虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究

第6卷第1期 2008年1月 生 肠 加 工 过 程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Jan. 2008 69 虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究 范卫强，尹鸿萍，周长林 (中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009) 摘 要:以虫草发酵菌丝体为原料提取虫草多糖并对多糖进行结构鉴定和初步药效活性研究。采用水提醉沉和离 子交换纤维素进行分离得到两种虫草多糖,HPLC测定相对分子质量，紫外光谱、红外光语、部分酸水解、甲基化分 析和高效液相色讲等方法研究单糖组成及连接方式，四甲基偶氮咬盐微量酶反应比色法(MTT)检测虫草多糖的活 性。经分离得到中性(CPSI)、酸性(CPS2)两种成分，相对分子质量分别为2.56 x 104 , 9. 91 x 104;单糖组成:CPSI n(葡萄糖): n(甘寡糖): n(半乳糖): n(阿拉伯糖)=46:36-.18: 1; CPS2 n(葡萄糖): n(甘露糖): n(半乳糖): n(半乳 糖酸): n(木糖): n(阿拉伯糖):n(鼠李糖)=30:25:14:4:3:3:1。红外语揭示均含一a-4to CPSI主链含(1-,6)糖 普健的高度分支的菊甘落半乳聚糖，另有少量葡萄糖分支点在2,3,4位。CPS2主链含葡萄糖(Glc )、甘露糖 (Man)、半乳糖(Gal)，分支点主要在3位，侧链含多种单糖。CPS1和CPS2都对顺铂(CDDP)损伤的vero细胞有一 定保护作用。 关键词:连接方式;虫草;多糖;分离 中图分类号二TQ464. 1 文献标识码:A 文章编号:1672 -3678 (2008) 01 -0069 -05 Separation，purification and activity of pharmacodynamic action of polysaccharide from Cordyceps FAN Wei-giang,YIN Hong-ping,ZHOU Chang-fin (School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009，China) Abstract :The structure and biological activity of polysaccharides from Cordypes was investigated. The polysaccharide was separated by alcohol and DEAE-celloluse and characterized with HPLC，IR，UV and GC. An acidic polysaccharide CPS2 and another polysaccharide CPS1 were obtained. The molecular weight of CPS1 and CPS2 was 2.56 x 104，9. 91 x 104，respectively. The IR spectra revealed that the two polysaccharides contained ot-linkage. The GUMS indicated that the main chain of CPS1 was com- posed of 1，6-Man, and the branch chains was formed with 2,3,4-Glu;the main chain of CPS2 was was composed of 1, 6-Glu，1,6-Man,1,6-Gal and the branch chain was formed with 1,3-Glu residue. Both of them showed protection activity to the vero cell. Two kinds of polysaccharide contained the Glc,Man and Gal in the main chain, and the obvious protection activity of the kidney cell was observed. Key words; conjugation; Cordeps;polysaccharide; purification 收稿日期:2M -03-22 甚金项目:云南省院校合作项目 作者简介:范卫强(1982一)，男，青海西宁人，硕士研究生，研究方向:徽生物与生化制药。 联 系人:尹鸿萍，女，副教授，E-mail: yinhongping@b hotmail. com 万方数据 70 · 生物加工过程 第6卷第1期 多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过 糖昔键连接在一起的聚合物，是一切有生命的有机 体必不可少的成分，与维持生命的种种生理机能有 着密切的联系。近年来对多糖的分离、纯化、结构 测定、活性测定及结构修饰已成为研究的热点。多 糖分离采用DEAE一纤维素、DEA、凝胶及其他凝胶柱 层析法(国外采用LKB柱层析系统)。多糖结构分 析主要有甲基化法、酸或碱的部分降解法和酶解法 等。冬虫夏草首载于《本草从新》，味甘，性温。归 肺、肾经。具补肺益肾，止血化痰之功效，虫草水提 物中有效部位为虫草多糖，笔者对其进行提取、分 离、纯化得到两种成分，对其结构及初步药效进行 实验，研究结果证明其两种多糖均对肾细胞确有保 护作用。 1 材料与方法 1.1 实验材料 虫草发酵菌丝体长兴制药有限公司 1.2 主要试剂 DEAE一纤维素;vero细胞引自中国科学院上海 生物化学与细胞生物学研究所细胞库;注射用顺铂 锦州九泰药业有限责任公司;标准糖 中国药品生物 制品检定;盐酸、乙醇、氢氧化钠、高碘酸钠均为国 产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯。 2 实验方法 2.1 虫草多糖的提取，分离，纯化 2.1.1 提取 10倍水浸提虫草菌丝体，离心取上清。Sevage 法去蛋白，浓缩并以乙醇沉淀，无水乙醇洗涤，烘于。 2.1.2 离子交换纤维素分离 提取物离子交换层析，先水洗脱后NaCl溶液梯 度洗脱，并分别将两种洗脱成分冻干得中性的CPS1 及酸性的CPS2o 2.2 纯度鉴定及相对分子质A测定 2.2.1 紫外吸收光谱 将CPSI,CPS2配成溶液，在200一400 nun全波 段扫描。 2.2.2 相对分子质量测定[’一21 高效凝胶过滤色谱法。色谱柱:二根多糖专用 凝胶色谱柱串联，流动相0. 3 mol/L NaN03，流速 0. 5 mUmin，柱温35℃;示差折光检测器;样品溶 于流动相中，膜滤后进样。 2.2.3 多糖含量测定 多糖含量测定采用硫酸一苯酚法[3)0 2.3 多糖的结构研究 2.3.1单糖组成分析[[a一51 多糖样水解为单糖，PMP衍生，反相高效液相 色谱/紫外检测器分离检测。色谱条件:色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-Cl8，250 mm x 4.6 mm id，5 Wm;流动相:0. 1 mol/L磷酸盐(pH 6.7)缓冲液一乙 睛(体积比为73: 15);柱温:30℃;检测波长:250 nm;流速:1 mUmin;进样体积:20 wL,, 2.3.2 多糖的红外光谱 多糖与KB:压片[6]，于4000一400 cm一’进行红 外扫描。 2.4 单糖连接方式分析 2.4.1部分酸水解 取CPS I , CPS2各30 mg，依次用0.05 , 0.20 , 0. 50 moUL三氟乙酸分次水解，每次水解后样品透 析并分别将透出液浓缩冻干，水解后得16份样品， 混合标准单糖进行衍生测定。 2.4.2甲基化分析[，一川 (1)梭基还原 称取少量CPS2样品，NaBD4溶液进行竣基还 原;对水透析、冻干后。溶解后用乙醇/甲酸液除去 硼酸根，Nz吹干，得梭基还原多糖样品。 (2)甲基化反应 CPSI和经梭基还原的CPS2多糖样品用无水 DMSO溶解，加入NaOH和碘甲烷进行甲基化反应; 反应液用二氯甲烷萃取，过无水Nat SO,柱，收集滤 液，Nz挥发至干。 (3)甲基化反应产物的水解、还原和乙酞化 甲基化反应产物用TFA水解，N:吹干后，用 NaBH,还原;加甲醇除硼酸根，吹干;再加乙酸醉， 100℃进行衍生反应，再吹干后得糖醇乙酸醋衍生 物。样品用二氯甲烷萃取后，过Nat S04柱，收集滤 液，待GC-MS分析。 (4) GC-MS分析条件 OV1701毛细管柱(F0. 25 mm x 30 mm，膜厚 0. 25 mm)，程序升温:起始温度150℃,3 9C/min升 温至250℃，停留10 min，载气为氦气。El+源。电 子能量70 eV，接口温度250 9C，离子源温度200 qC , 检测器电压1 000 V o 万方数据 2008年1月 范卫强等:虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究 71 2.3 多糖活性研究【121 以含体积分数10%小牛血清的RPMI-1640培 养液培养vero细胞，加人不同浓度的虫草多糖和顺 铂(CDDP), MTT法观察肾小管上皮细胞存活以及 生长的状况，进行统计学处理。并通过倒置显微镜 拍照以观察细胞形态的变化。 3 实验结果与分析 3.1 纯度鉴定及相对分子质量测定 3.1.1 多糖DEAE梯度分离结果 上样后，蒸馏水洗至无糖流出，流出液浓缩冻 干得白色中性多糖CPS1。用0一2 mol/L 梯度洗脱，部分收集器以每管2 mL收集， 法测人.，得梯度洗脱曲线见图to NaCl溶液 硫酸苯酚 一 NaCl浓度 - A,9o 1.4 1.2 1.0 0.8?? ? ? ? ? ? ? ? ? ?， ， ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ??? ? 。? ?????? 0 4 10 16 22 图1 Fig. I The 28 34 40 46 52 58 管数 多糖梯度洗脱曲线 curves of gradient elution 盐浓度计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 : c=c，一(c，一c, )俨1IA2 (A,=A2，所以公式变为 c=C，一(c，一CB) V，做曲线)。式中:CA ICa为两容器 中的盐浓度;A?A:为两容器的截面积;V为已流出 洗脱量对溶液总量的比值。 由图1可知:酸性成分为纯一组分，由图计算得 其洗脱盐浓度为0. 27 mol/L。将盐洗脱样合并透析 冻干，得酸性多糖CPS2 0 3.1.2 侧足多糖质量 多糖中两种组分的组成为:CPS1 91.4%; CPS2 80.6%。 3.1.3 多糖的紫外吸收试验 两个样品在260 nm和280 nm处无吸收，可以 推定两种样品基本不含核酸和蛋白。 3.1.4 多糖的HPLC分析 经HPLC分析，分离得到的两个组分都为单一 吸收峰，这 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明两个成分为均一成分。其相对分子 质量分别为:CPSI 2.56 x 104, CPS2 9. 91 x 104. 3.2 多糖的结构研究 在确定所分离得到的两个样品为纯品后，再对 其进行相应的单糖组成分析。 3.2.1 样品中主要单糖相对摩尔比 根据2.3.1节中所述方法，得到样品的单糖组 成如下: CPS1为n(葡萄糖):n(甘露糖)，n(半乳糖): n(阿拉伯糖)二46: 36: 18: 1; CPS2为n(葡萄糖): n(甘露糖):n(半乳糖):n(半乳糖酸):n(木糖): n(阿拉伯糖):n(鼠李糖)= 30: 25:14: 4: 3: 3: 1 o 3.2.2 红外光谱分析结果 CPSI和CPS2在35，一3 100 cm一’均有0-H伸缩 振动吸收峰，1663 cm一’和1 638 cm一’处有强吸收峰为 多糖分子中vC二0的伸缩振动吸收峰。840 cm一’的吸 收峰证明连接贰键为。一型;810 cm一‘,872 cm-’附近的 吸收峰可知两种多糖分子中均含有甘露聚糖。 3.3 单糖连接方式分析 多糖组成中的单糖构成是多糖性质的一个重 要指标，也影响其活性的重要原因。通过部分酸水 解结及甲基化图谱可以得到其结构的重要信息，为 它们的活性研究打下基础。 3.3.1 部分酸水解试验 对样品进行部分酸水解，其结果见表to 表 1 Table I CPSI,CPS2部分酸水解样品的单糖组成 The result of part acid hydrolysis to CPSI,CPS2 c(TFA)/(mol·L一，) 城甘露糖)/% x(鼠李糖)/% x(葡萄糖)/% x(半乳糖)/% x(阿拉伯糖)/% CPS2 0.05袋外) 0.20袋外) 0.50袋外) 0.50袋内) 0.05袋外) 0.20袋外) 0.50袋外) 0.50袋内) 86.41 51.43 26.12 3.50 45.以 10.14 31.17 62.41 0.00 25.91 4.19 0.00 34.67 0.19 1.93 11.56 0.00 4.25 1.26 0.50 9.85 0.13 0.94 1.28 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 注:CPS2主链及支链上均有葡萄糖醛酸及半乳糖醛酸，限于篇幅，不列人表格中。 万方数据 ·72 · 生肠加工过程 第6卷第1期 3:3.2 甲基化试验 样品CPSI,CPS2在酸水解试验后，又对样品分 别进行了甲基化试验，其结果分别见图2和图30 图2 CPS1甲基化GUMS图谱 Fig. 2 GC/MAS teat of CPSI 图2中糖昔键类型分别为:1,2号峰代表Hexp 1、的特征峰;3号峰代表-+2, -}6 Hexp的特征峰; 4号峰代表Penf 1、的特征峰;5,6号峰代表。6 Hexp 1。的特征峰;;7号峰代表*3,6 Hexp 1*的 特征峰;;8号峰代表-.3,--P4 Hexp的特征峰;;9号峰 代表--+4,6 Hexp 1*的特征峰。 图3中糖昔键类型分别为:1号峰代表Hexp 1 *的特征峰;;2号峰代表-.2,-.6 Hexp的特征峰;;3 号峰代表 Penf 1、 的特征峰;4,5,6峰代表。6 Hexp 1、的特征峰;;7号峰代表一3,6 Hexp 1、的 特征峰。Hexp表示毗喃型己糖，Penf表示吠喃型 戊糖。 3.4 多糖活性研究 CPSI和CPS2在12.5一200 pg/mL的浓度范 围内对2. 5 pg/mL的CDDP(顺铂)诱导的vero细 胞损伤有明显保护作用(P<0.01);随浓度增加其 作用愈趋明显，以50 wg/mL,100 pg/mL的作用较 好。结果见表ao 图3 CPS2甲基化GUMS图谱 Fig. 3 GUMAS test of CPS2 表2 虫草多精对肾细胞的保护活性 Table 2 The activity of protection of CPSI and CPS2 to the vero cell p(CDDP)/(N,g·ML一’)p(CPS1)/(畔 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12.5 25.0 50.0 100.0 200.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 ML一’) p(CPS2) / (wg 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12.5 25.0 50.0 100.0 200.0 ·ML一’) 口刀 CDDP组 CDDP组 CPS2组 0.00 1.25 2.50 5.00 10.00 20.00 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50 1.217土0.的3 0.737土0. 012## 0.476土0. 019## 0.341土0. 049## 0.301土0.仪为## 0. 205 t 0. 010## 0.423土0.027 0.533土0.034. 0.578土0.017二 0. 682 t 0. 014二 0.499土0.071 0. 483 t 0. 034 0.536 10.024. 0.577土0.011二 0.634土0.035二 0.602土0.074. 注#-P < 0. 05, ##-P < 0. 01，与对照组相比;'-P<0.05,心一P<0.01，与相同浓度的模型组相比 万方数据 2008年1月 范卫强等:虫草多糖的分离、纯化和初步药效活性研究 73 vero细胞培养48 h后形态规则，呈多角形铺路 石状，折光性强，轮廓不清。不同浓度的虫草多搪 作用48 h后，细胞形态变化不大。CDDP 1. 25 Wg/ ML作用48 h后细胞数量减少，部分细胞开始变圆。 CDDP 2. 5 wg/mL, 5. 0 Rg/mL组细胞数量明显减 少，多数细胞变圆，皱缩，少量漂浮。CDDP 10. 0 pg/mL,20.0 Rg/mL组细胞数量严重减少，残存少 量细胞，细胞变圆，漂浮，表明vero细胞的生长受到 了影响。经不同浓度的CPS1, CPS2处理后的vero 细胞再加人顺铂(质量浓度为2. 5 pg/mL )，则细胞 的数量明显增加，细胞形态明显改善。 有关，而与高级结构的关系可能更密切。笔者对冬 虫夏草多糖的结构研究仅限于一级结构的测定，认 为应加强空间构象的研究。多糖的高级结构、侧链 的连接位置、分支密度以及糖链间糖昔键的结合方 式均与药理活性有关，多糖的聚活度、相对分子质 量等也影响其活性。虫草多糖的构效关系研究还 不是很深人，有待进一步加强。 4 结 论 虫草多糖由中性和酸性两种多糖组成，两者均 为单一对称峰，相对分子质量分别为2.56 x 104和 9. 91 x 104，都是含葡萄糖、甘露糖、半乳糖的杂 多糖。 采用部分酸水解及GC-MS等手段对虫草多糖 中单糖的键型、连接方式及主链、支链的单糖各键 型的比例进行了研究。由研究结果推测，CPS1单糖 连接方式:①高度分支的葡甘露半乳聚糖;②主链 含甘露糖，成1--}6糖昔键，另有很少量葡萄糖分支 点在4,2,3位。③侧链:主要含葡萄糖，半乳糖，含 微量阿拉伯糖。CPS2单糖连接方式:①高度分支的 酸性葡甘露半乳聚糖;②主链含葡萄糖，甘露糖，半 乳糖，且成1-.6糖昔键:-.6位与葡萄糖1*位相 连，->6位甘露糖1-.位相连，--+6位与半乳糖1。位 相连，三者的摩尔比约为62.4:24.2:11.6③分支 点主要在3位。④侧链:阿拉伯糖，鼠李糖，半乳糖 醛酸，木糖;也可能有少量葡萄糖，半乳糖;有较多 的非还原末端糖基与葡萄糖的1。位相连。 同时，通过细胞培养的结果可看出CPS1和 CPS2对肾细胞都有一定的保护作用。 多糖的药理活性与多糖的一级结构、高级结构 参考文献: 【1〕 魏远安，方积年.高效凝胶渗透色谱法测定多搪纯度及相对分 子质量[1l·药学学报，1989,24(7) :532-536. 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