28935364AA标签蛋白手册中文版

GE Healthcare 标签蛋白的 简易纯化 从靶基因到纯化蛋白之旅 3 GST标签蛋白 GST融合系统概述 4 pGEX载体 5 应用 6 Tag剪切酶 13 应用 14 GST标签蛋白的检测 17 订货信息 19 组氨酸标签蛋白 组氨酸标签蛋白概述 20 应用 21 订货信息 31 Strep-标签 II 蛋白 Strep-标签 II 蛋白概述 32 应用 33 订货信息 36 MBP标签蛋白 MBP标签蛋白概述 38 应用 39 订货信息 43 双标签蛋白 双标签蛋白概述 44 应用 45 目录 由于重组蛋白扩增和纯化技术和产品的日益丰富，重组蛋白近年来使用大大的 增加。使用重组标签蛋白有利于纯化和检测的优势现在已经被广泛的知晓。一 般来说，在蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达流程的第一步，是将靶基因克隆进入合适的表达载体。接 下来，将表达载体转化进入合适的宿主系统，进行接下来的表达 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 现在可以使用的宿主系统种类多样，包括可以进行培养的细菌、酵母、植物、 细丝真菌、昆虫和哺乳动物细胞，以及转基因动物和植物。每种宿主系统都有 各自的优点和缺点，在最终决定选择哪一种宿主时，考虑这些优缺点非常重 要。在您的特定蛋白最初筛选和最佳表达条件确定之后，您可以扩大规模纯化 生产，获得大量的靶蛋白，进行下游的应用，如功能分析和结构研究。 由于在表达蛋白的标签和亲和柱料的配基之间存在高特异性吸附，标签蛋白的 纯化相对简单省时。您可以仅使用一步就获得较高的纯度——亲和纯化一般可 以达到 95%以上的纯度。如果您需要更高的纯度，可能需要进一步的纯化。 克隆 细胞培养 筛选 规模放大纯化 结构和 引导设计 功能研究 3 从靶基因到纯化蛋白之旅 谷胱甘肽 -S转移酶 (GST) 基因融合系统是表达、纯化和检测 E. coli 生产的GST标签蛋白的多功能系统。GST标签蛋白的代表性特征是， 与谷胱甘肽SepharoseTM色谱柱料的谷胱甘肽配基高特异性结合，因 而一步洗脱靶分子的纯度可以超过 90%。GST标签可能也增加了靶 蛋白的溶解性和稳定性。GST相对来说比较大，相对分子量 (M r ) 为 26 000。GST 标签蛋白含有特殊的剪切序列，纯化后使用不同的蛋 白酶可以比较简单的去掉 GST标签。 GST标签蛋白的纯化在非常温和的条件下进行，有效地保护了靶蛋 白的功能和抗原性。GST标签经常用来补充组氨酸标签，或在表达 过程中组氨酸标签不能得到可溶蛋白时，作为代替标签。 GST 标签蛋白 生产高产量的标签蛋白 的 pGEX 载体 GST基因融合系统整合 pGEX质粒，可以进行日本血吸虫 GST融合的基因或基因片段的可诱导、高等级细胞内表达。 在E. coli内表达，在胞浆内产生具有标签的蛋白，GST部分 在氨基端，而感兴趣的蛋白在羧基端。 现在有十三种 pGEX 载体。其中九种载体具有可扩展的多 克隆位点 (MCS)，此位点含有六个限制性内切酶位点。可 扩展的多克隆位点方便之处在于，使用多种可获得的 lambda载体构建文库，从中获得扩增的cDNA，插入进行 非直接克隆。 通用电气医疗集团提供具有位点特异剪切编码识别序列的 pGEX载体，可以被PreScissionTM蛋白酶、凝血酶蛋白酶和 因子 Xa蛋白酶识别 (参见本页 pGEX载体的序列图)。 在此序列图中，虽然所有三种读码框的终止编码没有被描 述，所有十三种载体在三种读码框的多克隆位点下游都有 终止编码。 5 G ST � � ! � � ! � � ! � � ! � � ! GST�� !"#$ �� !"#$Sepharose�� !"#$%&'()*+�� !"#$%&'()*�� !"#$%&' �� !"#$%&'()* 6 �� ! Sepharose �� !"#$%&'(� ÄKTAdesign�\ �� �� !"#$%&'()\ �� �� !"# �� �� �� �� !"#\ �� �� ! �� �� GSTrap HP �� ! Sepharose�� �� ! Sepharose 4B E�� !"#$F �� � RediPack GST�� ! * ��GST�� ! * �� �� �� ! L�� ���� GST�� !"#$ �� 50 mg �� 50 mg GSTPrep FF 16/10 GSTrap 4B �� 96�� �� GST SpinTrap�� ! * GST MultiTrap 4B GST MultiTrap FF �� ! Sepharose 4B �� ! Sepharose 4�� GSTrap FF * �� !"#$%&' �� !"# Sepharose�� �� !"# Sepharose 4�� �� !"# Sepharose 4B G ST � � ! � � ! � � ! � � ! � � !�� !"#$%& �� !�GST MultiTrap FF� GST MultiTrap 4B�ExcelGel SDS�� 8-18�Multiphor II� �� !�� ! -SDS Marker�� �� !"#$%&'()*+,-./�� !"#$%&'()*+�� !"#$%&'()*+,- �� ! GST MultiTrapTM FF� GST MultiTrap 4B 96�� !�"#$%&'()�� !"#$%&' GST�� �� !"#$!%&'�� !"#$%&'(�)*+,-.�� GST-�� !"#$% E. coli�� !"# �� 96�� !��GST MultiTrap FF� GST MultiTrap 4B ���300�� ! GST�� !"#$%&' E. coli BL21�� ! Mr 45 000 �� !��� !"#$ �� !"�10 mM�� !140 mM�� !pH 8.0 �� !"�50 mM Tris-HCl�10 mM�� !"#$%pH 8.0 �� !��� SDS-PAGE ��� ��GST MultiTrap FF�GST MultiTrap 4B�� GST-�� !"#$!"%&'()* 3�5�� �� ! 96�� !" �� 350�� �� GST MultiTrap FF�GST-�� !"#$%&' �� GST MultiTrap 4B�GST-�� !"#$%&' �� ! E��F � � ! " # $ % E� � F 7 120 min 3 min 0 min60 min 30 min 10 min M r × 103 97 66 45 30 20 14 ← GST-hippocalcin � � ! m ar ke r � � ! � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � GST 标签膜蛋白的可溶性 筛选策略 特色产品：GST SpinTrap 纯化模块，GST 检测模块 溶解性是膜蛋白提取的最关键步骤之一。有效的溶解确保了具有生物活性膜蛋白的高产量，为成功的纯化铺平了道路。 为了使目标膜蛋白有效的溶解，经常必须筛选一系列去污剂，然后选择适合特定靶蛋白和其纯化策略的最好的去污剂。 GST SpinTrapTM柱子用来对 GST标记膜蛋白 (GST-ecoKch) 进行六种不同去污剂的快速、同时筛选。 8 1. 使用GST检测模块，在96孔板规格，应用1-氯 -2，4- 二硝基苯 (CDNB) 实验，测量纯化的GST标签蛋白酶 学活性受不同去污剂的影响。 2. 膜蛋白被不同的去污剂溶解和浓缩，这些去污剂不影 响GST标签的活性。 3. 使用GST SpinTrap纯化模块进行溶解的GST标签膜蛋 白的纯化。 通过 SDS-PAGE分析膜蛋白的 产量和活性 96孔板 柱子：GST SpinTrap 样品：500微升GST标记的ecoKch，1:10 （重量体积比) 溶解在5% DDM， bOG，CHAPS，TweenTM 20，TritonTM X-100，或者 Sarcosyl 结合缓冲液：PBS，pH 7.5 洗脱缓冲液：PBS，0.2%去污剂，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0 SDS-PAGE 小结： 溶解 (数据未展示) 和纯化阶段GST标记的 ecoKch的产量，使用 DDM和 Sarcosyl最高。注意 Sarcosyl 在 CDNB实验中极大的 降低了GST的活性，因此该结果没有反映存在的GST标记蛋白的真实数量。使用DDM纯化之后的酶活性实验最高。这就显示 了对于膜蛋白溶解性最佳条件选择的简易和快速的方法。 致谢：D. Birse，生物化学和生物物理系，斯德哥尔摩大学，瑞典 DDM OG CHAPS Tween 20 Sarcosyl Triton X-100 ‹ GST-ecoKch (M r · 103) 94 67 43 0.8 0.6 0.4 0.2 0 可溶材料 穿透液 洗脱液 高效率一步纯化 特色产品：GSTrap FF、ÄKTAexplorer 、ExcelGel SDS 梯度8-18、Multiphor II 电泳系统、低分子量 - SDS Marker 试剂盒 使用方便的预装柱结合注射器、泵或者色谱系统，GST标签蛋白的纯化常常可以一步获得。在这个例子中，GSTrapTM FF 1毫升柱子用来纯化GST标记的可溶受体亚单位，一步达到很高的纯化程度。ÄKTAexplorer上使用的预编程UNICORNTM 方法模板，提供了标准的纯化操作规程，可以完全遵从，或者适合您独特需要进行修改。洗脱组分使用凝胶电泳分离 和银离子染色进行分析。 柱子：GSTrap FF 1毫升 样品：8毫升表达 GST标记蛋白的 E. coli细胞胞浆提取物 结合缓冲液：PBS，pH 7.3 洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0 流速：1 ml/min 系统：ÄKTAexplorer SDS-PAGE 10 小结： GSTrap FF和 ÄKTAexplorer上预编程方法模板仅用一个纯化步骤就可以产生高纯度的蛋白。 (Mr ´ 10 3) 97 66 45 30 20 14 A 280 3.5 3.0 2.5 2.0 0 1.5 1.0 0.5 5.0 10.0 15.0 20.0 ml 0 20 40 80 60 100 % 洗脱 缓冲液 洗脱缓 冲液 清洗 2.7毫克 纯的 GST标 记蛋白 G ST � � ! � � ! � � ! � � ! � � !�� !"#$%& �� !�GSTrap 4B�HiLoad 16/60 Superdex 200 pg�ÄKTAxpress�ExcelGel SDS�� 8-18� Multiphor II�� !"�� ! -SDS Marker�� �� !"#Sepharose�� !"#$GST�� !"#$%&�� !"#$%&'()*+ EDDTF�GST�� �� !"#$%&'()*+,-.$/ �� !"#$%&'()*+,-�� !"#$%&'()%&*+,-./012�� !"#$%&'() �� !"#$%&'()�� !"#$%ÄKTAxpressTM�� !"#$%&'()*+�� !"#$!%&'() ��ÄKTAxpress�� !"#$!%&'()GST-�� !"#$%&'()*+%,-.�� !"#$%& EACF �� !"#$ EGFF �� !"�� GST-�� !"#$%&'() 280�� !"#$%&'(�� !"# �� !"#$ ���GSTrap 4B 1�� EACF � HiLoadTM 16/60 SuperdexTM 200 pg 120�� EGFF ����� !" 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GSTrap FF 1�� �� �� !" �� !" 5.5 mg GSTrap FF 5�� �� �� !" �� !" 20.9 mg 0 20 40 60 80 100 %B 0 20 40 60 80 100 %B A280 mAU 1200 1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 ml 0 50 100 150 ml GSTPrep FF 16/10 �� �� !" �� !" 111.0 mg 0 20 40 60 80 100 %B 0 200100 300 ml400 500 600 A280 mAU 1200 1000 800 600 400 200 0 1400 A 280 mAU 1200 1000 800 600 400 200 0 1400 标签剪切酶 为了进行靶蛋白特性分析，象GST标签这样的大蛋白经常必须被去除。根据特定的靶蛋白的自然性状的不同， 完全酶切需要的蛋白酶的数量、温度、孵育时间长度也有所差异。 PreScission蛋白酶是特异剪切和去除GST标签的有效的工具酶。PreScission蛋白酶自身具有GST标签蛋白和 人鼻病毒3C蛋白酶，因此使用谷胱甘肽Sepharose亲和柱料，很容易从已经剪切的靶蛋白中去除 (和GST一 起)。由于 PreScission 蛋白酶最理想的活性温度是 4 ˚C，剪切可以在低温下进行，增强了靶蛋白的稳定性。 与其它的蛋白酶不同，PreScission蛋白酶的识别位点不是自然存在的序列，这就保证了该酶的高度特异性。 GST标签蛋白的剪切也可以使用识别不同剪切位点的其它蛋白酶进行。因子Xa蛋白酶和凝血酶蛋白酶是丝氨 酸蛋白酶，最佳剪切温度在室温进行。 13 剪切酶 因子 Xa 蛋白酶：M r 28 000至 30 000 凝血酶蛋白酶：M r 37 000 PreScission 蛋白酶：M r 46 000 重组蛋白 Sepharose 谷胱甘肽 GST 剪切位点 14 标签剪切的优化 特色产品：GSTrap FF、PreScission 蛋白酶、ÄKTAxpress 剪切的最佳条件通过在ÄKTAxpress系统上，使用GSTrap FF和 PreScission蛋白酶，利用GST标签蛋白的柱上剪切 筛选实验，被有效的鉴定。孵育时间以及蛋白酶和标签蛋白的比例不同。剪切蛋白的百分比，通过洗脱的剪切蛋 白的面积和其除以整个总峰面积 (洗脱的剪切蛋白 + 未剪切的蛋白) 共同决定。剪切反应在 4摄氏度进行。 小结： 测得的最佳反应条件是每毫克靶蛋白 20个单位 PreScission蛋白酶，总孵育时间为 8小时。这个最佳反应条件 应用在进一步的研究中。 每毫克蛋白 10个单位 PreScission蛋白酶 每毫克蛋白 20个单位 PreScission蛋白酶 每毫克蛋白 40个单位 PreScission蛋白酶 孵育时间 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 12 14 特色产品：GSTrap FF、凝血酶蛋白酶、ÄKTAexplorer 、ExcelGel SDS 梯度 8-18、Multiphor II 电泳 系统、低分子量 -SDS Marker 试剂盒 纯化和柱上剪切 GST亲和标签的剪切可以在洗脱前在柱上进行，或者在靶分子洗脱后在溶液中进行。为了结合纯化验证柱上剪切的效 率，含有凝血酶蛋白酶识别序列的GST标记蛋白在1毫升GSTrap FF上进行上样。使用该蛋白酶室温孵育16小时后，没 有 GST标记的靶蛋白被洗脱。 柱子：GSTrap FF 1毫升 样品：10毫升表达GST 标记的蛋白的 E. coli澄清的细胞浆提取物 结合缓冲液：PBS，pH 7.3 洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0 流速：1 ml/min 系统：ÄKTAexplorer 10 15 小结: 使用凝血酶蛋白酶有效的柱上剪切GST部分可以和GST纯化过程整合进行。 SDS-PAGE (Mr ´ 10 3) 97 66 45 30 20 14 凝血酶 蛋白酶 剪切 GSTrap FF 1 毫升 ¬ 靶蛋白 % 清洗 室温孵育 16小时 清洗 靶蛋白 没有标记 蛋白的 GST 洗脱 缓冲液 100 80 60 40 20 0 2.0 4.0 6.0 10.08.0 12.0 min5.0 10.0 15.0 min 0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 2.5 3.5 A280 G ST � � ! � � ! � � ! � � ! � � ! �� !"#$%&'( �� !�pGEX-6P�GSTrap HP�PreScission�� !HiLoad 16/60 Superdex 75 pg�ÄKTAxpress� ExcelGel SDS�� 8-18�Multiphor II�� !"�� ! -SDS Marker�� ��PreScission�� !"#$%GST�� !"�� !"#$%&�� !"#!$%&'()*+,-��GST �� !"#$ ÄKTAxpress�� !"#$%&'()*+%&,�� !"#$%�� GST�� !"#$%& ����� ! 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Sepharose 4B 2 × 2 ml 17-0757-01 E�� !"#$F HiLoad 16/60 Superdex 30 pg 1 × 120 ml 17-1139-01 HiLoad 26/60 Superdex 30 pg 1 × 320 ml 17-1140-01 HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 1 × 120 ml 17-1068-01 HiLoad 26/60 Superdex 75 pg 1 × 320 ml 17-1070-01 HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 1 × 120 ml 17-1069-01 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg 1 × 320 ml 17-1071-01 ExcelGelTM SDS 6 80-1255-53 �� 8-18 LMW-SDS Marker�� 10�� 17-0446-01 †=�� !"#$%&' �� !"#$%&L�� !"#$%&'(�� www.gelifesciences.com 19 组氨酸标签蛋白 组氨酸标签被广泛的使用，因为它们小，几乎不干扰靶蛋白的功能、活 性和结构。固定的金属离子亲和层析 (IMAC) 是纯化组氨酸标签蛋白的 最常用方法。金属离子亲和层析柱料鳌和二价金属离子如镍后带有电 荷，可以选择性地吸附组氨酸标签蛋白，当使用变性条件时，可以用于 从包涵体中不可溶组氨酸标签蛋白的纯化。成功的金属离子亲和层析纯 化可以提供高产量的纯化并且有活性的靶蛋白。 然而，由于许多蛋白有内在的组氨酸和/或半胱氨酸氨基酸残基，其它 的非特异蛋白与靶蛋白一起与金属离子亲和层析柱料发生结合。在这种 情况下，经常必须通过改变溶液中咪唑的浓度，优化结合、清洗和洗脱 条件。增加结合和清洗缓冲液中咪唑的浓度通常降低了非特异性结合， 而降低的咪唑浓度可以有更强的亲和相互作用。关键是要找到正确的平 衡。 � � ! " # $ �� !"#$%&' �� ! Sepharose�� !"##$%&'()*+,�� !"#$%&'()*�� !"#$%&'(�� �� !"#$%&' � Sepharose �� !"#$%&'(� ÄKTAdesign�\ �� �� !"#$\ �� �� !"# �� !"\ �� ! �� ���� ���� His GraviTrap His GraviTrap�� HisTrap HP � Sepharose�� �� 96�� �� �� !"\ �� �� �� ! L�� �� �� �� �� !"#$%&' �� 200�� �� 200�� His SpinTrap His SpinTrap�� His MultiTrap FF His MultiTrap HP � Sepharose 6�� HisPrepFF 16/10 �� !"��#$% �� �� ! �� �� !"\ �� �� HisTrap FF�� !" HisTrap FF�� HisTrap FF �� Sepharose�� �� Sepharose 6�� 21 高通量表达筛选 的自动化 特色产品：His MultiTrap HP 靶蛋白的高效高通量纯化或者表达筛选的自动化和可重复性操作过程，在药物靶研究中已经成为关键步骤。进行了 两部分研究来测试在液相处理工作站真空系统进行的优化的自动化的操作规程的强度。首先，进行了棋盘格研究测 量可能的交叉反应。组氨酸标签蛋白样品每隔一个孔上样，间隔的一个孔不上任何样品，保持空的状态。在第二部 分，通过在七排中六种不同的组氨酸标签蛋白的重复上样，测定重复程度。洗脱的组氨酸标签蛋白通过SDS-PAGE 进行了分析。 96 孔过滤板：His MultiTrap HP 样品：棋盘格研究：两个E. coli样品，一个样品表达六组氨酸标签 重组蛋白 (相对分子量 37 000)，另一个样品没有重组蛋白表达 重复性研究：六种不同的E. coli样品，分别表达不同大小的重组蛋 白 (参见下面的SDS-PAGE)。六个重组蛋白中的两 (2和6) 没有表达。 平衡缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM氯化钠、20 mM 咪唑、 pH 7.4 清洗缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM氯化钠、25 mM 咪唑、 pH 7.4 洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM氯化钠、500 mM咪唑、 pH 7.4 液相处理工作站：Hamilton MICROLABTM STAR 真空工作站：MICROLAB STAR基本真空系统 (BVS) 致谢：B. Gallet、M. Noirclerc-Savoye和 T. Vernet，RoBioMol/大分子工程实验室，生物结构 CEA-CNRS-UJF研究所，格勒诺布尔，法国 小结： 自动化方法增加了每一步的通量，具有可以忽略的交叉反应高刚性程度，和孔与孔之间性能的高度一致性。 22 (Mr ´ 10 3) 100 75 50 37 25 20 15 10 第七排 洗脱液 澄清的细菌 提取物 第一排 洗脱液 第二排 洗脱液 第三排 洗脱液 第四排 洗脱液 第五排 洗脱液 第六排 洗脱液 M MM M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 (Mr ´ 10 3) 150 100 75 50 37 25 20 15 10 P = 纯化的蛋白 (相对分子量 37 000) B = 空白 M B P B P B P B P B P B P B P B P B P B P B P B P B � � ! " # $ �� !"#� �� !�His SpinTrap�ExcelGel SDS�� 8-18�Multiphor II�� !" LMW-SDS Marker�� �� !"#$%&'()*+,-./0)123�� !"#$%&'()*+,�� !"#$%&'()* �� !�� !"#$�� !"#$%�� ! APB E�� !" 28 000F���His SpinTrap�� !"#�� �� !"#$%&'( 5�50�100�200 mM�� !"# ���His SpinTrap ���600�� E. coli BL-21�� !�� 400�� !"#APB E�� !" 28 000F ��L�� !"�20 mM�� 500 mM�� !5� 200 mM �� pH 7.4 �� !"�20 mM�� 500 mM�� !500 mM�� pH 7.4 ��� �� !"#$50 mM�� !"#$%&'()*+�� !"#�� !"#$%&'()*+,-.�� !"#$%&' �� !"#$% SDS-PAGE 1: 2 � � 20 0 m M � � ! " # $ �� � � ! m ar ke r 1: 10 � � ! " # $ 1: 2 � � 5 m M � � ! " # $ 1: 2 � � 50 m M � � ! " # $ 1: 2 � � 10 0 m M � � ! " # $ (Mr × 10 3) 97 66 45 30 20 14 ← APB 7-(His)6 23 � � � � ! � � ! � � ! � � ! � � ! �� !"# �� !�His GraviTrap�� !PhastSystem�PhastGel�� 10-15��� ! Hybond ECL� � His�� ECL� IgG��� !"#$%&'()*+�� !"#$%&'()marker �� !"#$%&'(�� !"#$%&'�� !"#$%&'(��His GraviTrapTM�� !"#$%&'( �� !"#$%&'()*�� !"#$�20�� !"#$%&'()*"TRX-P450 E�� !"#$130 000F � E. coli JM109�� !"�� 25�� !"#�$%&'()*+,-./01�� !"#$ SDS-PAGE�� �� !"#$% ���His GraviTrap ���20�� !"#$%&'()*" TRX-P450 E�� !"#$ 130 000F � E. coli JM109�� �� L�� !"�20 mM�� 500 mM�� !40 mM�� pH 7.4 �� !"�20 mM�� 500 mM�� !500 mM�� pH 7.4 ��� �� !" SDS-PAGE�� !"#$%&'(�� !"#$%&'()'*+,-./�� !"#$%&'()* �� !"#$%&'()* +,-./ 24 SDS-PAGE Western blot � � ! E� � ! " JM 10 9F � � ! m ar ke r 1: 20 � � ! " # $ 1: 20 � � ! " # � � 1 � � 2 � � ! E� � ! " JM 10 9F � � ! m ar ke r 1: 20 � � ! " # $ 1: 20 � � ! " # � � 1 � � 2 (M r × 103) 220 97 66 45 30 20 14 (His)10-TRX-P450 � � ! " # $ �� !"#$%& �� !�HisTrap FF�� !"#ExcelGel SDS�� 8-18�Multiphor II�� !" LMW-SDS Marker�� �� !"#$%&'()*+,-./"0!123�� !"#$%&'()*+,-./0�� !"#$% �� !"#$�� !"#$%&'(")*+,-./0123456789:�� !"#$%&'�� ! �� �� !"#$%&$'()*+,-./0123��HisTrapTM FF�� !"#$%&'()*+,-.� �� !"#$%&'( ���HisTrap FF�� 1�� ����� !"#�$%&'()"MBP� E. coli �� !�� !" 43 000 ����� 1�� !" �� �HisTrap FF�� !"#$%&'() �� !�1�� �� !��� !"#$%& SDS-PAGE 25 ��� �� !"#$MBP�� !"#$%&'()*+,-./0 � � 3� 50 0 m M � � ! � � ! m ar ke r 1 :1 0 � � ! " # $ % & 5 � � 10 m M � � ! � � 1� 10 m M � � ! � � 2� 30 m M � � ! � � 3� 50 m M � � ! � � 1� 10 0 m M � � ! � � 2� 30 0 m M � � ! (M r × 103) 97 66 45 30 20 14 MBP-(His)6 �� ! E��F �� ! 1�� �� ! EmMF �� 1 �� 2 �� 3 �� 1 �� 2 �� 3 500 400 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 30 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 A280 简单的一步纯化 特色产品：HisTrap HP，ÄKTAprime plus 高纯度的组氨酸标签蛋白可以使用色谱系统经过一步纯化获得。在显示的例子中，一步梯度洗脱用来有效的纯化组氨 酸标签蛋白。通过使用 ÄKTAprime plus上优化的操作程序，纯化过程非常简单。 样品：表达组氨酸标签蛋白的澄清的 E. coli匀浆液 柱子：HisTrap HP 1毫升 结合缓冲液：20 mM磷酸、500 mM 氯化钠、20 mM咪唑、pH 7.4 洗脱缓冲液：20 mM磷酸、500 mM 氯化钠、500 mM咪唑、pH 7.4 系统：ÄKTAprime plus 小结： 35分钟内使用一步洗脱获得了有效的纯化。 26 洗脱 缓冲液% 100 80 0 60 40 20 5 10 15 20 25 30 35 min 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A 280 � � ! " # $ �� !"#$%&'() �� !" �� !�HisTrap FF�� ÄKTAexplorer�ExcelGel SDS�� 8-18� Multiphor II�� !"LMW-SDS Marker�� �� !"#$%"&'()*+,-./01234�� !"#$%&'()(*+,�� !"#$%&'( �� !"#$%&'()*+,-.�� !"#$%&'(")*+,-./"0123�� !"#$ %� �� !"#$%&'() ���HisTrap FF�� 5�� ���130�� !"#$%&'()*$ YNR064c E�� !"#$F �� �� !"�20 mM�� !500 mM�� !75 mM�� pH 7.4 �� !"�20 mM�� !500 mM�� !500 mM�� 3 mM�� !pH 7.4 ���5�� !" ���ÄKTAexplorer 100 27 ��� �� !"#$%&'()*+,-./0123!)4567 SDS-PAGE (M r × 103) 97 66 45 30 20 14 ← (His)6-YNR064c � � ! m ar ke r � � ! 1: 2 � � ! " # 1: 4 � � ! " # �� �� % 100 50 0 0 100 200 300 400 ml 0 3000 1000 2000 A280 mAU 4000 5000 结合柱上重新折叠的 一步纯化 特色产品：HisTrap HP、ÄKTAexplorer 、Biacore 系统 一些组氨酸标签蛋白在 E. coli中以包涵体的形式表达。包涵体是缺乏生物学活性的错误折叠的不可溶蛋白聚集物。这 个难题，可以通过使用简单但是有效的方法加以解决，即结合纯化和柱上重新折叠的过程来产生纯化并且具有活性的 蛋白质。组氨酸标签 scFv 57P抗体片断，在E. coli中以包涵体的形式表达，溶解在盐酸呱啶中，在HisTrap HP柱子中 上样。污染物去除后，接着通过将缓冲液更换为非变性缓冲液，使蛋白在柱上发生重新折叠。来自烟草花叶病毒的肽 段和洗脱液 (含有重新折叠的组氨酸标签蛋白) 的结合实验在 BiacoreTM系统上使用表面等离子共振 (SPR) 进行。 样品：10毫升可溶的组氨酸标签单链 Fv抗体片断 (Fab 57) 柱子：HisTrap HP 1毫升 溶解缓冲液：20 mM Tris-HCl、6 M盐酸呱啶、1 mM DTE、1 mM Na2-EDTA、0.1 mM Pefabloc TM、pH 7.5 变性结合缓冲液：20 mM Tris-HCl、5 mM咪唑、500 mM 氯化钠、8 M尿素、1 mM DTE、0.1 mM Pefabloc、pH 7.5 重新折叠缓冲液：20 mM Tris-HCl、5 mM咪唑、500 mM 氯化钠、500 mM盐酸精氨酸、1 mM 还原型谷胱甘肽 (GSH)、1 mM 氧化型谷胱甘肽 (GSSG)、pH 7.5 自然状态结合缓冲液：20 mM Tris-HCl、10 mM咪唑、500 mM 氯化钠、pH 7.5 自然状态洗脱