实验流程--ELISA

实验流程： 1. 将抗原按1.25μg/ml的浓度溶解于包被液中。 2. 在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4°C过夜。 3. 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 4. 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。 5. 倒空液体并拍干残留液体。用300μl洗涤液清洗两次。 6. 每个孔中加100μl一抗，37°C孵育1h或室温孵育3h。 7. 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 8. 每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h。 9. 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 10. 用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这次的洗涤步骤对于减少背景信号是很重要的。 11. 每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。 12. 每个孔中加100μl底物（pNPP），显色30min并立即在405-410nm读数。 溶液准备： 包被液： 50mM Na2CO3 （pH9.6）; 20mM Tris-HCl（pH8.5）或10mM PBS（pH7.2） 封闭液： 一般封闭用BSA，脱脂奶粉，酪蛋白，明胶等 洗涤液： 0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或Tris盐缓冲液（pH7.4） 间接ELISA —INDIRECT ELISA PROTOCOL 实验流程： 1. 用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收获细胞并计数。 2. 按1ml/107个细胞用预冷的RIPA缓冲液来裂解细胞，4°C摇1h。 3. 10000g，4°C离心20min，取上清液。 4. 用PBS清洗蛋白A/G琼脂糖颗粒两次，用RIPA缓冲液稀释琼脂糖颗粒至浓度为50%。 5. 按每50ml颗粒悬浮液需1ml细胞裂解液计算需要裂解液体积，取相应体积数的裂解液在4°C条件下摇10min。 10000g，4°C离心10min，将上清转移到新管中。 6. 按每5×106个细胞加0.5ml细胞裂解液，取相应的裂解液到新管中准备免疫共沉淀（IP）反应，每个反应中加入 1-4mg抗体，冰上摇3h。 7. 加50ml 50%颗粒悬浮液，4°C摇1h。 8. 10000g离心15s，弃上清。 9. 用1mlRIPA缓冲液洗涤颗粒两次，以除去无特异结合的蛋白，然后用1ml PBS洗涤3次。 10. 60μl样品缓冲液悬浮颗粒，95?煮沸5min；SDS-PAGE电泳前样品10000g短时离心15s。 溶液准备： RIPA缓冲液： 50mM Tris-HCl（pH7.4）, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1%Triton×100, 1%去氧胆酸钠, 0.1%SDS, 1mM PMSF, 1μ g/ml 牛胰蛋白酶抑制剂（aprotinin）, 1μg/ml亮抑蛋白酶肽（leupeptin） PBS（pH7.4）： 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 1×样品缓冲液： 65mM Tris-HCl（pH8.0）, 10%（v/v）甘油, 2.3%（w/v）SDS, 0.01%溴酚蓝, 1%DTT 免疫共沉淀 —IMMUNOPRECIPITATION PROTOCOL 实验流程： 1. 用盖玻片将12孔板盖上，细胞培养至50%浓度。 2. 将培养液倒掉并用PBS清洗两次。 3. 在室温下，将细胞用溶解于0.1% Triton×100-PBS中的4%福尔马林固定20min。 4. 用2ml 1%BSA-4%羊血清-PBS封闭1h （注意：任何抗体或抗血清，使用前应10000g离心5min，以除去小颗粒）。 5. 用2ml PBS洗涤两次，每次5min。 6. 室温下，在40ml 1%BSA-PBS中，加入一抗反应45min。 7. 用0.2%BSA -PBS洗涤两次，每次5min。 8. 室温下，在40ml 1%BSA-PBS中加入偶联好的二抗反应30min。 9. 用2ml PBS洗涤五次，每次5min。 10. 用防褪色试剂制作标本。 溶液准备： PBS（pH7.4）： 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 固定准备： 溶解在PBS中4%的福尔马林： 每25ml中加入1-2滴10M NaOH对福尔马林进行解聚，然后加热到65?就可以得到清晰的溶液，再把它放到冰上测pH值 免疫荧光显微法 —IMMUNOFLUORESCENCE MICROSCOPY PROTOCOL 实验流程： 1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。 2. 用100μl 裂解缓冲液冰浴溶解沉淀10min（每500000个细胞20μl裂解缓冲液）。 3. 10000rpm，4°C离心10min，取上清转移至新管。 4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。 5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80°C储存。 6. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。 7. 短时离心后点样电泳检测。 溶液准备： 裂解缓冲液： 0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 异丙醇和 5mM ε-氨基己酸 2×样品缓冲液： 130mM Tris-HCl（pH8.0）, 20%（v/v）甘油, 4.6%（w/v）SDS, 0.02%溴酚蓝, 2%DTT PBS（pH7.4）： 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 制备细胞裂解液 —CELL LYSATE PREPARATION PROTOCOL 实验流程（在制备过程中一直将组织放在冰上）： 1. 切开组织，称取组织1.5g于已预冷的PBS中清洗。 2. 在RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足5ml RIPA缓冲液，研磨20min。 3. 将研磨液转移到1.5ml的离心管中，14000rpm，4°C离心10min。 4. 取上清液作为完整的组织裂解液。 5. 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。 6. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80°C储存。 7. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。 8. 短时离心后点样电泳检测。 溶液准备 RIPA缓冲液： 50mM Tris-HCl（pH7.4）, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1%Triton×100, 1%去氧胆酸钠, 0.1%SDS, 1mM PMSF, 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂（aprotinin）, 1μg/ml亮抑蛋白酶肽（leupeptin） 裂解缓冲液： 0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 异丙醇和 5mM ε-氨基己酸 PBS（pH7.4）： 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 2×样品缓冲液： 130mM Tris-HCl（pH8.0）, 20%（v/v）甘油, 4.6%（w/v）SDS, 0.02%溴酚蓝, 2%DTT 制备组织裂解液 —TISSUE LYSATE PREPARATION PROTOCOL 免疫组织化学 —IMMUNOHISTOCHEMISTRY PROTOCOL 实验流程（HRP-DAB系统）： 1. 对石蜡切片进行脱蜡和水化：3×10min 二甲苯，5min 100%乙醇，5min 95%乙醇，5min 80%乙醇，5min 70% 乙醇，3×5min PBS。 2. 修复抗原，PBS洗涤三次，每次5min。 3. 室温下，将玻片在3%H2O2-甲醇溶液中浸泡15min封闭内源性过氧化物酶，然后用PBS洗涤三次，每次5min。 4. 加入一抗（用3％BSA-PBS封闭液1：50稀释一抗）， 37°C湿盒孵育1h。 5. 加入Post-blocking 室温湿盒孵育30min，然后用PBS洗涤三次，每次5min。 6. 加入稀释好的辣根过氧化物酶（HRP）标二抗，室温下湿盒孵育30min。 7. 用PBS洗涤玻片5次，每次5min。 8. 按照DAB试剂盒说明添加显色液，避光显色30s-5min。用蒸馏水终止显色反应。 9. 苏木精进行复染色3min，用蒸馏水冲洗。 10. 立即进行脱水和透明：5min 70%乙醇，5min 80%乙醇，5min 90%乙醇，5min100%乙醇，2×10min二甲苯。 11. 中性树胶封片。 溶液准备： PBS（pH7.4）： 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 封闭缓冲液： 3%BSA-PBS 抗原修复 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ： 1) 柠檬酸钠法： a) 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml的10mM柠檬酸钠（pH6.0）的容器中。 b) 微波中高火6-8min。 c) 室温冷却。 d) 用PBS洗涤3次，每次5min。 免疫组织化学 —IMMUNOHISTOCHEMISTRY PROTOCOL 2) 蛋白酶K法： a) 配制新鲜溶液： 25μl 20mg/ml蛋白酶K 2.5ml 1MTris-HCl（pH8.0） 0.5ml 0.5M EDTA（pH8.0） 加水定容到50ml b) 37°C下，将玻片放在架子上孵育5min（蛋白酶K不需要预热）。 c) 用PBS洗涤3次，每次5min。 3) 尿素法： a) 把玻片放在玻璃固定架上，再将架子放在盛有600ml 的1M尿素（新鲜配制）的容器中。 b) 微波10min，20min或者30min，每5min补充一次蒸发掉的水。 c) 冷却30min到1h。 d) 用蒸馏水洗涤4次，每次3min，再用PBS洗涤3min。