植物不对称体细胞杂交的研究进展

文章编号：1000-8551(20o3)06．442．05 核 农 学 报 2003，17(6)：442 446 Aeta AgriculturaeNucleatae Sin／t'a 植物不对称体细胞杂交的研究进展 李桂英 韩粉 霞 (1．中国农业科学院原子能利用研究 ，农业部农业核技术与航天育种重点实验室，北京 100094 2．中国农业科学院作物育种栽培研究所，作物遗传育种农业部重点实验室 ，北京 100081) 摘 要：本 文就 不对称体 细胞 杂交研 究的方 法，不对称 体细胞 杂种 的形 态学、细胞 学、同工酶分 析及分子生物学等方面的研究进行 了综述。 关键词：原生质体培养 ；细胞 融合 ；不对称体 细胞 杂种 ADVANCE IN ASYM IETRIC SOM ATIC HYBRID【ZATION IN PLANTS LI Gui．ying HAN Fen—xia2 (1．Key Laboratory ofAgricultural Nuclear Technology＆Aerospace Breeding，Ministry ofAgriculture，Institutefor of Atomic Energy ，CAAS，Beijing 100094；2．Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding ，Ministry ofAgriculture， Institute of Crop Breeding and Cultivation，CAAS Beijing 100081) Abstract：Procedures of asymmetric somatic hybridization and morphological，cyt010舀cal and molecular studies of asymmetric hybrids wel'e reviewed in this paper． Key words：pmtoplast culture；cell fusion；asymmetric somatic hybrid 不对称体细胞杂交即指利用射线将供体原生质体钝化，并破坏其染色质，与未经辐照的受体原生质 体融合。由于所得融合产物含全套受体染色体及部分供体染色体 ，故称不对称体细胞杂种 ，这类体细胞 杂交称为不对称体细胞杂交 ，亦有人形象地称为 了或 ．)(融合。 l 问题 的提出 在原生质体技术发展初期 ，人们试图通过原生质体融合将两个亲缘关系较远的物种的基因组结合 在一起 ，创造 新 的植物类型 。典型 的例子是 马铃薯 与番茄的原生质体融合 。然 而 ，两者融合虽得 到再 生植株，但未能如期望地那样 ，而是外形倾向于番茄植株，花和叶具杂种特点，结实畸形，地下未形成块 茎。其它研究也有类似情况，获得的体细胞杂种不仅没有把双亲的优点结合起来 ，甚至失去了它们各 自 原有的有益特性。如果只将异源种属中的少数或几个有用染色体或片段导入受体细胞，就有可能改善 杂种育性而不致含过多不需要的性状。Phaduivk等 建议用超致死剂量辐照供体细胞或原生质体，使 其染色体被击成“小片段”，然后与一个正常受体细胞或原生质体融合。在部分同源的适宜条件下发生 重组 ，使供体染色体碎片“掺入”受体染色体中，从而形成具有受体整套染色体组 ，而仅有少量供体染色 体片段的不对称杂种。近些年 ，诱导植物不对称杂种已成为原生质体培养和融合技术研究的热点。 2 供体原生质体的辐照处理 在细胞融合前，用超致死剂量射线辐照供体原生质体 ，钝化供体原生质体的核，并打碎其染色质。 辐 照剂量因物种不同差异很大 ，一般在 100—1000Gy。如 Gupta 等用 150Gy辐照 Physalis minima原生质 收藕 日瓤：收稿 日期 ：20o2—02-20 作者■介：李桂英(1964 )，男，河北卢龙人，副研究员，博士，从事作物诱变育种研究。现工作单位 ：中国农科院作物科学研究所。 维普资讯 http://www.cqvip.com 6期 植物不对称体细胞杂交的研究进展 443 体与 Datura innoxia融合，获得了仅含 3条供体染色体的不对称体细胞杂种。Bates等 用 100 Gy辐照 蓝茉莉叶烟草原生质体与普通 烟草原生质体融合 获得 了含 1条供体染色体 的不对称体细胞杂种。 Forsberg等㈦在进行 Brassica napus与Arabidopsis thaliana不对称体细胞杂交时使用了 70、800、1350 Gy 3 个剂 量 ，结果 1350 Gy对获 得不对称杂种最有效 。 3 不对称体细胞杂种的选择 为筛选带供体基因的融合产物 ，需要一套选择系统。BatesH 研究普通烟草与蓝茉莉叶烟草(Ⅳ． plumbaginifolia)种间不对称体细胞杂交时，利用双亲对抗生素抗性的差异，蓝茉莉 叶烟草抗卡那霉素 (Km )，蓝曙红反应 阳性 (Nop )，普通烟草 为野 生型 ，融合后 即可依杂种 的抗性进行 选择 ，只有存在携 带 Km'／Nop 染色体(或片段)的植株才能存活。Gleba 研究蓝茉莉叶烟草与颠茄(Atropa．belladonna)不对 称体细胞杂交时 ，利用代谢突变体为材料，受体为硝酸还原酶缺失突变体，依据硝酸还原酶的补偿性选 择杂种。有人n 利用白化或叶绿素缺失突变体作受体，以愈伤组织有无叶绿素为选择标记 ，将绿色愈 伤组织再生植株，经鉴定为不对称体细胞杂种。一些人 “ 利用融合产物的再生能力来选择，受体已失 去再生能力 ，供体经高剂量辐照后也失去增殖能力，融合后再生的植株很可能是不对称杂种。Matibiri 等n 利用钝化供受体结合融合后选择的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，将 N．s／／zl'oeo／e／l~Leh的细胞质雄性不育性转移到普通烟 草中，用碘乙酰氨(IOA)钝化受体原生质体，用 射线钝化供体原生质体，受体为新霉素磷酸转氨酶基 因的转化系，供体为叶绿素突变，抗放射壮观素(spectinomycin)，融合后根据核编码基因(新霉素磷酸转 氨酶基因)标 记 ，对放射壮观素 的抗性及 愈伤组织 的颜色进 行选 择 。Samoylov 在进行 番茄 与茄子不 对 称体细胞杂交时 ，供体抗卡那霉素 ，但辐照使之钝化，不能分裂，而受体对卡那霉素敏感 ，只有具受体全 套基因组和供体抗卡那霉素基因杂种才能在含卡那霉素的培养基上生长。 4 不对称体 细胞杂种 的形态学 通过受体原生质体与经辐射钝化的供体原生质体融合获得的不对称杂种在形态上 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现几个特征： (1)整体畸形 ，花药无花粉或花粉无生活力；(2)许多性状介于双亲之间，但倾向于受体 ；(3)极端 的不对 称杂种与受体极为相似甚至一致。Bates 进行了普通烟草和蓝茉莉叶烟草的不对称体细胞杂交 ，得到 了 101株再生植株，其中46株与普通烟草相似或一致；55株倾向于普通烟草，但畸形 ，花药皱瘪无花粉。 Yamashita_l 研究了 22株甘蓝(Brassica oleracea)与白菜型油菜 (B．campestris)间的不对称体细胞杂种，9 株与受体相似 ，13株表现双亲中间型。Sjodin等 得到了 B．napus与 B．jun~ea、B．nigra、B．carrinata 之间 的不对称杂种 ，并与其对称杂种进 行 了比较 ：对称杂种形态介 于双亲之 间 ，而不对称杂种变异很 大 ， 植株矮 ，大部分不对称杂种的叶形与双亲及对称杂种不同，有 5株形态与受体相似。Kyozuta等Ⅲ 利用 辐射结合细胞融合将籼稻的细胞质雄性不育性转移到了粳稻受体中，获得了新型细胞质雄性不育系，共 获得 16株再生植株 ，生长正常 ，形态与受体几乎没有差别 ，均开花，15株结实，l株完全不育，但用受体 植株 花粉授 粉结实很好 ，自交不育 ，回交 可育 ，说 明籼稻 的细胞 质雄性 不育性 转至粳 稻。 5 不对称体细胞杂种 的细胞学研究 5．1 不对 称体 细胞 杂种的染色体组成 为研究不对称体细胞杂种的不对称性 ，不少作者对其获得的不对称体细胞杂种进行了染色体组成 分析。结果(表 1)表明，不对称体细胞杂种的染色体组成复杂。大致可分为以下几种：(1)含全套受体 染色体 ，供体染色体全部消失 ，仅转移了细胞器n ；(2)含全套受体染色体及少量几条供体染色体， 供体大部 分 染 色体 丢失n ；(3)含 全套 受 体染 色 体及 多 条供 体 染 色体，少量 供 体染 色体 消 失n ∞ ；(4)混倍性 ，染色体组成紊乱 ，无规律性 ， ；(5)受体染色体多倍化 ¨ 。研究还发现，不 对称杂种中存在大量染色体断片，微小染色体及重排染色体。 维普资讯 http://www.cqvip.com 444 核 农 学 报 17卷 5．2 不对称体细胞杂种 中供体染 色体 消失的程度与辐照剂量的关 系 高剂量辐照使染色体断裂，产生许多染色体片段、微小染色体等，在有丝分裂过程中，部分染色体消 失。关于辐照剂量与染色体消失程度 ，不 同作者 的研究结果不 同 ，大致可 以归结为 3种情况 ：(1)染 色体 的消失程度与辐 照剂量没有关 系 。Gleba等 进行 N．plumbaginifolia+Atropa belladonna不对 称体细胞 杂交研究 发现 ，辐照供体染色体 消失 的程 度与辐 照 剂量无 明显 相关 ，100、lO00Gy处 理得 到的杂 种均具 有相当多的供体染色体 ，而不对称程度在同一剂量不同无性系间差异很大，因此认为辐照不能控制特异 染色体的消失 ，并认 为染 色体消失不是 由于或至少不仅是 由于 y射线 的作 用 。Xu等 对 S．tuberosum 与 S．brev／dens不对称杂交研究认 为 ，辐照 剂量与染 色体 消失程度无 明显相关 。Rasmussen等 也认为辐 射导致染色体消失 ，但无 剂量效应。(2)与辐照剂量有关 ，但剂量效应不 明显 ，染色体 的消失还与供 受体 的亲缘关系及体细胞不亲和程度 有关。Famelaer等 ¨在进行 N．plumbaginifolia+N．sylvestris不 对称体 细胞杂交研究时发现 ，500、1000Gy辐照均转移了相当部分的供体染色体，说明辐照剂量效应不明显 ，尽 管如此 ，仍 可见有限的剂量效应。Hinnisdaels等 通过 N．plumgaginifolia与 Petunia hybrida不对称 体细 胞杂交的研究认为 ，辐 照可诱发染色体消失 ，但 不存 在 明确 的剂量效应 ，说 明染 色体 的消失不 仅是射线 的作用。Feher等 认为单独辐照不足以诱发染色体消失而产生高度不对称杂种，染色体消失很可能 维普资讯 http://www.cqvip.com 6期 植物 不对称 体细胞 杂交 的研 究进展 在很大程度上受体细胞不亲和性的影响。(3)与辐照剂量明显相关。Melzer和 O’C。 IIE30,31 利用马铃 薯与番茄为试验材料，研究了不对称杂种的产生及其不对称程度的辐照剂量效应，发现辐照供体核 DNA转到受体的数量与辐照剂量成反比。Forsberg等b 对 Brassw口napus与Arabidopsis thaliana不对称体 细胞杂交研究表明，辐照剂量与不对称程度显著正相关，所用 70、800、1350Gy 3个剂量 中，1350 Gv获得 的杂种不对称程度最大。综上可以认为 ，供体染色体的消失程度既与辐照剂量有关 ，也与供受体之间的 亲缘关系、体细胞不亲和性程度有关。 6 不对称体细胞杂种的同工酶及分子生物学研究 同工酶分析已广泛应用于细胞杂种鉴定。不对称体细胞杂种通常表现为部分同工酶为双亲杂种 带 ，另一部分表现为双亲之一特征带 。Gleba等 对 50个蓝茉莉叶烟草与颠茄的不对称体细胞杂种 进行了酯酶、淀粉酶、天门冬氨酸基转氨酶同工酶分析，仅 3个系含一些供体天门冬氨酸转氨酶同工酶 分子。Yamashita等 分析了甘蓝与白菜型油菜不对称杂种的酯酶、亮氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶 同工 酶谱 。结果表明 ，一些 杂种失去 了 白菜 型油菜 的 3种酶 的特异带 ，却保 留了甘 蓝特异带 ，22株 中 10株表 现 3种酶的特异带 ，10株失去了供体酸性磷酸酶的特异带，1株失去了供体所试 3种酶的特异带 ，表明 不对称体细胞杂种中消失了一些供体染色体 Bauer-weston等 通过同工酶(过氧化物酶、酯酶、葡萄糖 磷酸变位酶)分析了 Arabidopsis thaliana与甘蓝型油菜不对称体细胞杂种的不对称性 ，这 3种酶均清楚 地显示了杂种带。刘宝等 分析了普通烟草与波缘烟草(N．undulata L)不对称体细胞杂种的苹果酸脱 氢酶和酯酶同工酶谱 ，发现对苹果酸脱氢酶 ，5个杂种细胞无性系均表现 出受体普通烟草的特征酶带； 对于酯酶，5个杂种细胞无性系除均具普通烟草特征酶带外 ，3株还表现出供体烟草的全部酶带 ，2株只 表现供体部分酶带。Imamura等 利用斑点印迹法分析了普通烟草与天仙子(Hyoscyamus muticus)间不 对称体细胞杂种 中供体基 因组的相对含量，证 明辐照显著降低 了供体染色体 DNA的数量。Piastuch 等 对普通烟草与蓝茉莉叶烟草的不对称体细胞杂种进行了分析，利用种特异重复 DNA作探针进行的 斑点印迹杂交表明，一些杂种仅含 1％一5％供体 DNA，而另一些杂种含 15％ 一25％供体 DNA；原位杂交 分析表明，极端的不对称杂种仅滞留 1条供体染色体；具有较高斑点印迹值的杂种含 8—12个供体染色 体和片段；原位杂交还揭示所研究 的 8个杂种 中，有 3个 杂种存在染 色体 易位。Bonnema等。加 对 Lycopersicon esculentum +L．pennelli不对称体细胞杂交所得再生植株进行了核基因、叶绿体基因组和线 粒体基因组 RFLP分析，结果发现 ，所有再生植株均为细胞质杂种(Cybrid)，未探测到供体核遗传信息 ， 所有细胞质杂种均含不同数量的供体线粒体 DNA。Rasmussen等 和 Samoylov ‘ 利用 RAPD有效检测 了杂种中供体 DNA量 ，揭示了杂种的不对称性。其他作者 。’ 驯等也都对各 自获得的不对称体细 胞杂种进行了分子生物学研究，证实了所得植株的杂种性 ，并揭示了不对称程度。 致谢 ：本文 承王琳 清 、施 巾帼 两位 先生 审阅 ，谨 致谢 意 ! 参考 文献 ： 【1] Melchzer G，et a1．Somatic hybrids plants of potato and regenerated from fused protoplast，Carlsberg Res Comm，1978，43：203—218 [2] Phaduivk KH，Leenhous MP．The molecular theory of radiation biology，Springer-Verlag．Berlin，Heide．NY，1977，204—207 [3] Gupta，PP，et a1．Intergeneric nuclear gene transfer between somatically and sexually incompatible plants through asymmetric protoplast fusion，Mol Gen Genet 1984．197：30 —35 [4] Bates，G W，et a1．~ymmetric 加^蒯 凡in Nicotiana by fusion of irradiated protoplasts，Theor．App1．Genet．1987，74：718—726 [5] Forsberg J，et a1．Comparison of UV light，X—ray and restriction enzyme treatments 8s tools in production of asymmetric somatic hybrids between Brassioa，‘印 andArabidopsisthaliana，TheorAppl Genet，1998，96：I178—1185 【6] Gle ．YY，et a1．Intergeneric asymmetric hybrids between Nicotianaplumbaginifolia and Atropa 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