生化药物制备第五章-植物细胞工程PPT幻灯片

植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。第一节基本概念1、植物细胞全能性在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导产生器官分化和再生，成为具有与母体植株相同遗传信息的植株的能力。植物细胞全能性的相对性不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应；细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体。4、细胞脱分化（dedifferentiation)是指失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生组织状态，或胚性细胞状态。细胞脱分化阶段启动阶段：表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；演变阶段：此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态。5、细胞再分化（redifferentiation)：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下，重新变成未分化的细胞（胚状体）和组织的过程。*分化与脱分化的细胞核组织的过程。极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。愈伤组织形成胚状体一般有两个途径：1、由体细胞或性细胞，通过脱分化形成胚状体。2、通过愈伤组织直接形成胚状体黑暗培养下烟草愈伤组织6、植物的无菌培养植物培养/愈伤组织培养/悬浮培养/器官培养/胚胎培养愈伤组织(callus)：脱分化后的细胞，往往经过细胞分裂形成一团无特定结构和功能的松散的薄壁细胞团。7、细胞培养指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增值及分化的培养实验。其目的是为了得到单细胞无形繁殖系。8、分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。如茎尖分生组织，该组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。9、外植体用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部分如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。10、无性繁殖系又叫克隆，植物细胞工程中指使母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。11、突变体经过确认已发生遗传变异或新的培养物至少是通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞，叫做突变体。单细胞无性系：由单细胞形成的无性系单细胞变异体：从统一组织中分离得到的无性系，但彼此间不同12、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养。连续许多代得培养即为继代培养，又称连续培养。13、次级代谢作用和次级代谢产物次级代谢作用：由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。次级代谢产物特征：1、有明显的分类学区域界限2、生物合成需要在一定的条件下才能发生3、缺乏明确的生理功能4、是生命活动的多余成分植物组织培养程序1、配制半固体培养基2、无菌操作切取一些小块组织3、获得愈伤组织4、诱导愈伤组织5、再生新植株出现脱分化通过调节营养物质和植物生长调节剂的适当配比离体、消毒的植物器官、组织或细胞植物体根、芽脱分化再分化植物组织培养愈伤组织脱分化胚状体再分化第二节植物细胞工程发展简史19世纪上半叶，Schleiden和Schwann提出了细胞学说。20世纪20年代初至30年代，在胚胎培养和器官培养领域取得了一些成果。30年代末至40年代，研究集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系。40年代末到50年代，植物组织培养进入崭新阶段。60年代初，分离出植物的原生质体。70年代中叶，开发培养基和培养研究方法。75-85年间，优化细胞生长和次级代谢产物形成产物的研究。第三节植物细胞的形态及生理特性一植物细胞的形态二植物细胞的结构特征三植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分四植物培养细胞的生理特性一、植物细胞的形态植物细胞的亚显微结构（质膜）洋葱表皮细胞显微结构细胞壁细胞核液泡细胞质二、植物细胞的结构特征模式植物细胞构造细胞壁胞间层初生壁次生壁后含物原生质体贮藏物质晶体细胞膜细胞质细胞器细胞核模式植物细胞模式植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分组成质体线粒体液泡内质网核糖体高尔基体动植物细胞区别细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细胞没有三、植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分1生理活性物质A酶B维生素C植物激素D抗生素和植物杀菌素2其他成分A生物碱B糖苷类C挥发油D有机酸四、植物培养细胞的生理特性延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快加速期：最大生长期，最大细胞浓度对数期：细胞数呈对数增加稳定期：细胞高液泡化，积累代谢产物，非常脆弱*悬浮培养的植物细胞很少以单一细胞悬浮状态进行生长，多以非均相集合体的细胞团形式存在。细胞团产生的原因：*细胞没有进行分裂后分离。*细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其他方式形成黏性表面。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株、制造人工种子获得细胞或细胞分泌蛋白第四节植物细胞培养的基本技术一植物材料的准备二培养基及其组成三培养方法最重要的是无菌植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。如果是来自温室或者大田的植物种子、幼苗。器官、组织等，可能带有多种生长迅速的微生物。一、植物材料的准备植物组织培养时表面处理的常用灭菌剂不同器官的灭菌方式不同（表5-6）1无机盐：大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等。2碳源：糖类，肌醇等直接通过光合作用吸收CO2二、培养基及其组成3.植物生长调节物质植物激素是指植物代谢过程中自身形成的植物生长调节剂。包括生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。（1）生长素类:(例）在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程,每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养，通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.5～1mg/L。在这样一种培养上,愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团,称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代,胚性细胞团的数量不断增加,但并不出现成熟的胚。然而,如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养上,它们就能发育为成熟的胚。*另：吲哚乙酸(2)细胞分裂素类:既或促进也可抑制体细胞胚的发生,这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言,细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用,特别有利于子叶的发育。另外有研究表明,不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性,如在胡萝卜的研究中发现,虽然激动素对胚胎发生过程表现抑制作用,但浓度为0.1μM的玉米素却能促进这个过程,而6-BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖,但不形成胚性愈伤组织。*植物组织的生长主要取决于生长素和分裂素的比例。4.氮源植物组织和细胞培养实验中使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物或各种氨基酸。氮源有还原态氮(NH4+)和氧化态氮(NO3-)两种。在以KNO3为唯一氮源(如White培养基)的培养上建立起来的愈伤组织,去掉生长素以后不能形成胚。5.维生素三、培养方法按培养基类型分为：固体培养和液体培养1.分批培养法2.半连续培养法3.连续培养法4.固定化培养法植物组织培养技术的流程第五节影响植物次级代谢产物积累的因素影响植物次级代谢产物生产和积累的主要因素有：生物条件/物理条件/化学条件/工业培养条件一、外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。二培养条件的影响1.内在因素（菌种和营养条件）*接种和诱导*培养基成分磷、氮、铜、碳源、植物生长调节剂、O2和pH2.两步法培养第一步使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）的培养方法。3.外在因素（环境条件）温度，搅拌频率，容器，光照影响影响因子外因内因遗传性状生理状态营养条件环境条件无机盐有机物激素天然复合物渗透压酸碱度湿度温度光照第六节植物细胞培养的生物反应器一、植物细胞与微生物细胞的差异在形态、生理和结构上差异显著二、生物反应器细胞大规模生产的为发酵罐；产生次级代谢产物的装置称为生物反应器三、生物反应器的种类a、摇瓶b、搅拌型生物反应器c、环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器1、机械搅拌式生物反应器2、鼓泡塔生物反应器3、气升式生物反应器4、转鼓式生物反应器5、固定化细胞生物反应器四、各种生物反应器性能比较第七节进展与展望一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用诱导子是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应的的因子。诱导子能快速、高度专一性的诱导特定基因的表达。1、诱导子的分类（1）、定义（2）、内源性诱导子（3）、外源性诱导子①多糖类②糖蛋白类③蛋白类④不饱和脂肪酸类2、诱导子引起的生理生化反应：①膜脂超氧化和膜膜结构功能的改变②形成和积累抗微生物的低相对分子质量植保素③蛋白酶抑制物的积累④合成和分泌降解微生物细胞壁的酶3、诱导子在组织/细胞培养及其次生代谢产物生物合成研究中的应用①糖蛋白类诱导子②蛋白质类诱导子③多糖类诱导子④微生物类诱导子对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素。二、前体饲喂前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。主要包括3种结构单位的供应：莽草酸/氨基酸/乙酸三、两相法培养基本出发点：在细胞外创造一个次级代谢产物的贮存单元。条件：①添加固相无毒害作用②产物易被固相吸附或被有机向溶解③两相易分离④如为固相，不可吸附培养基中的添加成分四、转基因技术在次级代谢产物中的应用1、冠瘿组织和毛状根培养技术2、转基因植物和活性成分生产五、植物生物转化技术与生物制药1、概述（1）定义生物转化：也称生物催化，指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。（2）、生物转化的优点①、可以再实验室中生长，实验重现性好②、细胞可以无限生长，培养物可以大量累积③、生长循环周期短，利于实验进行。（3）、可用于生物转化的化合物种类（4）、植物生物转化的意义