胚胎干细胞的研究进展

2006年蒡d2糟嚣13期 Review Papers·囹■匪蛋 胚胎干细胞的研究进展 许 杰，马恒东，郝泽东 (四川农业大学动物科技学院，四川雅安 625014) 摘 要：胚胎干细胞来源于附植前胚胎的内细胞团或附植后胎儿的原始生殖细胞具有发育全能性的细胞。本文从它 的研究概况、生物学特性、胚胎干细胞的分离培养与建系等方面做一概述。 关键词：畜牧、兽医科学基础学科 ；胚胎干细胞；综述；生物学特性；分离培养 中图分类号：$814．8 文献标识码：A 文章编号：0258—7033(2006)13—0043—02 胚胎干细胞(Es细胞)是从附植前胚胎的内细胞 团(ICM)或附植后胎儿的原始生殖细胞(PGCs)经体外 分化、抑制培养、分离和克隆得到的具有发育全能性的 细胞。从其发现至今的2O多年里，Es细胞作为一种新 的实验材料，受到社会各界的广泛关注。1998年，人 ES细胞的成功分离与建系，开辟了哺乳动物 ES细胞 研究的新纪元。 1 胚胎干细胞的研究概况 Es细胞的研究首先源于畸胎瘤干细胞或胚胎癌细 胞(EC细胞)。1958年，steven【 把小鼠早期胚胎移植到 “129品系”小鼠精巢或肾脏的被膜下，得到了EC细胞。 1974年，Brinste— =巴EC细胞注射到小鼠囊胚后，参与受 体胚胎的发育而得到EC细胞嵌合体。 Evans和 Kaufmanpl利用延迟着床的小鼠早期胚胎 体外培养，由ICM细胞培养出小鼠Es细胞。后人以他 们两人名字的第一个字母命名该细胞为EK细胞，即现 在的Es细胞。随后研究人员将研究范围扩展至其他动 物，相继建立了绵羊、仓鼠、牛、水貂、兔、猪、恒河猴、山 羊等的类 Es细胞系。1998年，Thomson等问率先成功分 离、克隆了人胚胎干细胞，并建立了细胞系。自此，Es细 胞的研究成为世界关注的焦点，并达到了高潮。 2 ES细胞的生物学特性 2．1 ES细胞的形态学特征 各种动物的Es细胞具 有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核 大，胞质胞浆少，细胞界限明显。体外培养时，细胞排列 紧密，呈集落状生长。边缘折光性强，集落边缘可见有 少量的已经分化为扁平上皮细胞或梭形的成纤维细 胞。用碱性磷酸酶染色法染色，Es细胞呈棕红色，而周 收稿 日期：2004—08—16；修回日期：2004—12—13 基金项 目：四川省教育厅重点项 目 围的成纤维细胞则呈淡黄色旧。 2．2 ES细胞的基本特征 ES细胞在含有抑制分化物 的培养基中可以不断增殖且不分化，便于建立稳定的 Es细胞系，易于进行各种操作而不影响其特性。此外， ES细胞具有全能性和多能性。 3 ES细胞的分离培养及 ES细胞系的建立 3．1 ES细胞分离培养及建系的材料 可采用早期胚 胎或采用 PGCs。胚胎发育的阶段与Es细胞分离的效 率密切相关。动物的品种不同，理想的胚胎发育阶段要 求也不完全一致。 3．2 ES细胞的培养体系 培养体系不仅要促进 Es 细胞生长，还要抑制细胞分化，维持未分化的状态，保 持正常的核型。目前的培养体系有3种。 3．2．1 饲养层培养体系 这种体系是先用常规的培养 液对体细胞进行培养，待细胞铺层后，用 射线照射或 用丝裂霉素 c处理使细胞停止分裂，即形成饲养层。 培养液一般是 DMEM+15％的犊牛血清(FCS)，培养液 中还可添加氨基酸、丙酮酸盐、乙醇、谷氨酰胺、 一巯基 乙醇等。用于制备饲养层的体细胞要求分裂缓慢但生 命力较强，现在广泛使用的是小鼠成纤维细胞无限系 (STO)或小鼠原代胚胎成纤维细胞(PMEF) 。 3．2．2 条件培养体系 在这种体系中，囊胚或 PGCs 直接培养在特殊的培养液中，不需要饲养层就可获得 Es细胞。这种培养液来源于某些细胞培养一段时间后 回收的液体。常用的细胞有豚鼠肝脏细胞、人膀胱癌细 胞、小鼠的EC细胞。这些细胞在生长过程中不仅能分 泌细胞分化抑制因子，还能分泌某些细胞生长因子。 3．2_3 培养液中添加分化抑制因子体系 这种 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 是 将分化抑制因子直接添加到囊胚或 PGCs的培养液 中，分离 Es细胞。所用的分化抑制因子有LIF、DLA (分化抑制因子)、HILDA(人白细胞介素)等 。在实际 应用中，为提高 Es细胞的分离效率，在饲养层体系中 中固舂牧系志。 维普资讯 http://www.cqvip.com 匪啊 ·Review Papers 也可添加一定浓度的分化抑制因子。 3．3 Es细胞的分离 以早期胚胎为材料首先要获得 ICM。目前有2种方法：机械剥离法和免疫外科手术 法。前者是让胚胎在体外生长，等到ICM突出于滋养 层后用微针切割或毛细管反复吹打去除滋养层细胞， 分离出ICMt3~。后一种方法是囊胚在体外培养至孵出透 明带后，用酸性台氏液除去透明带，再加入特异抗体， 使抗体与滋养层结合，然后用豚鼠补体处理以溶解滋 养层细胞，保留ICM细胞。这种方法简单且去除滋养 层彻底。因此是分离 ICM较常用的方法阐。将得到的 ICM细胞培养在长有饲养层细胞的培养皿中。若以 PGCs为材料，可根据不同物种，采集胎儿的特定组织， 可直接培养，也可经消化离心等过程制备含PGCs的 悬浮液，再接种于新制备的饲养层上。待其充分增殖 后，挑取、消化离散并接种于新的饲养层上，经反复筛 选后即可获得Es细胞，进而建系。 3．4 Es细胞的鉴定和保存 Es细胞的鉴定伴随着 Es细胞的分离和其他生物技术的发展而不断完善。通 过 Es细胞的形态学特征、核型可进行初步判断；通过 分化实验和嵌合体制备可 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 Es细胞的分化潜能， 通过碱性磷酸酶染色和胚胎阶段特异性抗原免疫荧光 标记法，都可鉴定 Es细胞。 目前 Es细胞的保存方法有 2种：一种为常规保 存，即通过不断更换培养液，以传代的培养方式保持 Es细胞的不分化状态 ；另一种是冷冻保存，即通过超 低温冷冻保存使细胞的活动完全停止，达到长期保存 的目的。 4 问题与展望 Es细胞尽管有上述种种优越性，应用Es细胞进 行研究也面临着诸多问题。首先，研究 Es细胞的临床 2006年 第 42卷 第 13期 应用时，一定会触及体细胞克隆技术，也一定会损坏人 类早期胚胎，这就触及了社会伦理学的问题；其次，目 前已报道的动物 Es细胞系只有小鼠的Es细胞系较 稳定，能产生嵌合体，Es干细胞在体外随培养时间的 延长，不能维持整倍体正常核型，胚胎干细胞移植后还 有潜在的成瘤性。而且用 Es细胞诱导形成完整的组 织器官还需理论和技术上的突破。这些问题不容忽视， 但随着胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术等 与Es细胞研究的结合，相信 Es细胞的全部潜能将会 得到逐一实现。 参考文献： [1】 Stevens L C．Studies on transplantable testicular teratomas of strain 129 mice[J]．Natl Cancer Inst，1958，20：1257-1270． [2】 Brinster K L．The effect of cells transfered into the incuse blastocyst on subsequent development[J]．Exp Med，1974，140：1049—1056． [31 Evans M J，Kaufman M H．Establishment in culture df pluripotent cells from mouse embryos[J]．Nature，1981，292(9)：154-156． [4】Thomson J A，Itskovitz—Eldor J．Shapiro S S，et a1．Embryonic stem cell lines derived from human blastiocysts[J]．Science，1998，282： l145一l147． [5】赖学良 家兔类胚胎干细胞的分离和克陶D】．哈尔滨：东北农业 大学，1995． [6】 斛智莲．胚胎干细胞 的体外培养及应用【J】_黑龙江畜牧兽 医，2001，(11)：31—32． [7】 Pease S，Braghetta P，Gearing D，et ．Isolation of embryonic stem (ES)cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor(LIF)[J]．Dev Biol，1990，141：344—352． [8】 Martin G R．Isolation of a pluripotent cell lines from early mouse emb ryos cultured in medium conditioned by teratocareinoma a stem cells[j]．Science，1 98 1，78f2)：7634—7638． [9】 Amit M，Carpenter M K，Inokma M S，et ．Clonally derived human emb ryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture【J1．Dev Biol，2000，227： 271-228 Advance in Embryonic Stem Cell XU Jie，MA Heng—dong，HAO Ze-dong (College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Sichuan Ya’an 6250 1 4，China) Abstract：：Embryonic stem cell is a kind of undifferentiated pleuripotent stem cell，which stems from preimplatation ICM or early foetus primordial germ cel1．This paper reviewed the advances，biological character，separation and cul— ture of embryonic stem cel1． Key words：basal disciplines of animal an d veterinary science；embryonic stem cell；a review；biological character； separation and culture 《 中固亳牧臻怎 维普资讯 http://www.cqvip.com