SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 24 卷第 4 期 湖 　北 　工 　业 　大 　学 　学 　报 2009 年 08 月 Vol. 24 No. 4 　Journal of Hubei University of Technology Aug. 2009 [收稿日期 ] 2009 - 04 - 07 [作者简介 ] 叶长春 (1970 - ) , 男 , 湖北武汉人 ,湖北工业大学硕士研究生 ,研究方向 :基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 . [文章编号 ] 1003 - 4684 (2009) 0420016203 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的改进 叶长春 (湖北工业大学生物工程学院 , 湖北 武汉 430068) [摘 　要 ] 针对常规的 SDS2PA GE 染色脱色耗时长 ,还需使用甲醇的缺点 ,对传统的 SDS2PA GE 染色脱色进 行了改进 ,用无毒的乙醇替代有毒的甲醇. 改进后的 SDS2PA GE 染色脱色具有耗时短 ,且不需要使用甲醇的 优点. [关键词 ] SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS2PA GE) ;染色 ;脱色 ;考马斯亮蓝 [中图分类号 ] Q51 [文献标识码 ] : A 　　SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种检测蛋白质 纯度、评估蛋白质分子量的生化分析方法. 电泳后的 凝胶可以通过多种染色法对蛋白质进行检测 ,最常 用的是考马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue , CBB) 染色法[1 ] . 此法具有特异性强、操作简单及干扰因素 少等优点. 因为凝胶中存在 SDS , SDS 的存在干扰 了考马斯亮蓝与蛋白质的结合. 而甲醇可以破坏凝 胶中的 SDS ,使考马斯亮蓝染色得以顺利进行 ,所以 通常对电泳后的凝胶采用含甲醇的染色液和脱色 液. 甲醇是一种无色、透明、易燃、易挥发的有毒液 体 ,经人体代谢产生甲醛和甲酸 (俗称蚁酸) . 甲酸会 累积在眼睛部位 ,破坏视觉神经细胞 ,产生永久性损 害. 甲酸进入血液后 ,会使组织酸性越来越强 ,损害 人体肾脏 ,导致肾衰竭[ 2 ] . 而对凝胶染色脱色过程不 可避免会泄漏一定数量的甲醇 ,这会使操作人员的 健康受到损害. 本文对传统的考马斯亮蓝 (Coomas2 sie brilliant blue , CBB)染色法进行了一定的改进 , 改进后的方法与传统的方法具有同样的效果. 1 　材料与仪器 诱导前与诱导后的大肠杆菌培养液各取 1 mL 、 丙烯酰胺、N ,N′- 甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵购自 天津第一化学试剂厂 ; Tris 碱、SDS、TEM ED、甘氨 酸等购自上海国药集团. 以上试剂均为分析纯. 电泳仪 ,上海天能科技有限公司 EPS2300 型 ; 电泳槽 ,上海天能科技有限公司 V E2180 型电泳槽 ; 恒温水浴锅 ,上海一恒科技公司 HWS226 产品. 2 　方法与步骤 2. 1 　样品的准备 将诱导前后的大肠杆菌培养液各取 1 mL ,加在 EPPENDORF 管中 ,以 12 000 r/ min 离心 15 min , 弃上清 ;再加 500μL 超纯水 ,混匀 ,12 000 r/ min 离 心 15 min ,弃上清 ;再加 30μL 超纯水 ,混匀. 2 . 2 　SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS2PAGE) 2 . 2 . 1 　溶液的配制 　贮液 100 mL :30 g 丙烯酰胺 ; 0. 8 g N , N′- 甲叉双丙烯酰胺. 加超纯水定容至 100 mL ,4 ℃保存. 分离胶缓冲液 (4 ×) 100 mL : Tris 碱 18. 17 g ; l0 %SDS 溶液 4 m L . 用浓 HCL 调至 p H 8. 8 ,加超 纯水定容至 100 mL ;4 ℃保存. 压缩胶缓冲液 (4 ×) 100 mL : Tris 碱 6. 06 g ; l0 %SDS 溶液 4 mL ;用浓 HCL 调至 p H 6. 8 ,加超 纯水定容至 100 mL . 4 ℃保存. Tris2甘氨酸电泳缓冲液 (1 ×) 800 mL : Tris 碱 2. 423 g ;甘氨酸 11. 525 g ; l0 %SDS 溶液 8 mL . 加 去离子水定容至 800 mL . 样品缓冲液 (2 ×) 10 mL :压缩胶 buffer (4 ×) 5 mL ;SDS 干粉 0. 4 g ;甘油 2 mL ;溴酚蓝 0. 2 mg. 加 水至 10 mL . 由于丙烯酰胺、N ,N′- 甲叉双丙烯酰胺均具有 神经毒性 ,配制贮液时 ,操作人员应戴上口罩 ,在通 Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 风橱内配制. 2. 2. 2 　分离胶的灌制 　分离胶体积分数为 15 % , 厚度为 0. 75 mm. 配制 8 mL 分离胶需贮液 4 mL , 分离胶缓冲液 2 mL ,超纯水 2 mL ,10 %过硫酸铵 45μL , TEM ED 15μL . 按电泳槽说明书组装凝胶模 具 ,用吸管吸取 3. 3 mL 分离胶溶液 ,沿隔板缓慢加 入模具内 ,小心避免产生气泡 ,当加入的溶液至前玻 璃板 1. 5 cm 时即可. 轻轻在分离胶溶液上覆盖一层 1～5 mm 的超纯水层 ,这使凝胶 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面变得平整. 等 待 30～60 min ,使凝胶聚合. 凝胶配制过程要迅速 , 催化剂 TEM ED 要在注胶前再加入 ,否则凝结无法 注胶. 注胶过程最好一次性完成 , 避免产生气 泡[3～4 ] . 2. 2. 3 　压缩胶的灌制 　压缩胶体积分数为 3 % ,配 制 3 mL . 需贮液 0. 45 mL ,压缩胶缓冲液 0. 75 mL , 去离子水 2. 3 mL ,10 %过硫酸铵 18μL , TEM ED 5 μL . 轻轻吸去水层 ,用吸管吸取压缩胶溶液缓慢加 入 ,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端 ,插入梳子 , 凝胶聚合约 30 min ,小心拔出梳子 ,将凝胶放入电 泳槽内 ,预先接好电极 ,将电泳缓冲液加入内外电泳 槽中 ,使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中. 需同时 放置两块制好的胶 ,如只使用一块则另一面须用电 泳仪生产厂家提供的塑料板代替 ,注意塑料板上的 提示 ,必须使塑料板与橡胶条完全紧贴[324 ] . 2. 2. 4 　制备样品和上样 　取 20μL 样品与 20μL 2 倍样品缓冲液在一个 EPPENDORF 管中混合 ,沸 水煮 10 min (马表计时) ,用 20μL 的小枪吸取样品 10μL 加入样品孔底部. 2. 2. 5 　电泳 　打开电泳仪 ,将电流调至 16 mA ,等 溴酚蓝跑至压缩胶与分离胶的分界面以下约 5 mm 时 ,将电流调至 32 mA ,直至溴酚蓝跑至凝胶底部 , 关闭电源. 这是跑 2 块胶的数值. 若跑 1 块胶 ,则分 别为 8 mA、16 mA. 2. 2. 6 　染色与脱色 　考马斯亮兰染色 ,目前广泛运 用的染色剂是考马斯亮兰 R2250. 考马斯亮兰染色 的机理是利用考马斯亮兰分子上的芳香苯环 ,与蛋 白质的疏水区结合 ;同时其亚硫酸基团 ( - SO2 -3 ) 与蛋白质的正电荷结合 ,可以使凝胶中的蛋白质染 出兰色条带. 该染色法较为便捷 ,是对蛋白质进行电 泳检测和定量分析常用的一种方法[5 ] . 改进前后的两种染色与脱色方法见表 1. 表 1 　改进前后的染色与脱色方法对比 传统方法 改进后的方法 配液 1 配制 1 L 考马斯亮蓝染色液 : 2. 5 g 考马斯亮蓝 R2250 ;甲醇 (100 %) 454 mL ;冰醋酸 92 mL ;去离子 水 454 mL 2 配制 1 L 考马斯亮蓝脱染色液 :甲醇 (100 %) 454 mL ;冰醋酸 75 mL ;去离子水 471 mL 1 配制 1 L 考马斯亮蓝染色液 :考马斯亮蓝 R2250 ,2. 5 g ;乙醇 (95 %) 250 mL ;冰醋酸 80 mL ;去离子水 670 mL 2 配置固定液 :乙醇 , (100 %) 500 mL ;冰醋酸 100 mL ;去离子水 400 mL 步骤 1 戴手套将 SDS2PA GE 凝胶放入盛有 100 mL 考马 斯亮蓝染液的微波炉专用碗中 ,放在微波炉内中火 加热 15 min 2 弃去染液 ,将凝胶在水中漂洗 3 次 3 加入考马斯亮蓝脱色液 100 mL ,放在微波炉内中 火加热 25 min. 需重复加热 4 次 1 戴手套将 SDS2PA GE 凝胶放入盛有 100 mL 固定液的微波炉 专用碗中 ,放在微波炉内中火加热 5 min 2 将固定液倒入另一个碗中 ,将凝胶在去离子水中漂洗 3 次 3 加入考马斯亮蓝染色液 100 mL ,放在微波炉内中火加热 5 min 4 弃去染液 (可回收重新利用) ,将凝胶在去离子水中漂洗 3 次 5 加入先前使用过的固定液 ,放在微波炉内中火加热 5 min ,只 需要重复加热 1 次.凝胶体积会缩小 ,颜色完全脱去 6 将凝胶在水中漂洗 5 min 后 ,凝胶体积逐步恢复正常 ,凝胶出 现条带 ,先是紫红色 ,再逐步变成蓝色 3 　结果与分析 从电泳试验结果 (图 1) 可以看出 ,使用甲醇脱 色液的电泳图片和使用乙醇脱色液的电泳图片基本 没有差异. 传统的染色与脱色 ,一般先用考马斯亮蓝 R2 250 染色液 (冰醋酸 - 甲醇体系) 对电泳后的 SDS2 PA GE 凝胶染色 ,再用常规脱色液 (冰醋酸 - 甲醇体 系) 脱色 ,不仅时间长 ,考马斯亮蓝染液使用一段时 间后其染色效果还会下降 ,甲醇有一定毒性 ,操作时 不够安全. 而改进后的染色与脱色 ,电泳后 ,先用固 定液 (冰醋酸 - 乙醇体系) 在微波炉内用中火对 SDS2PA GE 凝胶进行处理 ,这是因为 SDS 对热不稳 定 ,在 80 ℃以下才是稳定的[6 ] . 在微波炉内用中火 对 SDS2PA GE 凝胶进行处理 ,可以使 SDS2PA GE 凝胶的温度达到 100 ℃,从而分解了 SDS ,解除了 SDS 对考马斯亮蓝染色的扼制 ,使考马斯亮蓝染色 得以顺利进行. 然后用考马斯亮蓝 R2250 染色液 (冰 醋酸 - 乙醇体系) 在微波炉内中火加热 5 min , 再 71　第 24 卷第 4 期 　　　　　　　　　　　叶长春 　SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight Administrator Highlight © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 用固定液进行脱色. 这样做只需 30 min ,远低于传 统的染色与脱色的 1 h ,而且由于完全不使用甲醇 , 降低了成本 ,有利于操作人员的身体健康 ,改进后的 方法优于传统的方法. 图 1 　SDS2PA GE 图谱 [ 　参 　考 　文 　献 　][1 ] 　郭尧君. 蛋白质电泳实验技术 [ M ] . 北京 :科学出版社 ,1999 :92 - 118.[2 ] 　谢克昌. 甲醇及其衍生物 [ M ] . 北京 :化学工业出版社 , 2002 年 6 月.[ 3 ] 　Merril C R. Gel2staining techniques[J ] . Methods Enzy2mol ,1990 ,182 :477 - 488.[4 ] 　汪家政. 范 　明. 蛋白质技术 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 [ M ] . 北京 :科学出版社. 2000 :77.[5 ] 　何忠效 ,张树政. 电泳[ M ] . 北京 :科学出版社. 1999.[6 ] 　国家技术监督局. 十二烷基硫酸钠 ( GB/ T15963 -1995) [ S] . 北京 :中国标准出版社 ,1996208201. A Modif ied Method for SDS2PAGE Staining YE Chang 2chun ( S chool of B iotechnolog y , H ubei Uni versi t y of Technolog y , W uhan ,430068 , Chi na) Abstract : SDS2Polyacrylamide Gel Elect rop horesis (SDS2PA GE) is easy to operate and has reliability , but it has t he disadvantages of taking a long time in t he conventional staining and decolorization and requiring t he use of met hanol . In t his paper , a modified met hod for SDS2PA GE staining is p ut forward , which takes shorter time in t he conventional staining and decolorization and requires no methanol in t he p rocess. Keywords : SDS2polyacrylamide gel elect rop horesis (SDS2PA GE) ; staining ; decolorization ; Coomassie bril2 liant blue [责任编校 : 张 　众 ] 81 湖 　北 　工 　业 　大 　学 　学 　报 2009 年第 4 期 　 Administrator Highlight