质粒构建流程

质粒构建 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1.RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4℃、漂洗液RW-20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。4℃，12000rpm离心10min。最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min吸附柱放入新EP管，加50μlRNasefreewater于膜上，室温放置2min4℃，12000rpm离心60s点样：5μlRNA+1μl10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。-20℃保存RNA反转录试剂盒：TaKaRaprimescriptRTreagentkitwithgDNAeraser（-20℃保存）准备：冰盒，=2\*GB3\*MERGEFORMAT②=4\*GB3\*MERGEFORMAT④=5\*GB3\*MERGEFORMAT⑤=6\*GB3\*MERGEFORMAT⑥取出解冻，=1\*GB3\*MERGEFORMAT①=3\*GB3\*MERGEFORMAT③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：基因组DNA去除（10μl体系）=2\*GB3\*MERGEFORMAT②5×gDNAeraserbuffer2μl=1\*GB3\*MERGEFORMAT①gDNAeraser1μlTotalRNA4μl(可根据RNA浓度调整)=6\*GB3\*MERGEFORMAT⑥RNasefreewater3μlPCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入反转录反应（20μl体系）=4\*GB3\*MERGEFORMAT④5×primerScriptbuffer24μl=3\*GB3\*MERGEFORMAT③primerScriptRTenzymemix=1\*ROMAN\*MERGEFORMATI1μl=5\*GB3\*MERGEFORMAT⑤RTprimermix1μl=6\*GB3\*MERGEFORMAT⑥RNasefreewater4μl1）反应液10μlPCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存PCR扩增PCR程序：95℃5min95℃30s56℃30s35cycle72℃1min72℃10min注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，循环数。高保真酶primerstar扩增，50μl体系如下：5×PSbuffer10μldNTP4μldH2O32.5μlPrimerstar0.5μlcDNA1μl(可变)R-primer1μlF-primer1μl点样：5μlPCR产物+1μl6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15minPCR产物纯化液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelutecycle-purespinprotocol(OMEGAbio-tek)D6293-01=1\*GB3\*MERGEFORMAT①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积bufferCP，混匀。=2\*GB3\*MERGEFORMAT②转移至HiBindMicroElutionDNA柱（套收集管），室温离心10000g，1min。=3\*GB3\*MERGEFORMAT③弃废液，加700μlDNAwashbuffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。=4\*GB3\*MERGEFORMAT④弃废液，重复=3\*GB3\*MERGEFORMAT③=5\*GB3\*MERGEFORMAT⑤弃废液，空管离心13000g，1min=6\*GB3\*MERGEFORMAT⑥柱子放入新EP管，加10-20μlElutionbuffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min=7\*GB3\*MERGEFORMAT⑦电泳检测割胶回收（产物电泳结果含杂带）=1\*GB3\*MERGEFORMAT①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。=2\*GB3\*MERGEFORMAT②加等体积（1g=1ml）bindingbuffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min=3\*GB3\*MERGEFORMAT③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次=4\*GB3\*MERGEFORMAT④弃废液，加300μlbindingbuffer（XP2），离心10000g，1min=5\*GB3\*MERGEFORMAT⑤弃废液，加700μlSPWwashingbuffer，离心10000g，1min=6\*GB3\*MERGEFORMAT⑥重复=5\*GB3\*MERGEFORMAT⑤=7\*GB3\*MERGEFORMAT⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管=8\*GB3\*MERGEFORMAT⑧加入30-50μlelutionbuffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min=9\*GB3\*MERGEFORMAT⑨电泳检测双酶切Vector12μl10×M/L/Kbuffer3μl3dH2O13μl酶A1μl酶B1μl30μl反应体系如下：PCR纯化产物15μl10×M/L/Kbuffer3μl3dH2O10μl酶A1μl酶B1μl反应条件：takara酶30℃水浴1h→65℃金属浴10min终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择，见附 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 连接双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl酶切产物液相纯化PCR产物6.3μlpcDNA3.10.7μl10×T4buffer2μlT4ligase1μl3dH2O10μl20μl连接体系（皆可）PCR产物5μlpcDNA3.12μl10×T4buffer2μlT4ligase1μl3dH2O10μlPCR仪中进行：22℃，30min→4℃冰箱过夜注：连接产物-20℃可长期保存转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃将感受态细胞置于冰上，待其融化超净工作台中，将连接产物10μl加入100μl感受态细胞，或质粒1-3μl加入100μl感受态细胞轻混匀，冰浴30min热击水浴42℃，45s，冰浴1min加900μlLB空培养基，摇菌150rpm，37℃，1h浓缩离心13000rpm，1min，上清液留约200μl重悬菌体，部分涂板（50-100μl）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h菌落PCRPCR程序：95℃5min95℃30s56℃30s35cycle72℃1min72℃10min注：程序与DNA扩增一样1）以rTaq酶50μl体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15μl，体系如下：3dH2O35.7μl10×buffer5μlMgCl23μldNTP4μlrTaq0.3μlR-primer1μlF-primer1μl灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16h。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。测序摇菌PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌三角瓶中分装10mlLB抗性液体培养基用10μl枪头挑起选择的菌落打到培养基中37℃。250rpm摇菌12-16h送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl80%灭菌甘油。再加入800μl箘液，轻混匀。液氮冻存。（一个基因冻2管即可）质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。试剂盒：AXYGENaxyprepplasmidminiprepkit250-prep操作步骤：取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min弃上清，加250μlsolution=1\*ROMAN\*MERGEFORMATI/RNaseA重悬菌落，混匀加250μlsolution=2\*ROMAN\*MERGEFORMATII，倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5min）加入250μlsolution=3\*ROMAN\*MERGEFORMATIII，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。室温离心13000g，10min上清液小心转入HiBindminiprepcolumn(有套管)，室温离心10000g，1min弃废液，加500μlbufferHB，室温离心10000g，1min选择性步骤：重复第7步弃废液，空管室温离心13000g，2min柱子转入新EP管，加30-50μlelutionbuffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min室温离心13000g，1min提取的质粒-20℃保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：菌种活化用接种环直接取冻存的E.coli/DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h挑单菌落转到2-10mlLB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h取1ml箘液加入到100mlLB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h检测箘液OD600≤0.5（0.3-0.4）感受态制备准备：0.1MCaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。步骤：将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min弃上清，0.1MCaCl210ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min弃上清，0.1MCaCl210ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀上清液取出8ml，剩2ml，加670μl80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀1.5mlEP管分装，每管分装100μl，液氮冻存。试剂配制：琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g1×TAE50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μlgoldview核酸染料，混匀，倒板电泳缓冲液TAE（50×）2mol/Ltris-碱242g1mol/L冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0)18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。用时稀释成1×溶液使用。LB培养基Yeastextract（酵母提取物）1gTryptone2gNaCl2gAgarpowder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。CaCl2（0.1M）CaCl21.47gH2O100ml