2011年最新973标书-立项

项目名称： 恶性肿瘤发生、发展的细胞表观遗传机 制 首席科学家： 北京大学 起止年限： 2011.1 至 2015.8 依托部门： 教育部 二、预期目标 总体目标： 本项目瞄准表观遗传学研究的前沿，整合国内优秀研究人员，系统深入地开 展恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的表观遗传学研究。本项目的总体目标如下：阐 明表观遗传关键 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 即 DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码 RNA 对基因表达调 控的影响；明确表观遗传调控在乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移中的作用；揭 示 EMT 过程中的表观遗传学变化及细胞重编程机制；阐明细胞微环境在肿瘤转 移中的作用及机制；整合各种信息数据，描绘乳腺癌、肺癌发生发展及侵袭转移 的分子调控网络。通过本项目的实施，建立和完善表观遗传学研究的新的技术体 系，实现我国在生命科学及医学研究领域的理论创新，为恶性肿瘤预警、诊断、 治疗和药物筛选提供新思路、新途径和新靶标，发现几个潜在的可以用于乳腺癌、 肺癌诊断的分子标志物及药物治疗的分子靶标，并在本项目的实施过程中建立一 支具有国际竞争力的研究团队。 五年预期目标： 1、 发现一批新的组蛋白修饰因子，探明组蛋白修饰与 DNA 甲基化之间相互作 用的分子机制，筛选一批肿瘤相关 ncRNA，鉴定一批具有潜在临床应用价值 的肿瘤诊断及治疗的新的 ncRNA 分子靶标；鉴定一批新的 EMT 关键调控因 子；发现针对转移型乳腺癌、肺癌的新的有效治疗靶点。 2、 建立一整套适应于恶性肿瘤表观遗传学研究的技术平台和技术体系。 3、 培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50 名以上、 博士后 12 名以上。 4、 在国际一流杂志（IF>10）发表 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 8 篇以上，在有影响力的杂志（IF>5）上 发表论文 25 篇以上。 三、研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 本项目分为六个课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，将全面系统地研究乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移 的表观遗传机制，为乳腺癌和肺癌的预防、诊断、治疗提供分子标志及药物靶标。 前三课题分别从 DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA 三个不同角度，分析 肿瘤发生发展及侵袭转移中表观遗传学改变，研究其相互之间的作用关系及分子 调控机理；第四课题将对肿瘤转移过程中非常重要的现象即上皮－间质转换的细 胞重编程机制进行探讨；第五课题从肿瘤微环境的角度，探讨肿瘤微环境中基质 细胞及细胞因子对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响；第六课题整合所 有的信息，描绘乳腺癌和肺癌发生发展及侵袭转移的分子调控网络。 六个部分各有侧重，又紧密衔接，团结合作，互相促进。 课题一：DNA 甲基化变化在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 本研究将筛选肿瘤细胞中高甲基化并失活的基因并分析其启动子区域组蛋 白的修饰状况，探讨 DNA 甲基化与组蛋白修饰的先后关系。筛选出影响 DNA 甲基化酶和 DNA 结合的关键性因子或蛋白；明确相关关键性因子或蛋白与 DNA 甲基化酶及 DNA 结合蛋白作用的分子机制，进一步明确特定基因发生 DNA 甲 基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰与 DNA 甲基化相互作用的分子机制。另 外在肿瘤组织，CBX7 等 PcG 蛋白的正常组合关系被破坏，并且这种 PcG 蛋白 组合紊乱与肿瘤相关基因失活之间可能存在因果关系。本研究还将以多种器官的 正常组织和肿瘤组织为对象，了解正常组织细胞中 PcG 蛋白的正常组合关系， 研究这种正常组合关系破坏与肿瘤发生的关系及其与肿瘤相关基因组蛋白修饰、 核小体定位和 DNA 甲基化发生的关系。表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和 获得多能“干性”方面发挥关键性作用，也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭 /转移能力的物质基础。本研究将在开展肿瘤转移相关 DNA 甲基化组学研究的基 础上，筛选并鉴定出影响肿瘤细胞转移能力的关键性 DNA 甲基化变化位点及其 网络，了解其在癌细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测恶性肿瘤转移 能力的表观遗传分子分型体系。总体研究方案如下： 课题负责人：朱卫国，北京大学 学术骨干：邓大君，北京大学 伍会健，大连理工大学生命科学与技术学院 课题二：组蛋白修饰异常在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 本课题将常规方法和高通量技术相结合，从筛选乳腺癌和肺癌中新的组蛋白 修饰调控因子及其复合物出发，逐步揭示所获得的候选基因对于组蛋白修饰的作 用和调控机理，并进一步阐明这些基因在调控肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 及其机制。将以功能基因组学和蛋白质组学的方法筛选乳腺癌和肺癌中发生突变 或者表达异常的组蛋白修饰酶以及转录因子，同时针对 MLL1 等相关的甲基化 酶复合物组分，LSD1 等去甲基化酶、EYA 去磷酸化酶和磷酸化激酶、转录因子 Smad4 和 ER 及其转录辅助因子等，筛选新的组蛋白修饰基因或 miRNA，利用 各种蛋白质间相互作用方法验证筛选获得的组蛋白修饰复合物中各成员间的相 互作用。利用基因过量表达和敲低/敲除技术、基因突变技术、组蛋白甲基化、 磷酸化和乙酰化分析、ChIP-seq 等技术检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋白修饰 和基因表达的影响及其在基因表达调控中的分子机制。在此基础上，利用动物模 型和临床标本对组蛋白修饰候选因子在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用做深 入分析。总体研究方案如下： 肿瘤DNA甲基化组和应用研究 DNA甲基化形成机制研究 代表性肿瘤及非瘤组织标本收集 >500例 肿瘤DNA甲基化组测定启动子 芯片 基因功能分析生物信息学分析 确定肿瘤发生/转移/侵袭相关 的甲基化网络 验证研究：大样本患者随访、 模式动物 建立肿瘤转移能力的DNA甲基 化分型体系 RLGS/MeDIP/Promoter array等方 法分析肿瘤基因组甲基化谱式 分析肿瘤细胞中异常甲基化的启 动子区域组蛋白修饰的状况 筛选影响DNMT和DNA结合 及组蛋白修饰的关键蛋白 探讨关键蛋白活性和 自身修饰的变化 明晰特异基因发生DNA甲基化 的分子机制和组蛋白修饰调控 DNA甲基化的分子机制 探明关键蛋白与DNMT和DNA 结合蛋白相互作用的分子机制 课题负责人： 学术骨干： 课题三：非编码 RNA 在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用 研究 ncRNA 作用机制的一个关键就是鉴定与之相互作用的靶分子，特别是 蛋白分子。本课题将以乳腺癌细胞系、肿瘤组织、肿瘤启动细胞为模型，利用自 主建立的 RNA-SELEX-seq 技术平台系统地发现和鉴定与肿瘤相关蛋白（特别是 其中的转录因子和表观修饰酶）发生相互作用的 ncRNA；还将采用不同大小的 ncRNA 的 cDNA 文库（size-fractioned RNA library）鉴定肿瘤启动细胞特异的 ncRNA。采用球囊形成实验、二维平皿及三维 Matrigel 培养以及免疫缺陷鼠体内 种植和肿瘤组织等研究体系，系统深入地研究 ncRNA 和蛋白间的相互作用、它 们所构成的结构网络、调控网络、以及这些相互作用的生理功能，剖析 ncRNA 调控网络在肿瘤发生发展进程中的作用与意义。与此同时，选择其中一些有重要 功能的 ncRNA，结合大量的肿瘤患者的标本及临床资料，研究将其作为药靶或 生物标记物的可能性。 组蛋白修饰异常机制与肿瘤发生发展 筛选新的组蛋白修饰复合物/因子 甲基化酶、磷酸酶、Smad4 和 ER 转录因子等 相互作用 分析 组蛋白修饰 分析 靶基因表达 分析 建立肿瘤发生发展侵袭转移相关的组蛋白 修饰网络 高通量芯片、酵母双杂交、免疫沉淀-质谱 课题负责人： 学术骨干： 课题四：上皮－间质转换的机理及恶性肿瘤侵袭转移的细胞重编程机制 以乳腺癌细胞系、肿瘤组织及癌旁正常组织为模型，探讨 EMT 的细胞重编 程作用机理及其在乳腺癌转移及化疗药物耐受中的作用。选取永生化的正常乳腺 细胞系（如 MCF-10A），ER 阳性低转移性细胞系（如 MCF-7，T47-D 等），ER 阴性高转移细胞系（如 MDA-MB-231，SUM1315 等），以及 ER 阳性但对三苯氧 胺耐药的 BT-474 细胞等为主要细胞模型，并通过 lentivirus 介导的 shRNA 抑制 或过表达 E-cadherin 在这些细胞系中分别诱导或抑制 EMT 表型。比较不同细胞 系在 EMT 前后其基因表达谱变化，用 MeDIP-seq 法比较基因组范围内 DNA 甲 基化变化情况，并用 ChIP-seq 法比较与转录相关的主要的组蛋白修饰标志如激 活性的组蛋白乙酰化、H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9，H3K27，H4K20 甲基化 等在全基因组范围内的分布变化规律。在此基础上，对差异表达的新基因及特异 性组蛋白修饰酶在 EMT 以及在乳腺癌转移及药物耐受中的作用做深入分析。同 时，选取两种以上高转移性细胞系，以 TGF或 TNF刺激细胞或稳定转染 -catenin 分别激活 TGF、NFB 以及 Wnt 信号通路诱导 EMT。用基因表达谱、 蛋白质谱及全蛋白磷酸化谱分析在三种条件下共同变化的靶基因及蛋白分子。这 些共同通路分子是各信号通路间的交互作用节点及潜在的 EMT 关键调控因子， 非编码 RNA 与肿瘤发生发展研究 肿瘤相关蛋白结合的 ncRNA 的研究 阐明 ncRNA-蛋白调控网络与肿瘤发生发展 的关系 RNA-SELEX-seq 技 术平台鉴定与肿瘤 相关蛋白结合的 Size-fractioned RNA library 鉴定肿瘤启动 细胞特异 ncRNA 探讨 ncRNA-蛋白相互作用及对相关信号通 路的调控 利用体外培养、免疫缺陷小鼠肿瘤移植、肿 瘤病理组织检测等进行功能研究 对它们的作用机理进行进一步细胞及分子水平上的分析。建立可诱导表达荧光标 记的 E-cadherin 或其它 EMT 诱导因子的稳定转染细胞系，以在细胞及分子水平 上实时观察细胞内外环境的改变对 EMT 及细胞转移能力的影响。总体研究方案 如下： 课题负责人： 学术骨干： 课题五：细胞微环境与肿瘤的发生发展及侵袭转移 以乳腺癌为模型，分别从肿瘤细胞微环境中的肿瘤相关成纤维细胞、浸润的 免疫细胞（肿瘤相关性巨噬细胞）和基质分子（细胞因子 TGFβ）入手，研究肿 瘤微环境对肿瘤细胞生物学行为尤其是侵袭转移的影响。分离乳腺良性增生患者 及各种不同类型不同分期的乳腺癌患者组织微环境中的成纤维细胞及肿瘤相关 性巨噬细胞，分析 miRNA 及 mRNA 的表达谱；研究这些差异表达的基因或 miRNA 对成纤维细胞及肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；建立三维细胞培养模型， 将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境，并应用免疫分子及免疫细胞 缺陷小鼠构建小鼠骨髓嵌合体动物模型，研究这些差异表达的基因或 miRNA 对 上皮－间质转换的机理及表观遗传机制 建立低转移性、高转移性乳腺癌细胞系及人 工改变E-cadherin水平诱导或抑制EMT后的 细胞系 寻找高转移性乳腺癌及对现有化疗药物不敏 感性的乳腺癌的治疗靶点 基因表达谱 差异 ChIP-seq检测主要转 录相关组蛋白修饰 差异表达基因总体特征分析 新基因功能分析及特异性组蛋白修饰酶在 EMT中的作用 功能域分析； 质谱检测并 验证相互作 用蛋白；靶基 因检测；与已 知EMT基因 病毒介导的 稳定过表达 及shRNA抑 制候选基因 后，细胞表型 及小鼠乳腺 癌转移模型 的行为变化 MeDIP-seq检测 DNA甲基化变化 以TGF或TNF刺激细胞或稳定转 染-catenin分别诱导癌细胞发生EMT 蛋白质 谱差异 磷酸化修饰蛋 白质组学差异 共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影响；采用基因工程小鼠模型，从分子、细胞、 动物三个层面研究 TGFβ 信号通路在肿瘤微环境中与 REG蛋白酶体激活因子、 p53 等重要肿瘤因子动态相互作用及其动态调控的分子机制。在解析这些调控机 制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步阐明肿瘤微环境中重要生 物学因子对肿瘤发生发展的决定性作用。具体方案如下： 课题负责人： 学术骨干： 课题六：恶性肿瘤发生发展及侵袭转移的分子调控网络 利用肿瘤基因表达和表观遗传学数据，采用计算生物学方法推测在恶性肿 瘤、干细胞中发生变化的表观遗传学调控网络。为了更深入地研究肿瘤发生发展 过程的分子调控网络，还需要从以下几个方面进一步发展基于贝叶斯网络的因果 推断方法。（1）考虑到实验方法与手段的多样性，需要开发能够自动整合并利用 多个异质实验数据的因果推断方法。这部分工作涉及去除反映单个数据源自身特 征的背景信号，子网络的拼接与集成，观测型实验数据与(基因敲除、RNA 沉默 等)干预型实验数据的因果信息集成等多个问题；（2）通过开发根据数据特征自 适应地调整网络正则化参数的学习算法等方式，以解决如何在具有较高噪声和不 mRNA及miRNA表达谱分析 正常乳腺组织及不同类型的乳腺癌组织 建立基质细胞与 肿瘤细胞的三维 细胞培养模型 明确基质细胞的基因/miRNA对肿瘤转移的影响 肿瘤相关成纤维细胞原代培养 TGFβ信号通路/REG-蛋白酶体 动物水平 Smad2 亚等 位基因表达 小鼠模型 阐明REG-蛋白酶体与TGFβ信号 通路间的相互作用 细胞微环境与肿瘤发生发展及侵袭转移 基质细胞、细胞因子在肿瘤发生发展中的作用 分子、细胞水平 基因/miRNA 的功能研究 基因敲除 建立肿瘤与细胞微环境网络体系 肿瘤相关性巨噬细胞 免疫缺陷 小鼠骨髓嵌合体 动物模型构建 精确性的系统生物学实验数据中进行可靠因果推断的实际问题。对于大规模因果 推断问题，使用现有的贝叶斯因果推断方法，还面临有限的数据资源与急剧增大 的网络搜索空间的矛盾。为了保证学习结果的鲁棒性，我们拟开发一系列能保持 因果关系的特征选择方法来解决这个问题。（3）不同系统生物学因素之间的上下 游作用关系可能会随肿瘤发生与发展的过程而动态地发生变化，为此我们拟开发 能够正确推断这种动态关系的贝叶斯网络学习算法。因为肿瘤细胞有很多具有干 细胞特性，且目前所掌握的胚胎干细胞数据比肿瘤数据更丰富也更系统,我们将 在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络，并进一步比较其异 同。通过干扰预测的上游调控节点后以 ChIP-PCR 和 ChIP-seq 技术对下游节点进 行检测，对以上预测模型中的关键调控关系进行验证。为了通过实验验证贝叶斯 网络模型推测出来的因果关系，我们将把它们作为遗传学的上下游关系处理。这 样就可以人为地提高或降低上游事件的水平，例如，转录因子结合或者其他组蛋 白修饰水平，而后观察下游事件，如基因表达，或者组蛋白或 DNA 修饰的水平 的变化，来证实我们所预测的因果关系。以组蛋白甲基化修饰作用为例，甲基化 转移酶和去甲基化酶是可用于干扰网络中的特定节点。譬如我们要证实 H3K27me3 抑制基因表达这一关系，我们可以通过抑制正常细胞或者癌细胞的组 蛋白甲基化转移酶或者去甲基化酶来调节 H3K27me3 水平，从而观察下游基因 表达水平的变化（图 2）。实际上，一些已报道的因果关系正是利用上述方法和 遗传突变在模式生物或细胞实验中发现的。验证转录因子对某种组蛋白修饰的作 用可以通过过表达或者 RNAi 转录因子来直接观察到。我们将通过过表达或者 RNAi 分别上调或者下调转录因子，然后利用 ChIP-qPCR 技术检测一些已知的 修饰位点或者利用 ChIP-seq 技术在全基因水平检测转录因子对全基因组范围内 组蛋白修饰的影响。 图 2：如何通过干扰上游调控节点并以 ChIP-PCR 和 ChIP-seq 技术 检测下游基因验证预测模型中的关键调控关系 具体方案如下： 课题负责人： 学术骨干： 染色质与组蛋白的多种表观遗传学修饰 关键转录因子与基因的调控关系 转录因子的ChIP-seq实验 基因表达谱差异 分析 染色质构型分析 表观遗传因子ChIP-seq实验 绝缘子的基因组分布 表观遗传因子的基因组分布 转录因子的目标 基因分布 染色质空间形态与DNA、组蛋白修饰 的因果调控网络 关键转录因子与目标基因的调控网络 多 因 素 SNP 与 GWAS分析：鉴 定肿瘤发病相关 的重要基因突变 相互关系 恶性肿瘤发病因素预测的因果网 络模型 RNAi与基因敲 除研究：验证肿 瘤发病相关转 录因子与基因 的影响范围 恶性肿瘤高通量数据的整合与网络的计算预测 四、年度 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 研究内容 预期目标 第 一 年 1）多种手段研究肺癌细胞肿瘤抑制 基因甲基化状况，开展肿瘤转移 相关 DNA甲基化标志物研究；开 展 PcG蛋白表达变异与肿瘤抑制 基因表观遗传失活关系研究； 2）利用高通量芯片、ChIP-Chip、 ChIP-seq、酵母双杂交、免疫沉 淀结合质谱等技术，针对 TGFβ 和雌激素信号通路相关因子，如 转录因子 Smad4、ER及其转录辅 助因子，筛选新的组蛋白修饰基 因或 miRNA； 3）利用 RNA-SELEX-seq等技术平台 系统筛选鉴定与肿瘤相关蛋白相 互作用的 ncRNA；检测 ncRNA的 表达谱； 4）诱导或抑制 EMT表型。比较不同 细胞系在 EMT前后其基因表达谱 变化，用 MeDIP-seq法比较基因 组范围内 DNA甲基化变化情况， 并用 ChIP-seq法比较与转录相 关的主要的组蛋白修饰标志如激 活性的组蛋白乙酰化、H3K4甲基 化，抑制性的 H3K9，H3K27，H4K20 甲基化等在全基因组范围内的分 布变化规律。 5）分离乳腺良性增生患者及乳腺癌 患者微环境中的成纤维细胞、浸 润巨噬细胞、浸润的单核巨噬细 胞，分析miRNA及mRNA的表达谱， 研究不同类型的乳腺癌以及不同 侵袭转移能力的乳腺癌中上皮细 胞与间质细胞的表达谱差异； 6）开发能够自动整合并利用多个异 质实验数据的因果推断方法。包 括去除反映单个数据源自身特征 的背景信号，子网络的拼接与集 成，观测型实验数据与(基因敲 1）找出有代表性的肿瘤抑制基因， 分析甲基化谱，筛选出一组肿瘤 转移相关 DNA甲基化标志物；掌 握肿瘤组织中多种 PcG蛋白表达 变异规律； 2）获得新的组蛋白修饰组分； 3）筛选出一批肿瘤相关的 ncRNA； 并确定 ncRNA及相关蛋白的表达 谱； 4）优化 EMT表型诱导条件，完成基 因表达谱及 MeDIP-seq， ChIP-seq法比较 DNA甲基化及主 要组蛋白修饰谱变化实验； 5）发现与肿瘤发生发展和转移相关 的不同间质细胞的表型特征，以 及一些重要的免疫相关蛋白、间 质细胞中miRNA及mRNA的表达改 变； 6）建立能够自动整合并利用多个异 质实验数据，适用于大规模高噪 声的组学数据的因果推断方法， 并开发为计算软件。 研究内容 预期目标 除、RNA 沉默等)干预型实验数 据的因果信息集成等多个问题。 第 二 年 1）分析围绕甲基化基因启动子周围 的组蛋白修饰状况，开展核小体 在 DNA甲基化扩展过程中的作用 研究；开展肿瘤转移相关甲基化 标志物多中心验证研究； 2）利用免疫共沉淀、GST pull-down、细胞内共定位等蛋白 质间相互作用技术验证筛选获得 的组蛋白修饰复合物中各成员间 的相互作用，定位相互作用的结 构域/区域。 3）研究筛选到的 ncRNA与蛋白质、 DNA或 RNA等生物大分子的相互 作用； 4）对克隆得到的新的潜在 EMT调控 因子用分子生物学及细胞生物学 的手段进行功能分析； 5）通过基因过表达或敲降的方法， 研究差异表达的基因或 miRNA对 成纤维细胞、巨噬细胞及肿瘤细 胞的生物学行为的影响，尤其是 肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 1）探明组蛋白修饰与甲基化 DNA之 间的关联性，证明核小体在 DNA 甲基化扩展过程中的作用； 2）明确组蛋白修饰复合物中各成员 间的相互作用及其相互作用方 式； 3）初步确定 ncRNA的作用靶点，特 别是与蛋白的相互作用； 4）发现一些新的潜在 EMT调控因 子； 5）发现几个间质细胞来源的与肿瘤 发生发展和转移密切相关的新的 分子； 6）建立能够自动进行因果关系的特 征选择方法，并开发为计算软件。 探索推断肿瘤发生与发展动态关 系的方法； 7）发表5-6篇IF>5的研究论文,1-2 篇 IF>10的研究论文。申请专利 1-2项。 研究内容 预期目标 6）对于大规模因果推断问题，使用 现有的贝叶斯因果推断方法，还 面临有限的数据资源与急剧增大 的网络搜索空间的矛盾。为了保 证学习结果的鲁棒性，我们拟开 发一系列能保持因果关系的特征 选择方法来解决这个问题。 第 三 年 1） 研究影响 DNA甲基化和组蛋白修饰 的关键酶，找出连接甲基化与组蛋 白的蛋白。在不同病变人体组织中 肿瘤转移相关基因 DNA 甲基化形 成、扩展和维持规律研究； 2） 利用基因过量表达和敲低/敲除技 术、组蛋白修饰等分析技术检测组 蛋白修饰因子对组蛋白修饰的影 响及不同修饰间的相互影响。检测 组蛋白修饰候选因子对 TGFβ、雌 激素信号通路等相关的下游靶基 因表达的影响。确定组蛋白修饰复 合物中各成员间物理上的相互作 用与功能上的相互作用的关系； 3） 研究 ncRNA在表观遗传修饰和转录 水平上对基因转录的调控作用；以 及 ncRNA相关的信号调控通路； 4） 对克隆得到的新的潜在 EMT调控因 子用分子生物学及细胞生物学的 手段进行功能分析； 5） 发展三维细胞培养模式，将肿瘤细 胞与基质细胞共培养，尽量模拟体 1） 初步论证连接 DNA甲基化与组蛋白 修饰的关键蛋白和酶。联系得到一 组能够准确预测肿瘤转移能力的 DNA甲基化标志物； 2） 明确组蛋白修饰候选因子对组蛋 白修饰和基因表达的影响； 3） 发现肿瘤相关蛋白与 ncRNA间相互 作用对基因转录的调控作用及具 体的分子机制； 4） 建立单核巨噬细胞特定基因敲除 或过表达的小鼠乳腺癌模型； 5） 发现恶性肿瘤与干细胞中分别预 测基因表达与表观调控网络,的异 同； 6） 发表 5-6 篇 IF>5 的研究论文,1-2 篇IF>10的研究论文。申请专利1-2 项。 研究内容 预期目标 内环境，研究这些差异表达的基因 或 miRNA对共培养后肿瘤细胞侵袭 转移能力的影响，探讨改变细胞微 环境对肿瘤侵袭转移的影响； 6） 在恶性肿瘤与干细胞中分别预测 基因表达与表观调控网络,并进一 步比较其异同。进一步通过自动文 献检索来检验网络的准确性。 第 四 年 1）研究 DNA甲基化与组蛋白修饰的 先后及其相互影响的机制，开展 肿瘤转移相关甲基化标志物生物 学功能基础研究； 2）以过量表达、RNA 干扰和染色体 免疫沉淀等技术手段增加或者降 低组蛋白修饰候选因子在细胞内 的含量，检测候选因子对组蛋白 修饰复合物中各成分的转录和蛋 白质稳定性的影响、对组蛋白修 饰酶在靶基因序列上募集的影响 和对组蛋白修饰酶活性的影响； 3）利用细胞模型和裸鼠动物模型系 统研究 ncRNA在肿瘤发生发展中 的作用； 4）继续进行 EMT相关新基因功能分 析，并根据分子生物学的研究成 果，建立必要的动物模型，研究 新的 EMT调控分子过表达或基因 敲除后对乳腺癌转移的影响； 5）利用小鼠骨髓嵌合体和乳腺癌动 物模型，研究肿瘤相关间质细胞 对肿瘤细胞的发展与转移能力的 影响。继续研究化学致癌剂在肿 瘤易发及对照小鼠中诱导特定的 癌症模型并研究其病理生理特征 以及相关分子机制。原位 ATC肿 瘤异种移植模型的肿瘤转移机制 1）确定影响 DNA 甲基化与组蛋白修 饰的蛋白作用机制，确定 DNA 甲 基化标志物影响肿瘤转移相关的 机制； 2）确定组蛋白修饰候选因子在基因 表达调控中的分子机制； 3）发现肿瘤相关蛋白与 ncRNA 间的 相互作用在细胞生长、分化、肿 瘤发生发展及侵袭转移中的作 用； 4）原位 ATC 肿瘤异种移植模型的肿 瘤转移机制研究取得重大进展； 5）验证并估算得到贝叶斯网络的预 测准确性； 6）发表5-6篇IF>5的研究论文,1-2 篇 IF>10 的研究论文。申请专利 1-2项。 研究内容 预期目标 研究； 6）通过干扰预测的上游调控节点后 以 ChIP-PCR 和 ChIP-seq 技术对 下游节点进行检测，对贝叶斯网 络模型推测出的关键调控关系进 行验证。 第 五 年 1）探讨表观遗传调控的新机制，建 立测定肿瘤转移能力的 DNA甲基 化分型；进行 DNA甲基化标志物 诊断试剂盒开发； 2）利用基因过量表达和敲低/敲除 技术，在体外细胞水平和体内小 鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选 分子对肿瘤细胞增殖、迁移、侵 袭、转移以及 EMT的影响，检测 候选分子对细胞恶性转化的能 力。利用小鼠基因敲除模型，检 测组蛋白修饰因子及其调节的靶 分子在体内组织水平上的改变模 式，利用免疫组织化学等技术检 测某些候选分子及相应的组蛋白 修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移 中的临床意义； 3）系统深入地研究 ncRNA 和蛋白间 的相互作用、它们所构成的结构 网络、调控网络、以及这些相互 作用的生理功能，剖析 ncRNA调 控网络在肿瘤发生发展进程中的 作用与意义； 4）继续进行功能分析实验，并在乳 腺癌肿瘤病人标本中验证研究所 得的 EMT关键分子与肿瘤治疗反 应及预后的关系，筛选有诊断意 义的分子标志； 1）开发出 1-2 个预测肿瘤转移能力 的 DNA 甲基化标志物诊断试剂 盒； 2）确定组蛋白修饰候选因子在肿瘤 发生发展及侵袭转移中的作用； 3）提出 ncRNA 作用机制的新假说， 探讨在细胞中是否存在一个通过 RNA-蛋白相互作用而构成的结构 网络和信息调控网络。为肿瘤诊 断与治疗提供新的理论基础和 ncRNA分子靶标； 4）筛选出 1-2 个对乳腺癌治疗及预 后具有诊断意义的分子标志； 5）阐述在肿瘤微环境中，间质细胞 及分子对肿瘤发生发展及侵袭转 移影响及作用的分子机制，从间 质细胞角度寻找阻断肿瘤侵袭转 移的靶分子； 6）进一步验证并估算贝叶斯网络的 预 测 准 确 性 。 并 基 于 新 的 ChIP-seq 数据得到改进的贝叶斯 网络模型。 7）发表5-6篇IF>5的研究论文,1-2 篇 IF>10 的研究论文,申请专利 1-2项。 研究内容 预期目标 5）通过体内外实验，阐明在肿瘤微 环境中，促进单核细胞浸润和分 化发育成为不同类型巨噬细胞的 调控因素，及不同微环境下不同 的巨噬细胞亚群影响乳腺细胞以 及乳腺肿瘤细胞增殖和行为特征 机制； 6）利用ChIP-seq技术在全基因水平 检测转录因子对全基因组范围内 组蛋白修饰的影响。并在加入新 的ChIP-seq数据后重建并改进贝 叶斯网络模型。 一、研究内容 主要研究内容 1、 表观遗传重编程不仅在体细胞去分化和获得多能“干性”方面发挥关键性作 用，也是细胞癌变过程中获得无限增殖和侵袭/转移能力的物质基础。本项目 拟在开展转移相关 DNA 甲基化组学研究的基础上，筛选并鉴定出影响乳腺 癌细胞转移能力的关键性 DNA 甲基化变化位点及其网络，了解其在乳腺癌 细胞获得转移能力重编程过程中作用，建立预测乳腺癌等恶性肿瘤转移能力 的表观遗传分子分型体系。以肿瘤高甲基化基因 1（Hic1）为目标，以 III 类 组蛋白去乙酰化酶 SIRT1 为对象，探讨 SIRT1 作为组蛋白去乙酰化酶对组蛋 白修饰及其对 DNA 甲基化酶和 DNA 结合蛋白相关因子的作用，筛选影响 DNA 甲基化酶和 DNA 结合蛋白的关键性因子；明确相关关键性因子与 DNA 甲基化酶和 DNA 结合蛋白作用的分子机制，进一步阐明 Hic1基因发生 DNA 甲基化的分子机制，进而揭示组蛋白修饰和 DNA 甲基化的相互作用关系。 探讨逆转 DNA 甲基化在肿瘤治疗中的临床应用价值，在明确“肿瘤组织 DNA 异常甲基化-基因表达变异-肿瘤细胞转移功能”关系的基础上，确定乳腺癌和 肺癌转移能力的关键性 DNA 甲基化变异位点及其网络，建立肿瘤转移能力 的 DNA 甲基化分型体系，并结合大样本肿瘤患者随访以及模式动物进行验 证研究。 2、 探讨组蛋白修饰如何影响基因的转录及这种调控形式如何影响恶性肿瘤发 生发展及侵袭转移。包括新的组蛋白修饰复合物的发现和作用机制的探讨； 研究不同组蛋白修饰之间的相互影响，特定的组蛋白修饰与特定的基因转录 激活或抑制的关系，组蛋白修饰和转录因子/转录辅助因子的组装，组蛋白修 饰复合物的调控，组蛋白修饰在肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制； 筛选组蛋白修饰复合物成分，包括 MLL1 等相关的甲基化酶复合物成分、组 蛋白磷酸化酶、TGFβ 和雌激素信号途径相关的组蛋白修饰因子等；验证组 蛋白修饰复合物中各成员间的相互作用；检测分离的组蛋白修饰因子对组蛋 白修饰的影响及不同修饰间的相互影响；检测组蛋白修饰因子对靶基因的选 择性和表达的影响，以及组蛋白修饰对 Smad、ER 等转录因子募集到靶基因 启动子上的作用；在细胞水平和小鼠肿瘤模型中检测筛选到的候选分子在乳 腺癌、肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的作用和机制；收集大量临床标本， 结合病理及预后等资料，检测几个候选分子及相应的组蛋白修饰在乳腺癌、 肺癌等肿瘤发生发展及侵袭转移中的临床意义。 3、 利用课题组前期工作中建立的筛选与目标蛋白相互作用的 ncRNA 的技术平 台（RNA-SELEX-seq），从肿瘤细胞系和肿瘤组织中筛选鉴定与肿瘤相关蛋 白相互作用的 ncRNA，研究 ncRNA-蛋白质间相互作用的分子基础、动态时 空关系以及功能调控网络；阐明 ncRNA 在表观遗传修饰和转录水平上对基 因转录的调控作用，深入探讨它们在肿瘤发生发展及侵袭转移中的意义；利 用生物信息学和实验相结合的方法鉴定以 ncRNA 为轴心，与之相互作用的 蛋白质、RNA 和 DNA，发现 ncRNA 新的作用机制，探讨在细胞中是否存在 一个通过 RNA-蛋白相互作用而构成的结构网络和信息调控网络；在发现和 鉴定的肿瘤特异性 ncRNA 及其相关蛋白的基础上，用肿瘤启动细胞模型、 肿瘤转移模型（包括肿瘤细胞 EMT 模型）以及临床标本，深入探索具有临 床意义的 ncRNA 及其相关蛋白在肿瘤发生发展中的作用。 4、 寻找新的 EMT 调控因子以及新的 EMT 相关调控通路，研究建立和维持 EMT 的信号通路之间的交互作用：一般来说，ER 阳性的乳腺癌细胞（如 MCF-7 细胞）转移性弱，而 ER 阴性的乳腺癌细胞（如 MDA-MB-231 细胞）转移性 强。癌细胞 ER 表达阳性也是其对三苯氧胺等雌激素拮抗疗法有反应性的前 提条件。但三苯氧胺对部分 ER 阳性的乳腺癌细胞治疗效果较差。选取正常 乳腺癌细胞、乳腺癌低转移性、高转移性、耐药性的代表细胞系进行表达谱 分析，检测它们是否具有 EMT 相关基因的表达差异。其中差异表达的除已 知 EMT 基因外，未知功能的基因表达产物根据其功能域及蛋白质组学分析 （如质谱检测其相互作用蛋白等方法）可研究其是否为新的 EMT 相关转录 因子。基因表达谱差异分析可同样应用于以 lentivirus 在低转移性细胞用 shRNA 抑制 E-cadherin 促进其 EMT，或高转移性细胞引入 E-cadherin 表达后 与原有细胞的对比研究中。已发现多种信号通路都与 EMT 相关。拟选取目 前研究较为充分的 TGF通路，以及 Wnt 和 NFB 通路为代表，分别给予乳 腺癌细胞相关信号分子刺激诱导 EMT，随后进行基因表达谱、通路特异性蛋 白质谱以及高通量的细胞内磷酸化修饰改变等分析，找到这些通路在 EMT 过程中的共同靶点并阐明其在 EMT 中如何扮演关键角色。建立可诱导表达 荧光标记的 E-cadherin 或其它 EMT 诱导因子的稳定转染细胞系，以在细胞 及分子水平上实时观察细胞内外环境的改变对EMT及细胞转移能力的影响。 同时，研究这些分子及相关的通路与乳腺癌病人的转移、疗效、预后及药物 敏感性的关系，探讨其临床应用价值。 5、 EMT 过程中 DNA 甲基化水平和组蛋白修饰在全基因组范围内的改变及特异 的组蛋白修饰酶如何参与调控 EMT：EMT 是已分化上皮细胞进行基因表达 重编程的生物学行为，势必有 DNA 甲基化及多种影响基因转录的组蛋白修 饰在全基因组范围内重新分布。利用 MeDIP-seq 检测细胞在发生 EMT 时在 全基因组范围内的 DNA 甲基化变化规律。同时，针对特异性组蛋白化学修 饰如转录激活性的组蛋白乙酰化、H3K4 甲基化，转录抑制性的 H3K9， H3K27，H4K20 甲基化等，利用其特异性抗体进行 ChIP-seq 分析，检测细胞 发生 EMT 时的组蛋白化学修饰变化规律。从以上两方面的研究出发，进而 对潜在 EMT 关键基因进行详细的生物学功能研究。特异的组蛋白修饰酶可 能在 EMT 调控中扮演关键角色。组蛋白 H3K27 三甲基化酶 EZH2 在乳腺癌 中显著高表达，并与远处转移及较差预后密切相关，提示其在 EMT 中亦可 能扮演关键角色。相关课题组之前发现组蛋白 H3K4 去甲基化酶 LSD1 在 TGF信号通路及乳腺癌转移中起重要作用。课题将进一步以 EZH2 及 LSD1 为研究对象，通过基因组学及质谱分析，研究它们和已知的 EMT 相关的转 录因子之间的相互关系。 6、 分离乳腺良性增生患者及乳腺癌患者微环境中的成纤维细胞，进行原代培养 后，分析 miRNA 及 mRNA 的表达谱，研究不同类型的乳腺癌（基底型、导 管 A 型、导管 B 型、HER2+/ER-型、类正常乳腺型），以及不同侵袭转移能 力（高转移、不转移）的乳腺癌中上皮细胞与间质细胞的表达谱差异；通过 基因过表达或敲降的方法，研究这些差异表达的基因或 miRNA 对成纤维细 胞及肿瘤细胞的生物学行为的影响，尤其是肿瘤细胞侵袭转移能力的影响； 发展三维细胞培养模式，将肿瘤细胞与基质细胞共培养，尽量模拟体内环境， 研究这些差异表达的基因或 miRNA 对共培养后肿瘤细胞侵袭转移能力的影 响，探讨改变细胞微环境对肿瘤侵袭转移的影响。 7、 从髓系细胞在不同病理状态下的乳腺组织中的浸润和群体变化入手，通过分 析乳腺良性增生患者、乳腺癌组织的局部微环境中，浸润性的髓系细胞（包 括浸润的肿瘤相关性巨噬细胞）的活化和表型特征，特异性表达基因的改变， 分析在乳腺癌发生的微环境中，促进单核细胞浸润和分化发育成为 M2 型肿 瘤相关性巨噬细胞的调控因素，探寻促进乳腺细胞异常增殖分化的免疫细胞 的相关因素和分子及其调控因素；在我们已经建立的三维模拟人体体外免疫 系统模型基础上，改进并建立起进行乳腺癌细胞/静脉血管内皮细胞/免疫细 胞的共培养的三维模型；通过活化髓系细胞，以及体外分化的 M2 型巨噬细 胞，研究免疫细胞中的异常表达基因和分子对良性增生的乳腺细胞以及乳腺 肿瘤细胞增殖和行为特征的影响；并采用具有不同行为特征的肿瘤细胞以及 在肿瘤细胞中采用基因过表达或敲除的方法，研究探讨其对浸润的免疫细胞 分化的影响；通过制备同类系小鼠骨髓嵌合体，进而在乳腺癌小鼠动物模型 中，确证相关免疫的细胞活化因子在促进肿瘤细胞侵袭转移中的作用，并探 讨肿瘤细胞产物对髓系抑制性细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）产生的机制以及可能的阻断途径，从而在机体免疫水平探讨阻断肿 瘤侵袭转移的策略。 8、 采用基因工程小鼠模型，研究 TGFβ 信号通路在肿瘤微环境中与 REG蛋白 酶体激活因子、p53 等重要肿瘤因子动态相互作用及其动态调控的分子机制； 在解析这些调控机制的生理病理意义的基础上，通过肿瘤模型研究进一步阐 明肿瘤微环境中重要生物学因子对肿瘤发生发展的决定性作用；以正常细胞 和肿瘤细胞为模型，利用基因敲除等手段，近一步阐明 REG蛋白酶体与 TGFβ信号通路间的相互调节以及信号反馈机制；利用正常表达及缺失 REG 的小鼠（C57BL/6 遗传背景的 REG+/+和 REG-/-小鼠），通过杂交建立 Smad2 亚等位基因表达（hypomorphic expression）的小鼠模型，用化学致癌剂在肿 瘤易发及对照小鼠中诱导特定的癌症模型，通过对癌症发生的普遍特征、肿 瘤病理组织学分析等研究来探讨 TGFβ 信号通路与 REG蛋白酶体的交互作 用。 9、 利用肿瘤基因表达和表观遗传学数据，采用计算生物学方法推测在恶性肿 瘤、干细胞中发生变化的表观遗传学调控网络。进一步发展基于贝叶斯网络 的因果推断方法。在恶性肿瘤与干细胞中分别预测基因表达与表观调控网络, 并进一步比较其异同。通过干扰预测的上游调控节点后以 ChIP-PCR 和 ChIP-seq 技术对下游节点进行检测，对以上预测模型中的关键调控关系进行 验证。