酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验(ELISA) 　　免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能,以酶作标记物,利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的,它既可用于抗原的诊断,也可进行血清抗体的检测。 　　本试验是通过化学方法将酶与抗体(或抗原)结合起来, 标记后的抗体(或抗原)仍然保持与相应抗原(或抗体)相结合的免疫学活性。例如,酶抗体与相应抗原结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解、氧化而生成有色物质,有色产物的出现,客观地反映了酶的存在,根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量,达到定性和定量的目的。 　　免疫酶技术已经广泛地用于传染性疾病的诊断,血清流行病学调查和抗体水平的评价,微生物抗原的检测及其在感染细胞内的定位。 　　目前在兽医防治的研究和实践中,对于猪瘟、伪狂犬病、 繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病, 均采用免疫酶技术进行病原诊断，抗体检测和血清学流行病调查,并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。 　　利用免疫酶技术测定抗原或抗体的方法很多，下面仅简要介绍两种适合猪场使用的免疫酶技术。 　　(1) 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) 　　①材料 硝酸纤维滤膜(孔径0.45微米),0.01摩/升、 pH值7,2的磷酸盐缓冲盐水,封闭液(磷酸盐缓冲盐水加入 10%马血清或0.1%明胶),30%双氧水(H2O2),3,3′-二氨基联苯胺(DAB)抗原液,阴性对照,待检液,待检血清,阳性血清及阴性血清,酶标免抗猪免疫球蛋白G(IgG),0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液,洗涤液(磷酸盐缓冲盐水加入 0.05%吐温-20)。 　　②操作 　　检测抗原 　　1)硝酸纤维滤膜(NCM)的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格,在方格中央用蘸水笔尖的圆尾末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟,取出后晾干备用。 　　2)点样：取1微升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样,同时设立阳性与阴性对照,自然干燥或置37℃温箱中干燥。 　　3)封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中,37℃30分钟, 用洗涤液洗涤1次,约3分钟。 　　4)加工作浓度的猪阳性血清,将硝酸纤维滤膜置于猪阳性血清中,37℃作用1小时,取出用洗涤液洗涤3次,每次3 分钟。 　　5)加酶标兔抗猪免疫球蛋白G,37℃作用1小时,然后洗涤3-4次,每次3分钟。 　　6)加底物溶液(0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液 100毫升,加3,3′-二氨基联苯胺40毫克,30%双氧水50微升),作用5－20分钟。 　　7)终止显色,将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2－3分钟 　　8)自然干燥,或37℃下干燥。 　　9)判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ： 　　"一" 不呈现斑点,与阴性对照相同。 　　"+" 斑点较弱或点内有不均质的棕色点。 　　"++" 斑点浅棕色,对比度清晰。 　　"+++" 介于++和++++两者之间。 　　"++++" 斑点深棕色,背景白色。 　　出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot- ELISA效价。 　　10) 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 ：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体,如 3,3′-二氨基联苯胺,4-氯-1-萘酚等,不能使用可溶性供氢体； 根据试验的目的要求,确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清白蛋白(BSA)或明胶溶液等进行封闭,根据预备试验选择最佳封闭条件。 　　检测抗体 　　1)硝酸纤维滤膜的处理,同检测抗原。 　　2)点样：取己知抗原液点样,自然晾干或37℃干燥。 　　3)封闭,同检测抗原。 　　4)将点样后的硝酸纤维滤膜按点样格子剪成小块,置入系列稀释的待检血清(1：10,1：50,1：100,1 ：200,1 ：400, 1：800,1：1600,1：3200,1：6400,1：12800)中,同时设立阳性和阴性血清对照,37℃作用1小时,然后用洗涤液洗涤3次,每次3分钟。 　　5)以下均同检测抗原6),7),8),9),10)项操作。 　　(2)酶联免疫吸附试验(ELISA) 　　 本试验是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种测定方法,以物理吸附法制备免疫吸附剂。现介绍猪病诊断中常用的两种方法-间接法和夹心法。 　　　①间接法 将已知抗原吸附(或称包被)于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原,随后加入含有特异性抗体的被检血清,感作后洗涤未起反应的物质,加入酶标抗同种球蛋白(如被检血清是猪血清,则需用抗猪球蛋白),感作后再经洗涤,加入酶底物,底物被分解后出现颜色变化,颜色变化的速度及程度,与样品中的抗体量有关,即样品中的抗体愈多,颜色出现愈快、愈深。 　　材料：0.05摩/升、pH值9.6碳酸盐缓冲液,稀释液用 0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,5%犊牛血清),洗涤液用0.01摩/升、pH值7.2磷酸盐缓冲盐水(含0.13摩/升氯化钠,0.05%吐温-20),30%双氧水, 邻苯二胺(OPD),pH 值5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,2摩/升硫酸,抗原,阳性血清,阴性血清,待检血清,酶标兔抗猪免疫球蛋白G,40孔聚苯乙烯酶联板,酶联免疫检测仪。 　　操作： 　　1)用碳酸盐缓冲液配制一定浓度的抗原包被液包被酶联板,每孔100微升,置37℃条件下2小时,或在4℃冰箱内过夜。 　　2)倾去孔内液体,用洗涤液加满各孔,洗涤3次,每次3 分钟,然后倾尽洗涤液。 　　3)除调零孔外,其余孔加入用稀释液稀释的待检血清,每孔100微升,同时设立阳性、阴性血清对照,置37℃下反应 1.5小时。 　　4) 抗体效价测定：将待检血清进行倍比稀释,每份血清加二排孔,即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔，每孔l00微升,调零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置 37℃反应1.5小时。 　　5)洗涤同2)。 　　6)除调零孔外,每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升,置37℃下反应1.5小时。 　　7)洗涤同2)。 　　8)每孔加入新配制的底物溶液(取邻苯二胺40毫克,溶于100毫升pH值5磷酸盐-柠檬酸缓冲液,临用前加入30% 双氧水0.15毫升)100微升,室温下观察显色(5－30分钟)。 　　9)每孔加入50微升2摩/升硫酸终止反应。 　　10)用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度(OD)值。 　　②夹心法 本法是检测抗原的方法,将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面,然后加入含有抗原的溶液,使抗原和抗体在固相表面形成复合物,洗除多余的抗原,再加入酶标记的特异性抗体,感作后冲洗,加入酶的底物,颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。 　　材料：同间接法。 　　操作(以检测猪瘟病毒抗原为例)： 　　1)抗体包被：将一定浓度的猪瘟高免血清(用碳酸盐缓冲液进行稀释)包被酶联板,每孔100微升,置37℃下2小时, 或4℃冰箱中过夜。 　　2)洗涤：同间接法 　　3)加被检样品,除调零孔外,每份样品加2个孔,每孔加 l00微升,同时设立阳性抗原、阴性抗原对照,酶结合物对照 (抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物),置37℃下反应1.5－2 小时。 　　4)洗涤,同2)。 　　5)加底物溶液,同间接法8)。 　　6)同间接法9)。 　　7)同间接法10)。 　　③结果判定 常用的判定方法有3种。 　　阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2－0.4 为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD(标准差)。 　　阳性阴性比(P/N)法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2－3者为阳性。 　　终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度为该样本的滴度。 　　④注意事项 　　第一,包被过程中以高pH值和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1－100毫克/毫升选择最佳浓度。 　　第二,血清或抗原稀释液应含5%－10%异种动物血清, 或1%牛血清白蛋白,或0.5%明胶,以起封闭作用,防止非特异性反应,否则应在2)与3)步之间加封闭液进行封闭。 　　第三,洗涤要充分,酶结合物应按要求进行稀释和使用, 底物溶液一定要现配现用。 　　第四,显色时,阴性对照刚出现微黄色时应立即终止反应。. 　　第五,用阳性阴性比方法判定结果时,阴性对照孔若小于0.1,则易出现误判。 　　第六,用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。 　　第七,同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值为该稀释度的光密度值,对照孔应做同样处理。 　　(3)猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验 　　①材料 本试验的试剂盒由中国兽药监察所提供,本抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原,分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。同时提供酶标抗体,阳性、阴性血清,酶联板及其他器材和试剂。 　　②试验方法 　　第一,用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各作l00倍稀释,以l00微升分别加入做好标记的酶联板孔中,置湿盒于4℃过夜。 　　第二,弃去孔内液体,用洗涤液冲洗板3次,每次间隔3－ 5分钟,拍干。 　　第三,用稀释液将待检血清作400倍稀释,每孔加入100 微升,同时将猪瘟阳性、阴性血清以100倍稀释作对照,37℃下培育1.5－2小时。 　　第四,重复第二步。 　　第五,用稀释液将兔抗猪免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释,每孔加入100微升,37℃下培育1.5－ 2小时。 　　第六,重复第二步。 　　第七,每孔加入底物溶液(每块板所需的底物溶液按邻苯二胶5毫克加底物缓冲液5毫升加30%双氧水18.75微升配制)100微升,室温下观察显色反应(一般阴性对照孔略微显色,立即终止反应,并以阴性孔作空白调零)。 　　第八,每孔加入终止液50微升,于酶联读数仪上测定490纳米波长的光密度(OD)③判定标准 　　在猪瘟弱毒酶联板上： 　　光密度>0.2为猪瘟弱毒抗体阳性, 　　光密度<0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。 　　在猪瘟强毒酶联板上： 　　光密度≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性； 　　光密度<0.5为猪瘟强毒抗体阴性。 　　④注意事项 　　第一，运输单抗纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输。 　　第二,配制洗涤液时,应使用新鲜蒸馏水或无离子水；每次洗板后,尽量不使孔中有残余液体,以免影响结果。 　　第三,底物溶液临用前配制,待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加双氧水,混匀后立即加入孔中。 　　第四,终止反应后,应立即读数。