基因重组与基因工程一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrebination),又称基本重组。是最基本的DNA重组方式,通过链的断裂与再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。二、细菌的基因转移与重组(一)接合作用(conjugation):当细胞或细菌通过菌毛相互接触时,质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞(细菌),这种类型的DNA转移称为接合作用。质粒:细菌染色体外的环状双链DNA分子。可接合质粒,如F因子(Ffactor)(二)转化作用(transformation):通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。(三)转导作用(transduction):当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来、再次感染另一(受体)细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。第二节重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念(一)DNA克隆(也称基因克隆或重组DNA)应用酶学的
方法
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,在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子,再通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,经扩增提取获得大量同一DNA分子。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程----实现基因克隆所采纳的方法及相关的工作称基因工程,又称重组DNA工艺学。目的:1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)(二)工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠⅡ类酶识别序列特点—回文结构BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口(三)目的基因(又称外源DNA)cDNA:经反转录合成的、与RNA(mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。基因组DNA:在真核生物体,基因组是指一套完整单倍体DNA(染色体DNA)与线粒体DNA的全部序列。(四)基因载体(克隆载体):为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采纳的一些DNA分子。常用载体:质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA克隆载体(cloningvector):为使插入的外源DNA序列被扩增而专门设计的载体。表达载体(expressionvector):为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而专门设计的载体。二、重组DNA技术基本原理及步骤1、目的基因的获取2、基因载体的选择与构建3、目的基因与载体的拼接4、重组DNA分子导入受体细胞5、筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子(转化子)(一)目的基因的获取1、化学合成法要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库:存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。3、cDNA文库:以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,即获得cDNA文库(cDNAlibrary)。组织或培养细胞载体mRNAcDNAcDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特征(二)克隆载体的选择常用载体:质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准:能自主复制;具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选与鉴定;有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;分子量小,以容纳较大的外源DNA。(三)外源基因与载体的连接1、粘性末端连接:同一限制酶切割位点连接配伍末端连接2、平端连接适用于:限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端3、同聚物加尾连接由末端转移酶作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。4、人工接头:由平端加上新的酶切位点,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。(四)重组DNA导入受体菌:受体菌条件:安全宿主菌限制酶与重组酶缺陷处于感受态
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