扬州大学《现代分子生物学》5-分子生物学研究方法

null第五章 分子生物学研究方法第五章 分子生物学研究方法5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术null5.1 重组DNA技术发展史40年代明确了遗传的物质基础是DNA 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题 。 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。 5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础null5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 1、DNA分子的切割与连接技术 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。 3、Southern杂交、DNA序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和聚合酶链反应 5.1 重组DNA技术发展史null重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 5.1.3重组DNA技术的概念5.1 重组DNA技术发展史null5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞 5.1 重组DNA技术发展史null2、重组DNA技术的基本步骤 ①目的基因的获得与载体的制备 ②目的基因与载体DNA的连接 ③重组DNA分子导入受体细胞 ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化 5.1 重组DNA技术发展史null重组DNA技术操作的主要步骤限制酶消化开环载体DNA目的基因5.1 重组DNA技术发展史null5.1.5重组DNA技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。 5.1 重组DNA技术发展史null5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶5.1 重组DNA技术发展史null限制性核酸内切酶+Bam HⅠ限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）5.1、 重组DNA技术发展史null第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin dⅢHaemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶5.1 重组DNA技术发展史nullⅡ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口 ：平端切口、粘端切口5.1 重组DNA技术发展史nullBam HⅠ+HindⅡ+平端切口粘端切口5.1 重组DNA技术发展史nullDNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。 T4¯DNA连接酶 EcoR I 连接酶 T7¯DNA连接酶5.1 重组DNA技术发展史目的基因的来源目的基因的来源原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA文库 人工合成及PCR扩增目的基因 天然DNA （染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA） 5.1 重组DNA技术发展史null（八）重组实验中的主要载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5.1 重组DNA技术发展史null克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1 重组DNA技术发展史null载体的选择 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。5.1 重组DNA技术发展史null噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 λ噬菌体黏粒、YAC、BAC ：高容量载体5.1 重组DNA技术发展史个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒：10kb λ噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb5.1 重组DNA技术发展史null 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程5.1 重组DNA技术发展史null5.2.1 细菌转化5.2 常见的DNA操作技术转化（transformation） ：P151感受态细胞（Competent cells） ： 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状转导？ 转染？ 常用的转化方法：常用的转化方法：化学转化（CaCl2）法 电击法5.2 常见的DNA操作技术null 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。5.2 常见的DNA操作技术null5.2 常见的DNA操作技术nullP1535.2 常见的DNA操作技术电击转化：电击转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液：生长对数期场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm 温度：0-4℃ 5.2 常见的DNA操作技术克隆的筛选：克隆的筛选：抗生素基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等 -互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养） 5.2 常见的DNA操作技术-互补筛选-互补筛选 β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞 IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑 5.2 常见的DNA操作技术蓝白斑筛选蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色） （蓝色） Lac Z（失活） , IPTG X-gal X-gal （白色） （白色） 5.2 常见的DNA操作技术蓝白斑蓝白斑5.2 常见的DNA操作技术转化率的计算：转化率的计算：转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积） 插入频率＝白色菌落数/蓝色菌落数+白色菌落数 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）5.2 常见的DNA操作技术5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术5.2.2 聚合酶链式反应（PCR）技术1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法 原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n 倍5.2 常见的DNA操作技术反应体系反应体系模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶 dNTP 含有Mg2+的缓冲液5.2 常见的DNA操作技术null　 PCR的基本反应步骤： 1. 变性：95℃ ，模板DNA变性为单链； 2. 退火：50℃左右，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：72℃ ，DNA聚合酶以dNTP为底物催化 DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环，经25-30次循 环后，可将模板DNA扩增达百万倍。5.2 常见的DNA操作技术PCR技术在基因克隆方面的应用 PCR技术在基因克隆方面的应用 （1）目的基因的直接克隆， （2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆； （3）制备DNA探针，进行分子检测等。 5.2 常见的DNA操作技术5.2.3 cDNA文库5.2.3 cDNA文库cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。5.2 常见的DNA操作技术构建步骤：构建步骤：1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素P156 2、反转录生成cDNA: 反转录酶，olig(dt) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装5.2 常见的DNA操作技术null5.2 常见的DNA操作技术null5.2 常见的DNA操作技术文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因DNA探针：带有特殊碱基序列的单链DNA或RNA分子,可以用放射性物质或免疫性物质标记,通过杂交,DNA探针常用于检测互补的碱基序列。 5.2 常见的DNA操作技术5.2.3 SNP技术应用5.2.3 SNP技术应用（single nucleotide polymorphism）单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性 一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换 应用：遗传病研究、动植物遗传育种 5.2 常见的DNA操作技术5.2.4 基因敲除技术（gene knock-out）5.2.4 基因敲除技术（gene knock-out）通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传二、常见的DNA操作技术null完全基因敲除 条件型基因敲除 植物基因敲除株系筛选（T-DNA插入失活）5.2 常见的DNA操作技术5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介5.3.1 RACE(rapid amplification of cDNA ends)一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3′或5 ′端之间未知序列的方法。 5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介mRNA的获取去磷酸化加寡聚接头（5′）反转录合成第一条cDNA 5 ´ RACE，扩增5未知序列3′RACE扩增3′未知序列5 ′已知的接头序列； 基因特异反向序列3 ′寡聚dT下游序列； 基因特异反向序列5.3.1 cDNA差示分析法(cDNA-RDA法)5.3.1 cDNA差示分析法(cDNA-RDA法)差减杂交与RT-PCR方法相结合，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介主要步骤是： mRNA逆转录为cDNA，用4 碱基识别酶消化，与接头1连接，PCR 扩增；去除接头1，扩增子接上接头2，与驱逐子杂交，PCR扩增；去除接头2，加上接头3，再与driver杂交，再扩增，筛选出目的片段、克隆、测序。 5.3 基因克隆技术简介5.3.3 酵母双杂交体系 （Yeast tow-hybrid system） 基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 反式转录激活因子 GAL4：DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD) 转录激活结构域（activation domain，DNA-AD） 被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使下游基因得到转录。5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介主要实验过程： a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株 b. 研究的猎物(或称靶蛋白)蛋白的基因与编码AD的序列结合 c.诱饵(bait)蛋白的基因与编码BD的序列结合,形成两段融合基因 d. 将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）的阳性菌落。 5.3 基因克隆技术简介酵母双杂交系统的应用：酵母双杂交系统的应用：发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 筛选药物的作用位点 建立基因组蛋白连锁图 5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介  1986年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但必须建立遗传分离群体 主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆5.3.4 基因的图位克隆法 （Map-based cloning）5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介1、将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记 2、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来 3、鉴定目的基因步骤: 5.3 基因克隆技术简介5.3 基因克隆技术简介染色体步移： 利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到需要要得克隆，获得目的基因。 5.3 基因克隆技术简介null5.4 基因表达研究技术5.4 基因表达研究技术5.4.1 基因表达系列分析技术 5.4.2 RNA选择性剪切机制 5.4.3 原位杂交技术 5.4.4 定点突变技术 5.4.5 RNAi技术P171-1805.5 蛋白质组学研究技术蛋白质组学：蛋白质和基因组研究相结合，研究某一物种、个体、器官、组织、或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。5.5 蛋白质组学研究技术null（一）、双向电泳技术 （二）、质谱技术 （三）、蛋白质免疫印迹实验 （四）、凝胶阻滞实验（EMSA） （五）、噬菌体展示技术 （六）、免疫共沉淀技术 （七）、蛋白质磷酸化分析P183—191