[下载]申报国家自然科学基金项目申请书样板

申报国家自然科学基金项目申请书样板 各位申请人： 各位申请人： 院科教部从我院申报国家自然科学基金项目中挑选了一份严格 按照报告正文撰写提纲要求撰写， 按照报告正文撰写提纲要求撰写，并在撰写的整体布局、 并在撰写的整体布局、写作方法上 比较适宜的申请书作为样板申请书， 提供给其他申请人在撰写申请书 比较适宜的申请书作为样板申请书， 时参考。 时参考。 注：考虑到本项目也将申请国家自然科学基金， 考虑到本项目也将申请国家自然科学基金，从技术保密方 面考虑， 面考虑，涉及核心技术和关键问题之处将以“ 涉及核心技术和关键问题之处将以“XXXXXXX”代替。 代替。 报告正文 （一）立项依据与研究内容 1立项依据 肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方 法。目前国内外绝大多数学者认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC） 激活是肝纤维化的关键，抑制HSC的激活对肝纤维化的防治有重要价值[1]。 粉防己碱（ tetrandrine ，又名汉防己甲素）是中药粉防己（ Stephania tetrandra S Moore）的主要有效生物碱成分，具有广泛的药理作用。抗肝纤 维化是 Tet 的重要应用领域之一。我们研究室在过去的十几年中，对 Tet 抗 肝纤维化作用及机制进行了系统研究，证实 Tet 是抗肝纤维化有效药物。然 而，由于 Tet 的剂量安全范围较小，以往研究发现的抗肝纤维化有效剂量与 中毒剂量比较接近，故成为限制其临床应用的重要因素。近年国内 Tet 抗肝 纤维化研究也由此逐渐走向低谷。 为减少毒副反应， 拓展该药物的临床应用， 我们近四年从降低 Tet 的单药剂量、联合用药及改造药物毒性基团等方面进 行实验性探索。新近，我们在国内外首次发现，低浓度 Tet 能上调转化生长 因子 β（transforming growth factor factor β，TGF-β）抑制性信号分子 Smad 7 表达，调控 TGF-β-Smad 信号通路，抑制体外培养静止期 HSC 活化，阻断 TGF-β1 促静止期 HSC 活化效应，Tet 还诱导活化 HSC 活化逆转。部分最新 研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的 SCI 索引源期刊上，并 被 SCI 收录(收录号 IDS Number: 963XN )[2]（相关文章参详见申请人简历及 附件二、三） 。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信 心。 TGF-β1 是目前认识的最重要的促肝纤维化因子。 抑制 TGF-β1 对 HSC 的 作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点[3]。Smad 7 是 HSC TGF-β 信号通 路的最主要负反馈调节信号分子， 上调 Smad 7 是抑制 TGF-β 对 HSC 不良生 物效应的有措施之一[4]。在肝纤维化过程中，TGF-β 信号通路还与整合素信 号通路存在密切联系。这表现在三个方面：①XXXXXX。②XXXXXX。③ XXXXXXXXX。 综上所述，XXXXXXX，如能 XXXXXX，可进一步实现 XXXXX 治疗。 基于以上研究结果，我们研究室在国家自然科学基金资助下，过去三年 中应用化学方法合成了 RGD 和 M6P，并将 RGD 与 M6P 结合成一新型复合 分子 RGD-M6P， 研究比较了它们对 HSC 靶向性及在抑制其功能中的作用 （项 目名称：RGD 修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究，编号： 30170412） 。我们的研究发现，RGD 和 RGD-M6P 均可抑制 HSC 活化。RGD 在抑制 TGF-β 激活同时， 还可阻止 HSC 与 ECM 结合， 阻断整合素信号转导。 研究还发现，M6P 能提高 RGD 作用于 HSC 的靶向性，增加其局部浓度，使 RGD-M6P 显示出较 RGD 更强的抑制作用[14]。 我们首次证实， 新型复合分子 RGD-M6P 用于抗肝纤维化治疗，无论在对 HSC 靶向的特异性，还是多位点 联合作用方面，都优于单一的含 RGD 序列的肽段或 M6P（参见基金结题摘 要，相关文章参见申请人简历及附件四） 。 RGD-M6P 新型复合分子的研制成功及其对 HSC 靶向与抑制功能的发 现，有助于我们去研究更多的 HSC 靶向选择性高、局部作用强、系统毒性 小的新型药物和(或)制剂，从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们 对 Tet 药理作用的分子机制的研究结果，不难发现，XXXXXXXX。基于以 上系 列 研究基 础 与 设想 ， 紧跟 国内外在制剂学方面的进展，我们 拟 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 XXXXXXXXXXX。 当前，受体调节药物靶向（receptor-mediated drug targeting）作为一种新 型的给药系统受到人们的重视[16]。XXXXXXXXXXXXXXXXX。 迄今为止，尚未见到 XXXXXXXXXXX。 结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础，不难推断， XXXXXXXXXXXXXXXXX。 综上所述，我们拟在 XXXXXXXXXX。本研究将为 XXXXXXXX 等提 供理论与实践基础。XXXXXXXXXX 可以设想，如能取得预期效果，经过 良好设计的基础研究后，这一 XXXXXX 应用于临床的时间不会太久，前景 广阔。 参考文献 1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105. 2 Chen YW, Li DG, Wu JX, et al. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305. 3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease. Alcohol Clin Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S. 4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91. 5 Ludbrook SB, Barry ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-associated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8. 6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-beta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34. 7 XXXXXXXXXXXXXXXXX. 2 项目的研究内容、 项目的研究内容、研究目标， 研究目标，以及拟解决的关键问题 2.1 研究内容： 研究内容： 2.2.1 XXXXX 化学合成与鉴定， 二硬脂酸磷酯酰胺 XXXXXXXXXX 合成 与鉴定。 2.2.2 不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药 物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。 2.2.3 大鼠 HSC 分离培养，XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结 合活性研究。 2.2.4 XXXXX 修饰 XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、 增殖、 XXXXXXX 信号通路影响。 2.2.5 究。 2.2.6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和 CCl4 大鼠肝纤维化防治作用。 XXXXXXXXX 的药代动力学特征、 组织分布特征和 XXXXXXX 研 2.2 研究目标： 研究目标： 2.2.1 研究构建 XXXXXXXX，为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶 向载体。 2.2.2 研究 XXXXXX 对 HSC 生物活性影响及机制，为中西药结合肝纤维 化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础。 2.2.3 研究 XXXXXXXX 体内 HSC 靶向性及防治实验性肝纤维化的有效 性，为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作 用和提高疗效提供实践基础。 2.3 拟解决的关键问题： 拟解决的关键问题： 2.3.1 2.3.2 高药物包封率、高配体修饰率的稳定 XXXXXXXX 制备。 放射性计数法测定 XXXXXX 与 HSC 结合活性，有效抑制 HSC 活 化的剂量、时间参数等。 2.3.3 XXXXXX 体内 HSC 靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。 3 拟采取的研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及可行性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 3.1 研究方案： 研究方案： 第一部分 XXXXX 及 XXXXX 合成 (1) XXXXXX 合成及鉴定 采用我们研究室建立的方法， 化学合成 XXXXXX。 应用 XXXXXXXXXX。 合成反应图示如下。高效液相（HPLC） 、质谱等方法鉴定合成产物纯度 及分子量。 反应图（略） (2) XXXXXXXXXXX 采 用一步法合成。 XXXXXXXXXXXX 。合成反应 图示如下 。 高 效 液 相 （HPLC）和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。 反应图（略） 第二部分 (1) 脂质体制备 采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下：XXXXXXXXXX。 (2) 性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。 (3) 均匀设计优化处方 根据实验结果及文献，确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指 标，采用二项逐步回归计算回归方程，并进行方差分析，优化条件。 第三部分 XXXXX 修饰长循环脂质体与 HSC 体外结合活性 采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC，选择静止态和激 活态的HSC，接种于6孔板上(细胞密度为5.0×105/mL)。待贴壁后，1%胎牛血 清DMEM培养过夜，细胞同步化。 (1)配体结合的浓度-效应关系 XXXXXXXXXXX。 (2) 配体结合的时间-效应关系 XXXXXXXXXXXX。 (3) 竞争抑制 XXXXXXXXXX。 (4) 细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定 XXXXXXXXXX。 (5) 平衡解离常数(Kd )和细胞最大结合位点数(Bmax) XXXXXXXXXXX。 第四部分 XXXXXXX 对 HSC 生物学特性影响与机制 采用酶法分离大鼠 HSC。新鲜分离的 HSC，体外培养 48 h 后，作为静止期 HSC 用于下游实验， 或培养 1 w 后消化传代， 继续培养 24 h 后， 作为活化的 HSC 用于下游实验。 (1) XXXXXXX 对 HSC 活化状态影响 XXXXXXXXX。 (2)XXXXXX 对 TGF-β1 效应影响 XXXXXXXXXXXX。 (3)XXXXXXXX 大鼠 HSC TGF-β 受体 XXXXXXX 信号通路影响 长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化 XXXXXXXXXXXXXX。 第五部分 XXXXXXXXXXXX (1) XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布 XXXXXXXXXX。 (2) XXXXXXX 大鼠体内药代动力学 采用 XXXXXXXX。 (3)XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布 采用 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。 第六部分 XXXXXXX 防治大鼠肝纤维化 (1)造模 采用胆总管结扎和 CCl4 肝纤维化两种动物模型。 (2)分组及处理 XXXXXXXXXXXXXX。 (3)治疗效果检测 主要比较以下指标：XXXXXXXXXXXXXXX。 3.2 技术路线 技术路线图（略）。 3.3可行性分析 3.3.1 立项依据有坚实的理论与实践基础。 本研究是参阅大量文献并结合自身 以往深厚的肝纤维化防治研究基础，特别是结合近四年国家自然科学基金资 助研究成果， 在XXXX 化学合成及功能研究、 低剂量XXX抗肝纤维化作用和 机制的前期工作基础上，提出的多途径、互补协同与靶向治疗肝纤维化的新 探索。掌握了国内外在受体调节药物靶向、低毒性高效中药新剂型开发和以 HSC的靶标的肝纤维化靶向治疗中的最新研究动态，借鉴“双靶向”干预的 最新研究成果，并与自身实践相结合，在理论上、实践上均有可靠基础。 3.3.2 相关实验技术成熟，实验结果可信。本研究使用的实验方法、动物模型 和生物分子化学合成等多为国内外应用多年的经典方法， 并有自身实践基础。 本课题组由掌握以上技术的成员组成，相关技术已应用于科研工作。 3.3.3 人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支 持。申请人长期从事肝纤维化防治研究，先后承担包括国家自然基金在内的 各类科研项目15项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生70余名。近四 年主持了国家自然科学基金项目“RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因 的功能研究(编号30170412）”和“人卵泡抑素防治肝纤维化的实验研究(编号 30170411)”的研究工作，项目组主要成员参与并完成以上研究工作。实验设 计指导者、熟练技术人员及辅助人员等各司其职，可保障研究有条不紊的进 行。新华医院消化内科系上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）国家 级重点学科和“211” 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 重点建设学科的组成单位之一，长期从事肝纤维化 防治研究， 先后承担包括国家自然科学基金在内的各级各类科研项目20余项。 2005年7月，原上海第二医科大学与原上海交通大学合并，组建新的上海交通 大学。作为上海交通大学的附属单位，将在科研究设备和技术上更方便的得 到比以往更广泛的支持。 4 本项目的特色与创新之处 本项目的特色与创新之处 4.1 本课题首次尝试利用 XXXXXXX 构建 HSC 特异性受体调节药物靶向载 体。将新型配体人工化学合成、受体调节药物靶向技术与新型脂质体载药技 术三者结合应用于肝纤维化防治，有很强的原始创新性。 4.2 本课题首次研究 XXXXX 生物小分子通过 XXXXX 与中药粉防己碱相联 合，多途径、互补与协同防治肝纤维化。本课题是利用分子机制指导中西药 联合应用、构建中药靶向制剂提高疗效降低副作用和多途径协同作用抗肝纤 维化的全新尝试，是在总结自身工作基础上进行的大胆设想与创新。 5 年度研究计划及预期研究结果 5.1 年度研究计划： 年度研究计划：略 2007.01-2007.05 2007.06-2008.12 2008.01-2008.05 2008.06-2009.10 2008.11-2009.03 2009.04-2009.10 5.2 预期研究成果 5.2.1 获得快速、有效和大量合成 XXXXXXX 和高药物包封率、高配体修 饰率的稳定 XXXXXXXX 的技参数，并合成足量研究相关产物。 5.2.2 5.2.3 5.2.4 体外研究证实 XXXXXXXX。 在体内 XXXXXXXXX，有效降低有效剂量、提高疗效和降低副作用。 研究证实 XXXXXXX 可成为抗肝纤维化药物新剂型开发的有效载体。 （二）研究基础与工作条件 1 研究基础 研究基础 1.1 既往肝纤维化防治理论和技术。自 1981 年以来，我们研究室长期从事肝 纤维化防治研究，先后对钙拮抗剂、钙调蛋白拮抗剂、大黄素、激活素、肾素血管紧张素系统及卵泡抑素等在肝纤维化发生发展中的作用进行了系列的研究， 积累了较丰富的理论，掌握了相关研究技术。承担了包括国家自然科学基金在内 的各类科研项目 20 多项，先后获省部级以上科技进步奖 10 项。 1.2 粉防己碱抗肝纤维化研究工作积累。项目负责人率先在我国开展钙拮抗 剂尤其是中药粉防己碱对肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化 基础和临床研究成果，在国内外期刊发表相关论文 50 余篇，获省部级以上科技 进步奖 5 项。近两年，我们在上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞 活化信号分子研究（编号 02BK14） ”资助下完成了小剂量粉防己碱抗肝纤维化效 果与机制的研究，在国内外首次报道小剂量粉防己碱可通过影响 TGF-β-Smads 信号通路抑制 HSC 活化，相关研究 论 文被 SCI 收录 ( 收录号 IDS Number: 963XN)。 该研究为指导粉防己碱在肝纤维化防治中应用有重要价值。 （参见申请 人简历及附件二、三） 1.3 生物小分子化学合成及脂质体构建相关工作基础。近四年来，申请人承 担并完成了国家自然科学基金项目“RGD 修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因 的 功 能 研 究 （ 编 号 30170412 ） ” ， 化 学 合 成 了 RGD-M6P ， 分 子 克 隆 构 建 pCI-RGD-Smad7 并成 功 通过 脂质 体进行基因转 染 ，通过体内外实验 观察 了 RGD-M6P 和 pCI-RGD-Smad7 的 生 物 学 效 应 。 细 胞 及 动 物 学 实 验 均 证 实 pCI-RGD-Smad7 和 RGD-M6P 可减轻 ECM 沉积，并影响 TGF-β1 和整合素表达 强度和分布。主要研究工作由本项目组成员参与并完成。目前我们正在利用基 金很少量结余款项进行合成 RGD-M6P 修饰 SSL 的工作。得益于此，他（她） 们分别熟练掌握了生物小分子的化学合成相关技术（多肽合成、固相化反应、 纳米技术、高效分离技术等） 、免疫组织与细胞化学技术、RT-PCR 和定量 PCR、 蛋白印迹、高效液相分析、质谱分析、肝纤维化动物模型及生物信息学方法等 与本课题相关的关键技术与方法（相关论文参见申请人简历） 。由于以上的工作 基础，我们拥有丰富的生物分子合成经验，成熟的生物分子构建技术和良好的 人员与设备支持。已经构建成功的 RGD-M6P 及相关技术要领，可直接用于本课 题。构思本课题的重要原因之一是探讨解决简单单一药物治疗中发现的诸多问 题而开展的，密切相关的细胞学、动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。 2 工作条件 2.1 新 华医院消 化内 科设 有 校 属 的上 海交 通大学 医 学 院消 化系疾病 第 三研 究室。实验室拥有本项目研究相关的大部分生化、细胞生物学及分子生物学等 方面的各种仪器设备，如倒置显微镜摄影设备、γ计数仪、CO2 培养箱、酶联免 疫测定仪、电转膜仪、低温冰箱、低温超速离心机及其它分子生物学设备等。 2.2 上海交通大学医学院（原上海第二医科大学）附属新华医院科研中心与 设立在新华医院的“211”工程重点建设单位上海市儿科医学研究所为本项目开展 提供了仪器、 技术支持和信息服务平台。 我们可免费使用相关设备如层流无菌室、 质谱仪、高效液相色谱仪、定量 PCR 仪、NICOMP Particle Sizer Model 3700 分 析系统、流式细胞仪和 Flous-S MultiImage 图像分析仪等，新华医院和学院均有 SPF 级的动物饲养条件。 3 申请人简历 李定国，男，1946 年 9 月出生。主任医师、研究员、教授和博士生导师。 1981 年和 1989 年分别获原上海第二医科大学医学硕士和医学博士学位。现 任上海交通大学医学院消化系疾病第三研究室主任、上海交通大学医学院附 属新华医院消化内科主任。兼任上海市内科学会委员和上海市消化病学会委 员等职。 本项目负责人长期从事肝纤维化防治研究，在抗肝纤维化中药筛选与机 制研究、生物小分子合成、脂质体药物传递和基因转染、基因重组及基因治 疗等方面有丰富研究经验。率先在我国开展钙拮抗剂尤其是中药粉防己碱对 肝纤维化防治研究，取得丰富的粉防己碱抗肝纤维化基础和临床研究成果， 在国内外期刊发表相关论文 50 余篇。 先后承担包括国家自然基金在内的各类 科研项目 15 项，指导或协助指导博士后、博士生及硕士生 70 余名，获省部 级以上科技进步奖 10 项。近四年主持了国家自然科学基金项目“RGD 修饰细 胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究(编号 30170412） ”和“人卵泡抑素 防治肝纤维化的实验研究(编号 30170411)”的肝纤维化防治研究工作（以上 2 项目均已经顺利结题） ，指导完成上海市自然科学基金项目“Smad7 和 uPA 双基因共表达对实验性肝纤维化的影响(编号 03ZR14050)”和上海市教委基 金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号 02BK14） ” 。近 五年发表的与本课题相关论文（第一作者或通讯作者） ，其中一篇与本课题设 计 密 切 相 关 的 重 要 论 著 2005 年 发 表 于 SCI 索 引 源 期 刊 “ Journal of Ethnopharmacology”并被 SCI 收录 （收录号 IDS Number: 963XN） （见附件二、 三） ： 1 李定国, 陈颖伟。 肝纤维化研究现状及展望。 上海第二医科大学学报 2005； 25(2):101-6。 （述评） 2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005；100(3):299-305.（论著 SCI 收录号 IDS Number: 963XN） 3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):2922-6. （论著） 4 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨 膜信号转导的影响。中华肝脏病杂志 2005；13(8):609-10。 （论著） 5 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调 Smad7 表达抑制 大鼠肝星状细胞活化。中国药理学通报 2005；21(5):563-7。 （论著 ） 6 王志荣, 陈锡美, 李定国, 魏红山, 黄新, 展玉涛, 汪余勤, 陆汉明。粉防己 碱抑制肝纤维化大鼠肝组织 c-fos 和 c-jun mRNA 表达。上海医学 2003； 26(5):332-6。 （论著） 7 王志荣, 李定国, 陈锡美, 魏红山, 黄新, 展玉涛, 徐芹芳, 陆汉明。联合应 用 粉 防 己 碱 与 甘 草 酸 抗 肝 纤 维 化 的 实 验 研究 。 中 华 消 化 杂 志 2003 ； 23(7):435-6。 （论著） 8 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P 对原代肝星状细胞 的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。 （论著） 9 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。 人工合成 RGD 小肽对肝 星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。 （论 著） 10 程计林, 周欣, 高志刚, 霍玉青, 徐芹芳, 李定国。 外源性转化生长因子 β1 与小鼠肝细胞 Smad7 mRNA 及蛋白 表达的关系。中 华医学 杂志 2002； 82(2):111-3。 （论著） 11 陈源文, 吴建新, 李定国, 陆汉明。转化生长因子-β 与转基因治疗肝纤维 化。中华消化杂志 2002；22(10):621-3。 （综述） 12 程 计 林 , 周欣 , 李 定国 , 魏红山 , 黄 新 , 王志荣 , 展 玉涛 , 张晶 , 徐芹芳 , 陆汉明。RGDS 肽对 TGFβ 刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。临床 肝胆病杂志 2001；17(3):173-5。 （论著） 13 Wei FS, Li DG, Lu HM, Zhan YT, Wang ZR, Hang X, Xu QF. The role of enalapril in pathogenesis of CCL4 induced hepatic fibrosis. Journal of Shanghai Second Medical University 2001；13(1):19-23. （论著） 14 程计林, 周欣, 李定国, 黄新, 魏红山, 徐芹芳。精-甘-天冬-丝氨酸肽对肝 纤 维 化 鼠 血 清 Ⅲ 型 胶原 水 平 的 影 响 。 上 海第 二 医 科 大 学 学 报 2001 ； 21(3):210-2。 （论著） 15 陈颖伟 , 李 定国。 Smad7 和组织器官 纤维化。上 海第 二 医科 大学学 报 2005；25(2):132-3。 （ 论著） 16 陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。 Smad7 基因过表达对 L02 肝细胞株增 殖的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):103-6。 （论著） 17 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。 外源 Smad7 基因对原代肝星状细胞活 性和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。 （论 著） 18 汪余勤, 李定国, 吴建新, 宗春华, 董国芳, 瞿春莹, 陆汉明。 血管紧张素 Ⅱ对肝星状细胞表达转化生长因子 βⅠ、Ⅱ型受体及其功能的影响。中华 消化杂志 2005；25(7):434-5。 （论著） 19 Zhou X, Li D, Li X, Lu H, Zhang W. A combination of Ang II and carbon tetrachloride accelerates process of hepatic fibrosis. Chin Med J 2003 ； 116(1):62-5.（论著） 20 陈颖伟, 卫新革, 展玉涛, 张文竹, 徐芹芳, 李定国。大黄与粉防己碱抗实 验性肝纤维化的对照研究。中华消化杂志 2003；23(8):476-9。 （论著 ） 在本课题中负责课题设计、组织实施、质量控制、数据收集整理和统计 分析等。 陈源文，男，1976 年 8 月出生，博士。2000 年毕业于江西医学院临床 医学系，获学士学位，同年考入原上海第二医科大学，2005 年获内科学博士 学位。主要从事肝损伤机制及肝纤维化防治研究。在中药（粉防己碱、氧化 苦参碱）抗肝纤维化作用、细胞信号转导、基因转染与基因重组和干细胞研 究方面有较丰富的理论基础与研究经历。 作为项目负责人完成校基金项目“氧化苦参碱对 TGF-β信号转导的影 响及机制（编号 BXJ0215） ”研究工作，负责完成上海市教委基金项目“粉 防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编号 02BK14） ” ，并参与国家自 然科学基金项目“RGD 修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究 (编号 30170412） ” 的细胞学部分的研究工作。 2005 年申请国家自然科学基金 项目 “IL-10 或 uPA 基因修饰骨髓源性肝干细胞移植防治肝纤维化的比较研 究”获资助（编号 30500236） 。近期发表的与本课题相关论文如下： 1 陈源文, 吴建新, 李定国, 陆汉明。转化生长因子-β 与转基因治疗肝纤维 化。中华消化杂志 2002；22(10)：621-3。 （综述） 2 Chen YW, Li DG, Wu JX, Chen YW, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005； 100(3):299-305. （论著） 3 Chen YW, Wu JX, Chen YW, Li DG, Lu HM. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling. World J Gastroenterol 2005；11(19):2922-6. （论著） 4 陈源文, 李定国，吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱对大鼠肝星状细胞跨 膜信号转导的影响。中华肝脏病杂志 2005；13(8):609-10。 （论著） 5 陈源文, 李定国, 吴建新, 陈颖伟, 陆汉明。粉防己碱上调 Smad7 表达抑制 大鼠肝星状细胞活化。中国药理学通报 2005；21(5):563-7。 （论著 ） 6 陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。Smad7 基因过表达对 L02 肝细胞株增殖 的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):103-6。 （论著） 7 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。 外源 Smad7 基因对原代肝星状细胞活性 和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-412。 （论 著） 在本课题中负责 HSC 分离培养及细胞学实验 （主要是配体修饰脂质体对 HSC 生物学特性影响等）研究工作。 刘清华，女，1971 年 2 月出生。副主任医师，副教授。1996 年和 2003 年分别获上海第二医科大学医学硕士学位、医学博士学位。主要研究方向为 肝损伤机制及肝纤维化防治。在肝纤维化性别差异细胞分子机制、生物小分 子抗肝星状细胞功能研究等领域有较丰富的研究经历。 作为课题负责人承担院级基金项目“雌激素防治肝纤维化的实验研究” ， 参与上海市教委基金项目“粉防己碱影响肝星状细胞活化信号分子研究（编 号 02BK14） ”以及国家自然科学基金项目“RGD 修饰细胞生物信息调控分子 和缀合基因的功能研究（编号 30170412） ”细胞学研究工作。近期发表与本 课题相关的论文有： 1 刘清华, 李定国, 黄新, 尤汉宁, 潘勤, 徐雷鸣, 徐芹芳, 陆汉明。激活素 A 对肝星状细胞细胞外基 质 合成的影响。 世界 华 人 消 化 杂志 2003 ； 11(6): 745-8。 （论著） 2 刘清华, 李定国, 宗春华, 黄新, 徐芹芳, 陆汉明。 17β-雌二醇及代谢产物对 大鼠 HSC 功能的影响。中华消化杂志 2004；24(5): 165-9。 （论著 ） 3 Qing-Hua Liu, Ding-Guo Li, Xin Huang, Chun-Hua Zong, Qin-Fang Xu, Han-Ming Lu. Suppressive effects of 17β-estradiol on hepatic fibrosis in CCl4-induced rat model. World J Gastroenterol 2004; 10(9): 1315-20. （论著） 4 刘清华, 李定国, 宗春华, 黄新, 徐芹芳, 陆汉明。雌激素对雄性大鼠肝纤 维化形成的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(1): 39-42。 （论著 ） 在本课题中参与细胞学实验（主要是配体修饰脂质体对 HSC 生物学特 性影响等）研究工作。 兰玲，女，1976 年 11 月出生。硕士。2000 年毕业于河南医科大学临床 医学系， 获医学学士学位， 2003 年毕业于郑州大学医学院， 获医学硕士学位， 硕士期间主要从事食管癌高发区人群食管癌变机制和防治研究。现在上海第 二医科大学攻读博士学位，从事干细胞研究工作。近期发表论文 4 篇。 在本课题中参与受体调节载药脂质体构建与细胞学功能分析。 陈颖伟，女，1974 年 2 月出生。博士，主治医师。1999 年和 2004 分别 获原上海第二医科大学获医学硕士和医学博士学位。主要从事肝纤维化防治 研究。在中药（大黄素、粉防己碱）抗肝纤维化机制、HSC 细胞信号转导、 生物小分子化学合成、纯化与鉴定和重组腺病毒构建与基因转染等方面有较 丰富的理论与研究经验积累。 在攻读硕士学位期间参与“大黄素抗肝纤维化作用研究” 、 “PDGF 在肝 纤维化发病机制中的作用研究”等课题研究。攻读博士学位及工作期间参与 上海市科学技术发展基金课题“肝星状细胞信号传导网络新的调控分子”的 研究工作，负责完成国家自然科学基金“RGD 修饰细胞生物信息调控分子和 缀合基因的功能研究(编号 30170412)”的关键部分工作，作为项目负责人承 担上海市自然科学基金项目“Smad7 和 uPA 双基因共表达对实验性肝纤维化 的影响(编号 03ZR14050)” （该项目已经顺利结题） 。近期发表的与本课题相 关论文： 1 陈颖伟, 卫新革, 展玉涛, 张文竹, 徐芹芳, 李定国。 大黄与粉防已碱抗实验 性肝纤维化的对照研究。中华消化杂志 2003；23(8)：476-9。 （论著 ） 2 陈颖伟, 展玉涛, 李定国。单味生大黄对肝纤维化的影响。中国中西医结合 杂志 2004；24(6)：110-3。 （论著） 3 陈颖伟, 胡良凯, 陈源文, 李定国。新型 Smad7 重组腺病毒载体的构建。上 海第二医科大学学报 2004；24(6)：417-20。 （ 论著） 4 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。外源 Smad7 基因对原代肝星状细胞活性 和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。 （论著 ） 5 陈颖伟, 陈源文, 王连升, 李定国。Smad7 基因过表达对 L02 肝细胞株增殖 的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2)：103-6。 （论著） 6 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。 RGD-M6P 对原代肝星状细胞的 影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。 （论著） 7 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。 人工合成 RGD 小肽对肝 星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。 （论 著） 在本课题中主要负责 RGD-M6P 及相关分子合成、受体调节载药脂质体 的体外结合实验。 王连升，男，1976 年 8 月出生。硕士。2001 年毕业山东医科大学，获 学士学位，同年考入原上海第二医科大学，2004 年获硕士学位。主要从事抗 肝纤维化生物小分子化学合成、纯化鉴定和功能研究。在小肽合成分离与质 谱分析、糖肽合成、纯化、质谱与高效液相分析和载药配体调节脂质体等方 面有较丰富的理论基础与研究经历。 主要参与了国家自然科学基金项目 “RGD 修饰细胞生物信息调控分子和 缀合基因的功能研究(编号 30170412） ”的 RGD 相关缀合分子化学合成与体 内、体外功能研究部分工作。近期发表的与本课题相关论文： 1 王连升, 李定国。TGFβ 及 Smad 与肝纤维化。国外医学·消化系疾病分册， 2003；23（4） ：222-5。 （综述） 2 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。 RGD-M6P 对原代肝星状细胞的 影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。 （论著） 待发表论著： 1 Wang LS, Chen YW, Li DG, Lu HM. RGD-M6P Inhibits the activation and proliferation of hepatic stellate cells in vitro. World J Gastroenterol 2006 (in press, Ms. NoWjg/2005/002566) 在本课题中主要负责 RGD-M6P 及相关缀合分子合成、纯化、质谱与高 效液相分析，以及受体调节载药脂质体构建和物理性质检测。 孙巧玲，女，1976 年 9 月出生。硕士。2000 年毕业于大连医科大学临床 医学系，获学士学位，2003 年毕业于大连医科大学，获医学硕士学位，硕士 期间主要从事基质金属蛋白酶在食管癌中表达的研究。现在上海第二医科大 学攻读博士学位。近期发表论文 1 篇。 在本课题中负责动物实验与分子生物学检测实验。 丁小东，男，1977 年 7 月出生，2000 年毕业于白求恩医科大学（现吉林 大学白求恩医学部）临床医疗系，获医学学士学位。2003 年毕业于复旦大学 上海医学院内科学专业，获临床医学硕士学位。一直从事慢性肝病，尤其是 脂肪性肝病的研究工作，在肝损伤动物模型制作及药物防治研究方面的较丰 富的研究经历。 2000～2003 年参加上海市科技启明星计划课题“微血栓在非酒精性脂肪 性肝炎发病中作用”的研究，发表学术论文和专著 17 篇。近期发表的与本课 题相关的论文有： 1 丁晓东, 范建高, 王国良, 徐正婕, 郑晓英, 田丽艳。 二甲双胍干预大鼠非酒 精性脂肪性肝炎的疗效观察；肝脏 2005；10;(3):79-81。 2 丁晓东, 范建高, 徐正婕, 郑晓英, 田丽艳, 王国良。高脂饮食性脂肪性肝 炎 大 鼠 肝 脏线 粒 体 损伤 和 ATP 储 备 改 变 。 世界 华 人 消 化 杂志 2005 ； 13(13):1524-8。 3 范建高、丁晓东、王国良、徐正婕、郑晓英、田丽艳。非酒精性脂肪性肝 病大鼠肝脏 UCP2 表达及其与能量贮备的关系；中华肝脏病杂志 2005； 13(5):374-7。 4 范建高、丁晓东、王国良、徐正婕、郑晓英、田丽艳。高脂饮食性非酒精 性脂肪性肝病大鼠肝脏 PPAR-γ表达增强。肝脏 2004；9(4):225-8。 在本课题中负责动物学实验（药代动力学、造模）与分子生物学检测。 张毅，男，1978 年 11 月出生。硕士。2004 年毕业于上海第二医科大学， 获医学硕士学位。现为上海第二医科大学附属新华医院消化内科医师，从事 临床与肝纤维化防治科研工作。发表论文 1 篇。 在本课题中负责动物实验及病理检测。 徐琴芳，女，1954 年 2 月出生。主管技师，为消化实验室专职技术员， 从事细胞、分子生物学实验相关工作十余年。 在本课题中负责生化、病理检测。 4 承担科研项目情况 目前在研项目名称：IL-10 或uPA 基因修饰骨髓源性肝干细胞移植防治 肝纤维化的比较研究，编号30500236，由国家自然科学基金委员会资助。计 划2006年1月起至2008年12月止，经费25.0万元。项目组主要成员陈源文为项 目负责人，陈颖伟、张毅等参与部分工作，包括uPA腺病毒感染骨髓源性肝 干细胞效率、转基因干细胞生物学特性变化的细胞学实验和转uPA基因干细 胞移植的肝纤维化防治作用的部分动物学实验等。本项目得益于一定的前期 工作基础和自申请初即开始相关研究，目前项目进展顺利，已经完成病毒构 建、uPA腺病毒感染骨髓源性肝干细胞效率、实现外源基因在干细胞中表达， 正在准备进行转基因干细胞移植的动物学研究。 5 完成自然科学基金项目情况 国家自然科学基金项目： RGD 修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的 功能研究（编号 30170412，起止年月：2002 年 1 月-2004 年 12 月） 。项目已 于 2004 年 12 月顺利完成和结题。 通过该项目研究工作，采用化学法合成了新型生物分子 RGD-M6P，并 研究了其抗肝纤维化功能。结果发现肝硬化时存在 TGF-β、整合素、Smad7 信号分子分布和功能异常，RGD-M6P 可影响 TGF-β 和整合素表达强度和分 布，减轻 ECM 沉积。动物实验证实还 RGD-M6P 抗肝纤维化作用优于 RGD、 M6P 或 RGD 与 M6P 简单混合，提示 RGD-M6P 存在良好的靶向性。 在此工作基础上， 进一步进行了干预 TGF-β-Smad7 信号通路抗肝纤维化 的研究： ①成功构建携外源 Smad7 基因腺病毒、 Smad7 与 uPA 共表达腺病毒， 并进行了肝纤维化转基因治疗研究； ②研究了小剂量粉防己碱抗 HSC 活化与 TGF-β-Smad7 信号通路关系；③目前尝试开展利用 RGD-M6P 小分子实现 HSC 靶向和与其它药物协同多途径抗 HSC 活化和功能的研究。 基与以上国家自然科学基金项目研究基础和系列相关后续研究，在提高 药物靶向性、多靶点协同作用思想指导下，设计了 RGD-M6P 小分子介导粉 防己碱脂质体抗肝纤维化的研究工作。本研究是建立在以往研究基础上的又 一大胆探索与尝试。 由于以上的工作基础，我们拥有丰富的生物分子化学经验，成熟的分子 生物学技术、较好的长循环脂质体构建技术基础和良好的人员与设备支持。 已经构建成功的 RGD-M6P 已经经过功能检测，可直接用于本课题。密切相 关的细胞学、 动物学实验基础也是本实验成功的重要保证。 （相关内容参见申 请人简历和该项目研究 工作总结 关于社区教育工作总结关于年中工作总结关于校园安全工作总结关于校园安全工作总结关于意识形态工作总结 摘要） 附：该项目研究工作总结摘要和相关成果的目录 搞要： 目的：研究 RGD 经 M6P 修饰或缀合 Smad7 基因对 HSC 生物功能和实 验性肝纤维化的影响。 方法：化学合成 RGD-M6P；分子克隆构建 pCI-RGD-Smad7；通过体内 外实验观察 RGD-M6P 和 pCI-RGD-Smad7 的生物学效应。 结果：①与 TGFβ1 组相比，RGD-M6P 组 HSC 上清中 PCⅢ含量显著降 低，α-SMA 表达明显减低；与 CCl4 模型组相比，RGD-M6P 组胶原面积比例 显著减小，肝功能指标明显改善，血清 PCⅢ含量显著降低，且优于 RGD 和 M6P 组；②pCI-RGD-Smad7 组 HSC 上清 III 型胶原水平明显低于对照质粒 pCI 组； 免疫组化显示， 肝纤维化时大鼠肝组织中 TGFβ1 和整合素表达增强， Smad7 表达则降低； pCI-RGD-Smad7 基因治疗组大鼠肝组织 Smad7 表达增强， TGFβ1 和整合素表达均显著降低；HE 和 VG 染色显示，pCI-RGD-Smad7 基 因治疗组肝组织纤维化程度较模型组明显减轻。 结论：肝硬化时存在 TGFβ、整合素、Smad7 信号分子分布和功能异常。 pCI-RGD-Smad7 和 RGD-M6P 可减轻 ECM 沉积，并影响 TGFβ1 和整合素表 达强度和分布。 成果目录： 1 程计林, 周欣, 高志刚, 霍玉青, 徐芹芳, 李定国。外源性转化生长因子 β1 与小 鼠 肝细胞 Smad7 mRNA 及 蛋白 表达的关系。中 华医学 杂志 2002 ； 82(2):111-3。 2 杜学亮, 陈颖伟, 王连升, 徐芹芳, 李定国, 吴真。 入工合成 RGD 小肽对肝 星状细胞付泌细胞外基质的影响。放射免疫学杂志 2004；17(6):433-5。 3 陈颖伟, 陈源文, 尤汉宁, 李定国。 外源 Smad7 基因对原代肝星状细胞活性 和基因表达调控的影响。中华消化杂志 2005；25(7):409-12。 4 王连升, 陈颖伟, 张建华, 李定国, 陆汉明。RGD-M6P 对原代肝星状细胞 的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2):112-5。 5 陈颖伟, 李定国。 Smad7 和组织器官纤维化。 上海第二医科大学学报 2005； 25(2):132-3。 6 陈颖伟，胡良凯，陈源文，李定国。新型 Smad7 重组腺病毒载体的构建。 上海第二医科大学学报 2004；24(6)：417-20。 7 陈颖伟，陈源文，王连升，李定国。Smad7 基因过表达对 L02 肝细胞株增 殖的影响。上海第二医科大学学报 2005；25(2)：103-6。 8 程计林, 周欣, 李定国, 魏红山, 黄新, 王志荣, 展玉涛, 张晶, 徐芹芳, 陆 汉明。RGDS 肽对 TGFβ 刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。临床肝 胆病杂志 2001；17(3):173-5。 （三）经费申请说明 详见经费申请表。 （四）其他附件清单 附件一 查新报告（扫描件略） 附件二 论著“Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7”首页。论文 2005 年 发 表 在 中 草 药 研 究 领 域 有 一 定 影 响 力 的 杂 志 “Journal of Ethnopharmacology” （IF 1.420） 。 该研究原著报道了低浓度粉防己碱能上调 TGF-β 抑制性信号分子 Smad 7 表达，调控 TGF-β-Smad 信号通路，抑制体外培养静止 期 HSC 活化， 是对粉防己碱抗肝纤维化有效剂量和作用机制的全新认识。 （扫描 件略） 。