNPs 可通过如下途径进行检测 : ①从现有数据库中筛选 DNA 序列 ,应用生物信息学工具比较分析获取 SNPs[18 ] ; ②根据 SNPs 可以改变 DNA 分子构像的特点 ,通过电泳或色谱技术来 检测 SNPs[19 ] ; ③通过对样本 DNA 直接测序检测 SNPs[20 ] ; ④ 以如前所述的 DNA 分子标记技术 ,如 :RFLP ,RAPD 等 ,也可以 检验到 SNPs ; ⑤近几年发展起来的基因芯片技术在 SNPs 检测 中的应用极大地提高了操作的自动化程度及效率 [21 ] 。作为 分子标记 ,SNPs 具有以下优点 :第一 , SNPs 是二等位基因性 的 ,便于自动化分析 ;第二 ,分布广泛 ,高度稳定 ;第三 ,SNPs 是一种共显性标记。因此 ,可以预见 ,在复杂疾病分析、疾病 基因精确定位及药物基因组学等方面 ,该技术有着广泛的应 用前景。 3 　结语 人类基因组计划的完成大大地加快了生物学研究的速 度 ,对于 DNA 分子标记技术也提出了更高的要求。单一的分 子标记应用已经不能满足需要 ,分子标记的应用技术将向更 大规模、更多位点的方向发展。同时 ,基因芯片、蛋白质组学 及生物信息学等新学科、新技术的兴起及与 DNA 分子标记的 研究相互交叉、融合为分子标记技术带来了新的发展。可以 预见 ,在后基因组时代 ,DNA 分子标记技术将发挥更大的作 用。 参 　考 　文 　献 1 　Botstein D , White R L , Skolnick M , et al . 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