真菌DNA提取方法的建立和比较

真菌DNA提取方法的建立和比较**☆○ 真菌DNA提取方法的建立和比较**☆○ 杨艳秋1，王 丽2，贺 丹2，孙文通2，张 宇2，横山耕治○3   1吉林大学第一医院, 吉林省长春市　130021；2吉林大学基础医学院病原生物学教研室, 吉林省长春市 130021；3日本国立千叶大学真菌医学研究中心, 日本千叶 260-8673 杨艳秋☆，女，1961年生，吉林省长春市人，汉族，2007年吉林大学基础医学院病毕业，博士，副教授，主要从事真菌学研究。 8634469@sohu.com 通讯作者：王 丽，教授，吉林大学基础医学院病原生物学教研室，吉林省长春市 130021 wli99@jlu.edu.cn 国家自然科学基金资助项目（30571773）*；吉林省科技发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 重点资助项目（20050205-3）* 中图分类号:R519 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2007)50-10093-04 收稿日期：2007-09-06 修回日期：2007-10-06 (07-50-9-4864/GW·Q)           Comparison of three methods of genomic DNA extraction from fungus Ａｂｓｔｒａｃｔ ＡＩＭ:The DNA extraction rate, especially the DNA purity, has a strong influence on the experiment results. There is a big difference of purity and extraction rate in extracting DNA either towards the same sample with the different method or towards the different samples with the same method. In this study, in order to find the best DNA extraction method, we used filamentous fungi as the sample and optimized the method. ＭＥＴＨＯＤＳ:This study was carried out at Mycology Lab of Basic Medical College of Jilin University from June 2004 to December 2006. Using clinical common pathomycete as the samples, we took three methods, including glass-bead salt fractionation, CTAB and Gene TLETM, to extract DNA and compared the extraction rate via agarose gel electrophoresis method. ＲＥＳＵＬＴＳ:Under the same condition, the ratio between A260 and A280 of Gene TLETM was the highest, which presented the protein content was relatively low. Comparing the DNA agarose gel electrophoretogram made by the three methods, all the DNA can amplify the aim fragment in multi-PCR and the DNA extracted by Gene TLETM showed the best result. ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ:Gene TLETM is suit to extract DNA and has the advantages of high extraction rate, good quality and simple operation. Yang YQ, Wang L, He D, Sun WT, Zhang Y, Hengshan GZ.Comparison of three methods of genomic DNA extraction from fungus.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(50):10093-10096(China) [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-50/50k-10093(ps).pdf] 摘要 目的：DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度严重影响实验结果，同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA，其纯度和提取率有很大差异。以丝状真菌为材料， 进行DNA提取，对真菌DNA的提取方法进行优化，探讨其最佳DNA提取方法。 方法：实验于2004－06/2006－12在吉林大学基础医学院真菌实验室进行。以临床常见致病真菌标本为材料，采用玻璃珠－盐析法、CTAB 法、Gene TLETM法3种不同方法提取DNA，通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取DNA的效率。 结果：同等菌体量下,A260 和A280 的比值采用Gene TLETM法获得的样品最高, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明其蛋白质含量相对最少。3种提取的基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图都在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段，Gene TLETM DNA抽提法带型最清楚、明亮。 结论：Gene TLETM法提取DNA效率高、质量好，操作简单，适于DNA的提取。 关键词：丝状真菌；基因组DNA 提取；Gene TLETM法 杨艳秋，王丽，贺丹，孙文通，张宇，横山耕治.真菌DNA提取方法的建立和比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(50):10093-10096 [www.zglckf.com/zglckf/ejournal/upfiles/07-50/50k-10093(ps).pdf] 0 引言 真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位[1，2]。DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度严重影响实验结果。同一标本采用不同方法或不同标本采用相同方法提取DNA其纯度和提取率有很大差异[3，4]。作者参照国外方法加以改进[5，6]，从目前真菌DNA提取方法中筛选出3种方法，以丝状真菌为材料， 进行DNA提取，对真菌DNA的提取方法进行优化，探讨其最佳DNA提取方法。 1 材料和方法 设计：方法－对照分析。 单位：吉林大学基础医学院。 材料：实验于2004－06/2006－12在吉林大学基础医学院真菌实验室进行。主要仪器和试剂：Beckman DU 600紫外分光光度计（Beckman COULTER Lnc,USA）， YJ-876型净化工作台（苏州集团苏州安泰空气技术有限公司），HEAL FORCE生物安全柜HF SAFE-1200（ 香港力新），MJX-250A-ⅡB型微电脑控制霉菌培养箱（广州省医疗器械厂），高速台式冷冻离心机Heraeus（贺利氏香港力康），DYY-ⅡB型三恒电泳仪（北京市六一仪器厂），Tanon GIS-2008数码凝胶图像系统(天能科技（上海）有限公司), PCR扩增使用美国ASTEC基因扩增仪PC-320。YEPD液体培养基（1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖）,dNTP、Taq酶和DNA marker 购自宝生物（大连）工程有限公司。菌株：烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、燕麦镰刀菌保存于SDA斜面培养基上，定期传种。 设计、实施、评估者：实验设计、实施者为第一、三作者，评估为第二作者，均经正规培训，未采用盲法评估。 方法： 将供试菌株采用YEPD液体培养基，取两菌环新鲜菌落溶于YEPD液体培养基中， 37 ℃摇动培养24 h。 基因组DNA提取： 玻璃珠－盐析法[7]：DNA提取液：2% Triton X-100，1%SDS，100 mmol/L Nacl，10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA。①加入 300 μL提取液悬浮菌体，再加入300 mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，酵母菌为5 min，丝状真菌为30 min。②20 μL预冷饱和NaCl（约为6 mol/L），用力振荡15 s，再以 2 500 r/min离心15 min。③取上清液移到另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒后，离心10 min。④弃上清后干燥，最后加入100 μL，10 mmol/L Tris（pH 8.0）， 1 mmol/L EDTA和1 μL RNase（SABC）， 37 ℃孵育1 h，－20 ℃保存。 CTAB法：CTAB提取液：2%CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）2 g，20 mmol/L EDTA 0.745 g，100 mmol/L Tris-HCl 1.21 g， 1.4 mol/L NaCl 8.18 g，加水至100 mL，高压灭菌备用。CTAB沉淀液：CTAB 5 g/L， 0.04 mol/L NaCl，加水至100 mL，高压灭菌备用。DNA抽提：①取100~200 mg充分磨碎样品于1.5或2.0离心管中。②加600 μL CTAB提取液混匀，于60~65 ℃水浴中温育1.0~2.0 h。③加入等体积（600 μL）的Tris的饱和酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）振荡器离心管混匀，12 000 r/min离心10 min。④取上清（水相）于一新离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）振荡器混匀，12 000 r/min离心 10 min。⑤取上层水相，加入2倍体积的CTAB沉淀液，混匀，室温孵育20~30 min。⑥室温下12 000 r/min离心，15 min弃上清液，加350 μL NaCl溶液（1.2 mol/L DNA溶解液）溶解沉淀，然后加入350 μL氯仿，混匀 30 s。⑦12 000 r/min离心10 min，分层，将上清液移至一新的离心管中，加入0.6~0.8体积的异戊醇，混匀，室温静置30 min。⑧4 ℃， 12 000 r/min离心20 min（完全除去上清液）；向沉淀加入500 μL，体积分数为0.7的乙醇，混匀。⑨4 ℃，12 000 r/min离心，5 min，小心仔细倒入上清液，弃之。⑩重复步骤⑨。室温干燥后，将DNA溶于50~100 μL去离子无菌水中，于4 ℃保存备用。 Gene TLETM DNA快速抽提方法[5]：第一步，加入solution Ⅰ，促使真菌细胞壁破裂，释放出DNA；第二步，加入solution Ⅱ，去除蛋白质；第三步，加入solution Ⅲ，溶解DNA。最后，加入盐和乙醇浓缩沉淀DNA。再用少量的稀释液重新溶解，提高DNA浓度。 DNA抽提：①Solution Ⅰ 540 μL振荡20 s混匀，室温下10 min。②Solution Ⅱ60 μL颠倒摇匀，70 ℃温浴10min。③Solution Ⅲ 300 μL颠倒摇匀冰上2 min。④12 000 r/min，4 ℃，5 min离心，上清移至新管。⑤异丙醇 （4 ℃）600 μL，12 000 r/min，4 ℃，5 min离心，弃上清。⑥沉淀DNA用体积分数为0.7的乙醇（4 ℃）500 μL清洗，12 000 r/min，4 ℃， 5 min，弃上清后，离心浓缩仪干燥。⑦用50~100 μL超纯水溶解。置－20 ℃保存备用。 PCR检测:PCR扩增在美国ASTEC PC-320型PCR仪上进行，扩增条件为 94 ℃预变性5 min后，进行35个循环的94 ℃变性1 min，59 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 琼脂糖凝胶的配制：①在1TAE Buffer 50 mL中加入1.5 g琼脂糖，微波炉中熔化、混匀，冷却至55 ℃，加入5 μL EB（溴化乙锭），倒入已封好的，插上样品梳的凝胶灌制平台上。②待凝胶凝固后，拔掉梳子，放入有足够电泳液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1 mm。 电泳缓冲液的配制：取 50TAE Buffer 10 mL加入双蒸去离子水稀释至490 mL，充分振荡混匀。 PCR产物的电泳及结果观察：①微量加样器吸取10 μL PCR扩增产物与6loading buffer 2 μL充分混合，加入已预电泳的加样孔中，另加1 μL DNA marker作为片段长度 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 对照。②电压80 V，使DNA向阳极移动，电泳约30 min。③将已电泳的凝胶置于凝胶成像仪透射仪上，在紫外灯下观察结果。根据示踪染料溴酚蓝的位置判断产物泳动位置。PCR产物检测用EB预染的1.5%琼脂糖凝胶电泳分析（Tanon Gis2008）凝胶成像分析系统拍照。 主要观察指标：①采用吸收光谱法观察不同方法提取的真菌DNA浓度的变化。②基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳可以直观地反映DNA 的质量。 2 结果 2.1 3种提取基因组DNA 吸光度比较 通过测量三种提取的DNA 样品的吸光度值A260 和A280，分别计算A260 /A280 比值和基因组DNA 浓度。结果见表1。   可以看出在同等菌体量下,A260 和A280 的比值即Radio 值采用Gene TLETM法获得的样品最高，表明其蛋白质含量相对最少。 2.2 3种提取的基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图比较 3种提取的基因组DNA 样品经1.5 %琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。①玻璃珠－盐析法：2种真菌虽然全部在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段，但与CTAB法、Gene TLETM 酵母菌DNA抽提法相比产物条带亮度弱。②CTAB法：2种真菌也在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段，但条带的亮度比Gene TLETM DNA抽提法有所减弱。③Gene TLETM DNA抽提法：全部在相应的多重PCR体系中扩增出目的片段，且带型清楚、明亮。       3 讨论 PCR技术检测真菌的敏感性与引物设计、操作方法等密切相关。用于PCR分析的标本处理方法必须满足一系列条件：使采集的标本裂解以释放DNA；扩增的靶序列必须完整；核酸酶必须灭活；最大限度地减少抑制物；操作简单，以减少污染机会，并易于为临床实验室所接受。获得一定浓度和纯度的DNA 是进行分子生物学研究的基础[8]。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA 的前提，而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA 产物的关键[9]。因为真菌的细胞壁结构特殊，细胞壁坚实，需要经过反复的破壁和DNA抽提过程才能获得提纯的DNA[4]。真菌提取方法是快速鉴定和分型的关键步骤[10－13]。传统的DNA提取方法较为繁琐。包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠法，应用这些方法提取的DNA获得率低，完整性较差，而且易造成交叉污染。为了保证PCR的敏感性和特异性，要求所提取的DNA纯度较高，不含抑制PCR反应的成分，同时也应快速和易于操作以满足临床的需要。玻璃珠－盐析法是一种以直径0.45～0.50 mm玻璃珠振荡机械性地破坏真菌细胞壁的DNA提取方法，盐析法是一种较新的通过饱和氯化钠纯化DNA的有效技术,在实际工作中将两者相结合建立玻璃珠－盐析法(GS)。近年来国内外应用CTAB法提取真菌DNA取得了较好的结果[14－17]，CTAB是一种去污剂，能使真菌细胞壁裂解，并与核酸形成复合物，这种复合物在高盐溶液中可以溶解并稳定存在，而在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀下来；但这些方法操作过程繁琐，且费用较高，不易在临床上推广应用。 本实验探讨和比较了3种（玻璃珠－盐析法、CTAB法、Gene TLETM酵母菌DNA抽提法）方法，前两种方法不仅需要较高的技术要求，较大的实验成本，其处理过程繁琐，用时较长，加之反复离心容易损失游离的DNA，不易临床推广使用。因此，以临床常见的致病真菌作为突破口，对其破壁－破膜－释放DNA系列程序的条件及相应的PCR扩增体系作了反复研究，结合临床标本处理时的要求：充分裂解菌体；减少处理过程中游离DNA丢失；尽量简化处理程序，以利于临床上推广。 吸收光谱法主要是基于核酸、蛋白质和盐类小分子对紫外线吸收不同的特性，三者分别在260、280和230 nm 处有最大吸收峰。因此, 溶液中DNA 的含量可以通过260 nm 处的光吸收值(A260) 计算，而DNA 溶液中蛋白质和盐类小分子的混杂程度可以通过比较其在260 nm 处的光吸收值(A260)与其在280 nm 处的光吸收值(A280) 来判断。理论上，基因组DNA 的A260/A280 的比值应该位于1.8～2.0 之间[18]。通过表1 可以看出在同等菌体量下，A260 和A280 的比值即Radio 值采用Gene TLETM法获得的样品最高,表明其蛋白质含量相对最少。图1 是上述三种提取方法获得的DNA 的琼脂糖凝胶电泳图，可以看出虽然全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段，Gene TLETM法提取的DNA 完整且纯度高。 目前真菌污染是临床应用PCR存在的主要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ， 污染主要源于DNA提取过程中的气生孢子和试管中可能污染的真菌孢子。为避免这一现象的出现，应该最大限度地降低重复使用试管，用Gene TLETM法提取DNA过程中，避免了玻璃器皿的使用，而所使用的EP管，Tip头等均为一次性的，这样大大降低了污染的几率。CTAB法和玻璃珠－盐析法提取的真菌细胞DNA产量也能满足PCR反应的要求，但这两种方法均为机械破壁法，极易造成DNA的断裂，而且重复使用试管及玻璃仪器，很易造成交叉污染。 本实验中最终确定一种简便、快速的方法（Gene TLETM DNA抽提法）。该法与传统的方法相比，其真菌细胞壁裂解效果好，提取DNA完整性亦好，纯度高，操作步骤简单，缩短了检验时间，整个过程仅需要约1 h，适合于真菌DNA的提取。整个提取过程无须昂贵的仪器及试剂，可向临床检验室推广应用。 4 参考文献 Suzuki S, Taketani H, Kusumoto K, et al. 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The identification and phylogenetic relationship of pathogenic species of Aspergillus based on the mitochondrial cytochrome b gene.Med Mycol 1998；36（3）:153-164 秦振宇，吴绍熙，Roy L. Hopfer，等.玻璃珠-盐析法提取常见致病真菌DAN的研究[J].中华皮肤科杂志，2000，33（5）：330-332 张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物,2004，25(2):40-46 曾乐平，周洪波，黄菊芳.一种经济、简单的微生物基因组DNA 的提取方法[J].生态环境，2005,14(6):945-946 张明，赵呈裕.丝状真菌高分子量DNA的提取研究[J].广西医科大学学报,1998,15(2):41-43 刘秋云,罗樨,赫然,等.一种粗糙脉孢霉基因组DNA 的快速制备方法[J].生物技术,2001,11(2):38-39 吴志红,汪天虹,黄卫,等.简便易行的丝状真菌染色体DNA 提取法[J].菌物系统,2001,20(4):575-577 吴琦,王红宁，刘世贵.三种黑曲霉细胞基因组DNA 提取方法的比较[J]. 生物技术，2003，13（6）：30-31 江洁，杜连祥，路福平，等.基因工程菌里氏木霉染色体DNA 的提取方法[J]. 生物技术，2004，14（2）：24-26 赵运胜,卜友泉,张宏娟，等.苛求芽孢杆菌基因组DNA 提取方法的比较[J]. 生物技术，2006，16（2）：41-42 江树勋，邵碧英，陈文炳，等.15 种常见食(药)用菌的3 种总DNA提取方法比较研究[J].食品科学，2004，25（5）：36-40 代翠红，李杰，朱延明，等.不同DNA提取方法对4种重要作物DNA提取效率的比较[J].东北农业大学学报，2005，36（3）：329-332 F奥斯伯,R布伦特,R E金斯顿,等.精编分子生物学实验指南[M].颜子颖, 王海林, 译.北京: 科学出版社,1999:831-833