毛细管电泳2研

会计学毛细管电泳2研一、概述Generalization二、经典电泳分析法Traditionalelectrophoresis三、高效毛细管电泳分析法Highperformancecapillaryelectrophoresis第一节概述Generalization一.概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。生物化学家蒂塞利乌斯A.W.K.蒂塞利乌斯ArneWilhelmKaurinTiselius(1902－1971）蒂塞利乌斯1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与斯韦德贝里合作发表了第一篇论文,报道了测定蛋白质淌度的新方法。1930年他进一步改进实验手段和装置,发表了关于色谱法和吸附的论文。1935年改建原有电泳装置,发展了区带电泳法,大大提高了效率和分辨率。1940年他用自己设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分,分别命名为:白蛋白α、β、γ和球蛋白。该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。他因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖。二.经典电泳分析利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。三.高效毛细管电泳分析高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了小内径（50μm，75μm）的毛细管,二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数.3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行.4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 等.一、HPCE基本原理BasicprinciplesofHPCE二、电渗现象与电渗流Electroosmosisandelectroosmoticflow三、影响电渗流的因素Factorsinfluencedelectroosmosis四、淌度Mobility五、HPCE中的参数与关系式ParametersandrelationinHPCE六、影响分离效率的因素Factorsinfluencedseparationefficiency第二节高效毛细管电泳理论基础BasictheoryofHPCE一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理BasicprinciplesofHPCE电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)所以，迁移速度：（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度μ：单位电场强度下的平均电泳速度。q—离子所带的有效电荷；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；二、电渗现象与电渗流electroosmosisandelectroosmoticflow1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。2.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。3.HPCE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。ν电渗流=ε0εξE实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。HPCE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。4.HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。5.HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。三、HPCE中影响电渗流的因素factorsinfluencedelectroosmosis1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；3.电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。4.温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1C°，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流减小。四、淌度mobility淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度(absolutemobility)μab无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度(effectivemobility)μef实际溶液中的淌度(实验中测定的)。μef=∑aiμiai—溶质i的解离度；μi—溶质i在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度μap离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：νap=μapEμap=μef+μeo五、HPCE中的参数与关系式parametersandrelationinHPCE1.迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。3.分离度影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：六、影响分离效率的因素—区带展宽factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening1.纵向扩散的影响在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。3.焦耳热与温度梯度的影响电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；(2）控制散热；4.溶质与管壁间的相互作用存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。5.其他影响因素（1）电分散作用对谱带展宽的影响当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。一、高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus二、流程与主要部件processandmainassembly三、进样方式injectionmethod第三节高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus一、高效毛细管电泳仪highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus仪器2仪器3P/ACEMDQCapillaryElectrophoresishttp://beckman.com/products/instrument/analytical/ce/美国贝克曼库尔特公司二、仪器流程与主要部件processandmainassembly电压：0～30kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）1.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2） 规格 视频线规格配置磁共振要求常用水泵型号参数扭矩规格钢结构技术规格书 ：内径20～75μm，外径350～400μm；长度<=1m3.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；4.检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-18～10-19离子灵敏，需专用的装置；三、毛细管电泳的进样方式injectionmethodofHPCE进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；1.流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样毛细管一端插入样品瓶，加电压；2.电动进样方式进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样一、毛细管区带电泳(CZE)Capillaryzoneelectrophoresis二、毛细管凝胶电泳(CGE)Capillarygelelectrophoresis三、胶束电动毛细管色谱Micelleelectrokineticcapillaryelectrophoresis四、毛细管电色谱Capillaryelectrochromatography五、其他第四节高效毛细管电泳分离模式SeparatetypesofHPCE一、毛细管区带电泳Capillaryzoneelectrophoresis，CZE带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；二、毛细管凝胶电泳Capillarygelelectrophoresis，CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2.电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流>ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；　　在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定相，或在管内填充固定相，根据溶质在固定相和流动相中的分配系数的不同和自身的电泳淌度差异得以分离．四、毛细管电色谱(CEC)Capillaryelectrochromatography几种主要类型开管毛细管电色谱柱OT-CEC填充毛细管电色谱柱P-CEC整体毛细管电色谱柱ML-CEC填充毛细管电色谱柱P-CEC是最早研究的，其填料巨大的比表面使其对污染不敏感，分析结果的重现性较好，但因其填充及制备柱两端塞子的困难，以及由此带来的气泡效应和塞子效应等阻碍了它的进一步发展。但人们至今仍在努力并取得可喜进展。开管毛细管电色谱柱OT-CEC柱中无塞子和填料，气泡效应和涡流扩散的影响小，分析中可获得较高柱效，适用于混合物的快速分析，但其相比小，柱容量低，寿命短，使其应用亦受到一定限制。化学键合物理吸附整体毛细管电色谱柱ML-CEC通过在毛细管内原位聚合或固化的方法制成具有均一多孔结构的整体式柱床，使毛细管柱的制备比较简单，且无塞子效应.制备反应1cm1cmSEM表征1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；五、毛细管等电聚焦Capillaryisoelectricfocusing，CIEF4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。一、离子分析analysisofion阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；第五节应用与进展阴离子分析阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析；二、药物分析Analysisofpharmaceutics检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；采用MEKC模式，鉴定违禁药物.三、手性化合物分析Analysisofchiralcompounds合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，61种以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）四、氨基酸与蛋白质分析Analysisofaminoacids采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；蛋白质分析五、核酸分析及DNA排序AnalysisofnucleicacidsandsequenceofDNA重要分析手段；图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；六、新进展advancesandspecialtopics1.微型化整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.联用仪器CE-MS；3.阵列毛细管凝胶电泳应用于人类基因DNA测序；5～10万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度1200碱基对/小时，提高速度！100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支二.经典电泳分析利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。一、HPCE基本原理BasicprinciplesofHPCE二、电渗现象与电渗流Electroosmosisandelectroosmoticflow三、影响电渗流的因素Factorsinfluencedelectroosmosis四、淌度Mobility五、HPCE中的参数与关系式ParametersandrelationinHPCE六、影响分离效率的因素Factorsinfluencedseparationefficiency第二节高效毛细管电泳理论基础BasictheoryofHPCE一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理BasicprinciplesofHPCE电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)三、HPCE中影响电渗流的因素factorsinfluencedelectroosmosis1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；仪器2仪器2二、药物分析Analysisofpharmaceutics检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物；