食品毒理学实验方案

实验一 实验动物的一般操作技术 1、​ 实验目的 学习食品毒理学试验中有关动物试验的基本操作技术，掌握实验动物的选择，性别鉴定，抓取方法，标记方法，染毒方法，生物材料采集和实验动物处死等技术。 2、​ 试剂、器材及动物 苦味酸酒精饱和溶液、美蓝溶液、0.9％的NaCl溶液 托盘天平、电子天平、棉签、1mL注射器、灌胃器、烧杯、容量瓶、定量取血管、玻璃毛细管、鼠笼 昆明种小鼠 三、操作方法 （1）​ 实验动物的选择 食品毒理学研究中，无论应用何种种属、品系的实验动物，都必须是健康动物。动物的选择，应重点检查下述项目。 1.​ 外观 体形丰满，被毛浓密光顺，行动敏捷，反应灵活。 2.​ 眼睛 明亮，瞳孔清晰，双侧等圆，眼内无分泌物，眼睑无肿胀、发红。 3.​ 耳 耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮、糜烂。 4.​ 鼻 无喷嚏，无浆性黏液分泌物。 5.​ 皮肤 无创伤、脓疮、疥癣、湿疹。 6.​ 头颈部 姿势端正。颈项歪斜提示可能存在内耳疾患，不能用于实验。 7.​ 消化道 无呕吐、便秘、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。 8.​ 神经系统 无震颤、麻痹、运动失调，如有转圈运动或倒提时呈圆圈摆动，不能用于实验。 9.​ 四肢及尾 四肢、趾及尾无红肿、溃疡。 10.​ 食欲及营养 良好 （2）​ 实验动物的性别鉴定 1.​ 大鼠、小鼠 主要观察肛门与生殖孔的间距，雄性间距大，而雌性间距小；雄鼠夏天或卧位可见睾丸，雌鼠腹部有明显乳头，大鼠6对，小鼠5对。 （3）​ 实验动物的抓取和固定 实验前应了解动物的一般习性，正确抓取和固定动物，既要大胆，又要细心。 1. 小鼠的抓取方法 先用右手抓取鼠尾部提起，置于实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓取小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手手心中，以无名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。右手则可进行灌胃或注射等操作。 （4）​ 实验动物的称重、编号和标记 1.​ 称重 一般同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的10％，组间同性别动物体重平均值相差应小于5％。 2.​ 编号和标记 （1）​ 染色法 一般采用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位的被毛染色，表示不同号码，此法适用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用的染料有苦味酸酒精饱和液（黄色）、美蓝溶液（蓝色）或甲基紫酒精饱和液、0.5％中性红或品红溶液（红色）等。具体方法为：头部为1号，按顺时针方向，右前肢2号、右肋3号、右后肢4号、尾跟5号、左后肢6号、左肋7号、左前肢8号、背部9号；在相应部位涂染另一种颜色染料表示十位，两种颜色可编1~99号。 （5）​ 实验动物的染毒途径和方法 1.​ 经口染毒 （1）​ 灌胃 将毒物不经口腔和食道，直接灌入胃内。急性毒性试验多用此法。 具体方法：用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部。将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。 进针深度一般是小鼠2.5～４cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。 （2）​ 喂饲 将受试化学物均匀拌入饲料或溶于饮水中，由动物自由采食。适用于染毒时间较长的毒性试验，如亚慢性和慢性毒性试验。 （3）​ 吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入胶囊内，强制动物咽下。适用于易挥发、易水解和有异味的化学物，兔、犬、猫可用此法。 2．注射染毒 外源化学物的毒性研究中，根据试验目的和需要，可选择腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等途径染毒。大鼠和小鼠经尾静脉注射，兔则经耳静脉注射。 （6）​ 实验动物生物材料的采集和制备 毒理学研究中，常常需要采集动物的血液、尿液或组织，测定外源化学物或其代谢物的浓度。因此，生物材料的采集和制备是毒理学研究重要的基本操作技术。 1．大、小鼠采血 （1）鼠尾采血。 适用于用血量较少的试验。固定动物后，将鼠尾浸入45~50℃温水，使尾静脉充血，擦干，用酒精棉球消毒。将尾尖剪去约2~3mm, 拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管内加抗凝剂与否，依试验需要而定）吸取定量尾血，然后用干棉球压迫止血。如需要多次采血，可用火棉胶涂封，下次采血时去掉火绵胶。鼠尾采血亦可用1ml注射器连接5~6号针头直接刺入尾静脉定量采血。 （2）眼眶静脉丛采血。 操作者以一手拇指、食指抓住鼠两耳之间的皮肤，并轻压颈部两侧使眼球充分外突，眶后静脉丛充血，为防止动物窒息死亡，用力要恰当。另一手持玻璃毛细管（长7~10cm, 内径1.5mm）从一侧眼内毗邻部以45度角向眼后方向刺入，捻转前进。如无阻力可继续刺入，有阻力则抽出玻璃毛吸管调整方向后再刺入，直至出血为止，小鼠大约2~3mm，大鼠大约4~5mm。收集血液后，拔出毛吸管，用干棉球压迫止血。本法短期内可重复采血，采血量小鼠一般为0.2~0.3ml，大鼠0.5~1ml。 （3）摘眼球采血。 保定方法同（2）。动物倒立，使眼球外突充血，用小镊迅速摘掉眼球，将血液滴入事先备好的容器内。此法用于鼠类大量采血，仅使用一次。 （4）断头采血。操作者一手握住动物，另一手持剪刀或断头钳快速断头，倒立动物将血液滴入容器，注意防止断毛落入容器中。用于大鼠、小鼠。 （7）​ 实验动物的处死方法 1. 颈椎脱臼法 多用于小鼠，一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾猛力向后拉， 使动物颈椎脱臼，立即死亡。 2.​ 断头法 用于大鼠和小鼠。保定者一手按住鼠头，另一手握住背部，露出颈部，助手持大剪刀或断头器剪断颈部，使之死亡。此法不引起血浆皮质酮、儿茶酚胺升高，常用于血液及化学成分、组织酶测定。 3.​ 击打法 适用于较小的动物。抓住鼠尾、提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡；也可用器具击打动物头部，使其致死。前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。 4.​ 其他 电击法、枪击法、微波法等。 动物处死方法多种多样，原则是根据实验需要进行选择，同时尽量消除动物在试验过程中所致的疼痛和不适，遵守动物试验的职业道德。 3、​ 作业 注明自己所选择实验动物的性别、体重及编号（画图说明） 实验二 亚硝酸盐的急性毒性观察 一、实验目的和原理 急性毒性是机体一次接触或24h内多次接触大剂量外源化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应。亚硝酸盐是食品毒理学中常见的一种化学毒物，通过采用不同途径对小鼠染毒，观察其对毒性的影响及亚硝酸盐急性毒性反应的特征。 二、试剂、器材及动物 亚硝酸钠溶液（10mg/mL） 托盘天平、电子天平、容量瓶、烧杯、注射器、灌胃针、鼠笼、酒精棉球 成年健康小鼠100只（雌雄各半） 三、试验方法 （1）​ 健康动物的选择及性别鉴定 （2）​ 动物称重 （3）​ 亚硝酸盐溶液的配置 （4）​ 灌胃 1．动物的禁食和复食 由于外源化学物质进入胃内后易受胃 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 物作用而降低毒性，胃充盈时其内容物还可影响受试溶液的灌入和吸收，因此灌胃前应禁食6~10h，使动物既保持空腹状态，又不至禁食时间过长，否则动物长期饥饿会影响肝脏，进而影响实验结果。动物灌胃后至少2~3h后才能复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长。 2. 灌胃液浓度和容量 相同剂量的受试化学物，若给以不同浓度可能会产生不同的死亡情况。灌服体积大小亦可影响试验结果，体积太小，太浓，可能产生局部刺激或其他损伤；体积太大，可能引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。经口急性毒性试验中，常常是固定受试化学物体积，根据试验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的剂量用1：K系列稀释法将受试化学物配制成不同浓度的液体剂型灌胃。其灌胃体积以体重的1%~2%计算，最多不超过3%，即小鼠每10g体重灌胃0.1~0.2ml，最多不超过0.3ml，根据实际经验得出灌胃量的极限是，小鼠0.5~1ml；大鼠1~4ml；豚鼠1~5ml；家兔5ml; 鸡10ml/kg和犬50ml/kg。 3. 灌胃操作技术 主要有小鼠、大鼠及豚鼠灌胃法。用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部；②大鼠、豚鼠保定，一手抓住大鼠、豚鼠双耳后至背部皮肤。均将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。 进针深度一般是小鼠2.5～４cm，大鼠或豚鼠４～６cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。 （五）静脉注射染毒 四、中毒症状观察 1.​ 中毒症状　染毒后认真观察中毒发生、发展过程，中毒特点和毒作用靶器官。观察期间每3d称重一次，对死亡动物和实验结束时的存活动物全部称重，做大体病理学检查，取病变组织做病理组织学检查，为亚慢性、慢性和其他毒性试验剂量和观察指标选择提供参考依据， 并按表2-1做好记录。 表2-1 急性毒性试验观察原始记录 组别 动物编号 性别 体重（g） 染毒计量（mg/kg） 染毒 时间 症状及出现时间 死亡 时间 体重纪录（g） 实验记录者： 记录日期： 2.​ LD50计算 根据受试动物种类确定计算方法，如改良寇氏法、概率单位法、Bliss法等，并在实验前设计计量分组和每组动物数，按选择方法求出LD50及其95％的可信限范围。如毒性反应存在种属或性别差异，应分别求出不同种和不同性别动物的LD50。 五、结果评定 根据实验动物的中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用特点，按受试化学物种类分别参照相应化学物经口急性毒性分级标准进行评定，初步判断该受试化学物的毒性大小及毒性特征。 六、作业 完成急性毒性原始记录表，并简要分析不同途径染毒毒性差异的原因。 七、注意事项 1.​ 正确捉拿动物，防止咬伤。 2.​ 防止操作者中毒。 3.​ 剩余受试化学物应在教师指导下销毁。 参考文献： [1] 梁运霞. 动物源食品毒理学基础及检验. 北京：中国农业出版社，2004. [2] 沈建忠. 动物毒理学. 北京：中国农业出版社，2002.