miRNA常用实验方法

miRNA常用实验方法 一、 miRNA的检测方法 miRNA的 realtime-PCR 检测方法 1、 realtime-PCR 引物设计 miRNA realtime-PCR 引物设计方法： 1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的 miRNA序列修改最末 端 6 个碱基即可。 通用茎环结构序列为： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计 miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的 RT引物，只需在通用茎环序列后架上 miRNA3’ 末端的 6 个碱基的反向互补序列，即 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2） realtime 上游引物设计： miRNA序列除去 3’端 6 个碱基的剩余部分作为上游引物，如 miR-1 的上游引物为 ( 注意把 U 改为 T) ：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的 Tm 值（一般参考 DNAMAN），如果 Tm值较低，则在 5’端加 GC使 Tm值接近 60 度。因此 miR-1 的上游引物可 设计为： GCGCTGGAATGTAAAGAAGT， 61.4 度。 3）下游引物是通用的，序列为 GTGCAGGGTCCGAGGT。 4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的 特异性；同时最好将 PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要 3%以上 的琼脂糖胶） 。 2、 miRNA反转录 miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶 即可。我们一般使用的是 TIANGEN的 MLV，逆转录体系为： RNA 500ng~2ug 5xbuffer 2ul dNTP 0.25ul DDT 0.25ul RRI 0.25ul MLV 0.25ul RT primer 0.5ul H2O(RNase free) 补至 10ul 程序为（PCR仪中通常命名为 CTFRT）16 度，30min；42 度，60min；85 度，5min；4 度，hold 。 ！！做 miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的 RT，即一个样品至少要做目的 miRNA和内参 两管反转录反应。 3、 realtime-PCR 实验 miRNA逆转录完成后得到的 cDNA即可进行下一步 PCR。在确认引物的特异性后， 我们可以进 行正式实验。 一般每个样品至少需要 3 个平行孔。 Realtime PCR体系为（ABI 定量 PCR仪 需 要加 ROX dye II ， Biorad 定量 PCR仪不需要加 ROX）： 2X SYBR 10 ul ROX II 0.4ul （Biorad 不加） Primer 1ul Template 1ul H2O 7.6ul （Biorad 8ul ） 需要注意的几点： 1）在配制 PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分 混匀。这一点是 PCR平行性的保证。 2）配制体系尽量在冰上进行。 3）请选用比较准确的枪 进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个 96 孔板的 PCR体系，我会配制 100 个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。 PCR 程序： 95 度， 1min；95 度， 5s；60 度， 34s（此步在读取荧光值） 。40 到 45 个循环。 4、 realtime PCR 结果分析 realtime PCR反应结束后返回 Ct 值，可以利用定量 PCR仪软件自带的程序进行分析，也可 以利用 EXCEL表格进行相对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到 EXCEL 表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为 1。其 他的样品与之相比得出相对值。 EXCEL表格 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 见附件。 二、 miRNA靶基因的预测 miRNA靶基因预测软件简介 1、 TargetScan ：http://www.targetscan.org/ 首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的 miRNA 和靶基因，则点击右上角的“ Go to TargetScanMouse ”。第二个选项可输入基因名 （有时不识别别名） ，点击 submit 即可，此操 作可预测可能靶向该靶基因的 miRNA；或者输入 miRNA的名字， 点击 submit ，此操作可以预 测该 miRNA的靶基因。 2、 Pictar ：http://pictar.bio.nyu.edu/ 输入网址后进入 pictar 主页，下面有几个可选用的数据库， 一般选用最后两个数据库即可。 点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的 miRNA(注意：如果你感兴趣的 miRNA在下拉 菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件 ) 并点击 search for targets of a miRNA 或输入 gene ID （注意：与 targetscan 不同， pictar 一般不识别基因名，最好输入 gene 号： NM_***** ）点击 search for all miRNAs predicted to target a gene. 进行预测。 3、 Mirbase ： http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl 分别输入 miRNA名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。 预测结果的处理和分析 我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较， 选取两种以上软件预测的交集部分作为我们 候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。 如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。 三、 miRNA的过表达和敲低 1、 过表达 过表达 miRNA一般可采用两种方法： a 构建过表达载体； b 人工合成成熟 miRNA。 a 构建过表达载体 1）获取 miRNA基因的序列及旁侧序列 进入 Ensembl( http://www.ensembl.org/index.html ) 主页。 输入 miRNA 名，点击进入。在 export data 页面上选择输入 5’flanking sequence 和 3’flanking sequence 分别为 200bp( 见下图 ) ，然后点击 next 即可得到包括前体和左右侧 翼 200bp 的序列。 2）基于这段序列， 我们可以设计该 miRNA的表达序列。 引物设计原则： 扩增产物包括前体， 并左右各有至少 70bp 的侧翼序列，长度一般在 200bp-500bp 。其他同一般引物设计。载体 可以选用任意使用 RNA polII 识别的启动子的载体， 包括 T7，CMV等。常用的是 pcDNA3.1， 不要带标签的。 注意：如果 miRNA位于 cluster 中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个 或两个以上的 miRNA。完成表达载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。如 果目的 miRNA的表达明确，则载体构建完成。 b 合成成熟的 miRNA序列 查出 miRNA的准确序列， 请公司合成成熟的序列。 常用的公司有： 上海吉凯； invitrogen 等。 2、 敲低 目前做内源性 miRNA的敲低一般使用人工合成的 miRNA的反义链，即成熟 miRNA的序列的反 义 互 补 序 列 。 如 mir-x 序 列 为 UCACACAACCCACCACCAUUG， 则 其 inhibitor 序 列 为 CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA. 将该序列送交公司合成即可。 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因实验方法 一、 miRNA靶基因筛选 荧光素酶报告基因实验 1、荧光素酶报告基因质粒的构建 载体质粒为经过改造的 pcDNA3.1，其图谱见下图。 可用的酶切位点为 NotI ，XhoI 及 XbaI. 推荐优先使用 XhoI 和 XbaI 两个酶切位点。如过不能用，可用 NotI. 靶基因 3’UTR的获得。3’UTR序列是指从 Mrnaz 终止密码子后的第一个碱基开始到 mRNA 最后一个碱基（通常是 polyA 结尾）。模板可采用相应物种的 cDNA或基因组。在选择模 板时要注意：一般来讲， cDNA适于所有的 3’UTR扩增，但有时 3’端 AT过多导致引物 设计困难时，可以考虑用基因组做模板。但是基因组做模板的前提是靶基因 3’UTR 由 一个外显子组成。相关信息可以从 ensembl 中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全 面的扩增 3’UTR，但如果 3’UTR过长或引物设计困难，可以选取包括 miRNA结合位点 的一段 3’UTR。引物设计的原则同一般引物设计。 2、荧光素酶实验 构建好荧光素酶报告基因实验后， 准备开始做报告基因实验前， 你还需要准备以下材料： 1） TK 质粒，作为共转染的内参。 2）miRNA的过表达质粒或合成的 miRNA。质粒的浓度尽量在 500ng/ul 以上，合成的 miRNA稀释到 20uM。3）状态良好的细胞。 1） 分细胞。我们常用 24 孔板进行报告基因实验。分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞 的方法见细胞培养的方法） ，每孔细胞数目相当。以 293ET 细胞为例，我们转染的密度 一般在 60-80%作用， 如果用威格拉斯转染试剂， 细胞密度可以稍高些， 因为转染后细胞 3’UTR of Targets XhoI XbaI 死亡较多。 2） 转染。转染时必须配总体系再依次分成小体系。这一步决定着每个孔的平行性和实验的 可重复性。转染核酸用量为每孔： luc- 3’UTR 200ng； TK 50ng ；miRNA-pcDNA3.1 1ug 或合成的 miRNA 2.5ul （终浓度 100nM）。Vig 每孔用量为 1ul ， lip2000 为 2ul 。转染后 4-6h 换液。如果用 vig 转染必须及时换液， 否则细胞会尸横遍野。 注意设立合理的对照， 通常用 pcDNA3.1（或 miRNA NC）代替 miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做 miRNA的对照。 3） 收细胞。转染 24-48h 可以收取细胞。用生理盐水或 PBS清洗细胞两次，因 293 细胞极 易脱落，建议操作温柔，如果对自己的操作没有自信，可以增大生理盐水量只洗一次。 之后吸干生理盐水。每孔加入 80ul 1Xpassive buffer （裂解液的量可视细胞数目稍作 调整），室温摇 20min，如果细胞裂解充分会看到白色粘稠状细胞碎片。如果不马上测， 可连同 24 孔板冻于 -80 度， 测时再取出解冻。 -20 度可 保存一周。 4 度可保存一天。 4） 测定荧光素酶活性。 使用中 心实验室 108 室 turner 仪 器进行双荧光素酶的测量。 具体仪器操作方法可学习 相关 教程 人力资源管理pdf成真迷上我教程下载西门子数控教程protel99se入门教程fi6130z安装使用教程 或请教师兄师姐。 我 们 使 用 的 试 剂 盒 为 promega 的双荧光素酶报告 系统：bufferII 为萤火虫荧 光素酶的底物， 测量数值为 我们的报告基因的活性； S&G buffer 作用是淬灭萤 火虫荧光素酶的活性并提 供海肾荧光素酶反应的缓 冲环境， 测定的数值为内参 的活性。测定时，取细胞裂解液 8ul 到 96 孔板中（专用的 96 孔板）上机测量。每种底 物每孔加 30ul 。 3、结果分析 测定荧光素酶后会返回三个值： 萤火虫荧光素酶活性、 海肾荧光素酶活性及两者的比值。 比值将作为最后的分析数据，反映了该孔报告基因的相对活性。通常将对照归一为 1， 实验组与其相比取相对值。此相对值用于最后作图和统计分析。归一方法和作图请自学 EXCEL或请教其他同学。 GFP报告基因实验 1、 GFP 报告基因质粒构建：与荧光素酶报告基因质粒构建方法同。仅仅是用 GFP 取代 luciferase 。 2、 实验方法及结果分析 1） 转染。一般使用 12 孔板进行实验，每孔转染量： GFP-3’UTR， 200ng-500ng ；miRNA， 1ug 质粒或 100nM 合成的 miRNA。 2） 转染 48h 后，用荧光显微镜照相， 观察绿色荧光的强度； 收取细胞， 用 GFP抗体检测 GFP 表达水平。建议做三个平行孔，结果需要进行统计学分析以判断差异是否显著。 二、 转录因子调控分析 1、 启动子的预测、确认 启动子是指 RNA聚合酶识别并结合的 DNA序列， 并包括促进这一过程的调节蛋白的结合 位点。启动子位于转录起始位点附近，而真核基因的转录起始位点通常需要实验进行确 定。5’RACE是确定基因转录起始位点的经典方法。在不知道转录起始位点时，我们也 可 以 对 启 动 子 进 行 预 测 。 预 测 基 因 启 动 子 的 软 件 有 ： NCBI promoter scan ( http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/ ) 等。 2、 转录因子的预测 通常我们比较关心哪些转录因子可以调控我们感兴趣的基因， 这就涉及到该基因的转录 因子的预测和鉴定。转录因子的预测软件有： SignalScan http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/ TF search http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html 等。 将待预测的上游调控序列输入进行分析，即可知道该序列中含有哪些转录因子的结合位 点。（说明：这两个软件提供的预测结果不够全，有一些转录因子没有被包括其中。 ） 3、 报告基因质粒的构建 我们经常使用的质粒载体为 PGL-Basic ，质粒图谱见下图。我们要将待分析的启动子序 列插入到 luciferase 基因上游。推荐使用 kpnI ，XhoI ，BglII 和 HindIII 这几个酶切 位点，但不建议用 XhoI 和 BglII 双酶切，因为这两个酶切位点有重合。该载体测序用 RVP3(正向 ) 和 GLP2(反向 ) 。 4、 实验方法及结果分析 常见的启动子（转录因子）活性分析实验： 1） 连续截短确定核心启动子。克隆基因的上游调控序列，做连续的截短，如构建 -2000~-1500 ，-1500~-1000 ，-1000~-500 ，-500~0 ，0~500 一系列克隆， 转入细胞， 观察荧光素酶活性， 以此判断哪一段序列对于该基因的转录活性起关键作用。 例如： -2000~-1500 和 -1500~-1000 有很高的活性，而 -1000~-500 活性很弱，则可判断核 心启动子区在 -1500~-1000 。 2） 特定转录因子对转录活性的分析。我们构建包含该转录因子的启动子序列（上游调 控序列）的报告基因质粒，与转录因子的过表达载体（或 RNAi）共转染细胞，观察 转染前后报告基因活性的变化。如果转染后报告基因活性发生明显改变，则可判断 该转录因子可能调控目的基因的转录。