_1HNMR法定量测定奥沙西泮杂质_对照品的含量_周晓力

JournalofPharmaceuticalAnalysis药物分析杂志药物分析杂志·1696·药物分析杂志ChinJPharmAnal2016,36(9)Chinese　　*　通信作者　Tel：（010）67095455；E-mail：nannan@nifdc.org.cn第一作者　Tel：（010）67095458；E-mail：zxl0324@hotmail.com1HNMR法定量测定奥沙西泮杂质Ⅰ对照品的含量周晓力，马迅，陈华，南楠*（中国食品药品检定研究院，北京100050）摘要　目的：建立采用1HNMR法测定奥沙西泮杂质Ⅰ的绝对含量。方法：以对苯二甲酸二甲酯基准试剂为内标，以氘代氯仿为溶剂，采用BrukerAvanceⅢ500型核磁共振谱仪，noesyigld1d脉冲序列在恒温25℃下获取1HNMR谱，测定奥沙西泮杂质Ⅰ的含量，驰豫延迟时间为25s。结果：以奥沙西泮杂质Ⅰ的峰（δ5.97）及对苯二甲酸二甲酯（δ8.10）峰作为定量峰，将样品与内标的NMR峰面积比对其质量比绘制 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，奥沙西泮杂质Ⅰ的线性范围为8~24mg，相关系数为0.9999，精密度RSD为0.08%（n=5），重复性RSD为0.43%（n=6），定量限为0.338mg；核磁共振法测得奥沙西泮杂质Ⅰ的含量为99.8%，与质量平衡法测得结果99.6%基本一致。结论：采用核磁共振定量的方法可测定奥沙西泮杂质Ⅰ的绝对含量，此方法准确快捷，简单易行，是对标准物质绝对含量测定的一种良好的补充方法。关键词：去甲羟基安定；奥沙西泮杂质Ⅰ；杂质对照品；绝对含量测定；对苯二甲酸二甲酯；1H核磁共振定量（1HQNMR）；方法验证中图分类号：R917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）09-1696-04doi：10.16155/j.0254-1793.2016.09.28DeterminationofimpurityⅠreferencesubstanceofoxazepamby1HNMRZHOUXiao-li，MAXun，CHENHua，NANNan*（NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China）Abstract　Objective：Todevelopaproton-nuclearmagneticresonance（1HNMR）approachforthedeterminationofimpurityⅠofoxazepam．Methods：1HNMRspectrawereobtainedinchloroform-dbyusinganAvanceⅢ500spectrometerwithnoesyigld1dpulsesequenceat25℃，theinternalstandardwasdimethylterephthalate（DMT），andtherelaxationdelaytimewas25s．Results：Thepeakatδ5．97ofimpurityⅠofoxazepamandδ8.10ofDMTwereusedforquantitation．Thelinearrelationshipbetweenpeakarearatioandweightratioofsample（δ5．97）toinnerstandardDMT（δ8.10）wasobtainedrangedfrom8mgto24mg，withcorrelativecoefficientof0.9999．TheprecisionRSDwas0.08%（n=5），andtherepeatabilityRSDwas0.43%（n=6）．TheLOQwas0.338mg．Theresultdeterminedbythemethod（99.8%）wasconsistentwiththeresultbymassbalancemethod（99.6%）．Conclusion：Theestablishedquantitativenuclearmagneticresonance（QNMR）methodcanbeusedforthequantitativedeterminationofimpurityⅠofoxazepam，whichiseffectiveandreliableasagoodcomplementarityforthedeterminationofthereferencestandards．JournalofPharmaceuticalAnalysis药物分析杂志药物分析杂志·1697·药物分析杂志ChinJPharmAnal2016,36(9)Chinese自1963年NMR技术开始用于定量分析［1-2］以来，核磁共振定量技术（QNMR技术）在药品含量测定领域的应用越来越广泛，多国药典均收录QNMR技术。1HNMR用于定量分析的基础是化学环境不同的氢原子核的共振峰面积只与所含的氢原子数目有关，由于其广泛的适用性，已有大量的研究报道［3-6］。QNMR技术的最大优点是它只需用已知纯度的化合物作为参比物，而无需特定的对照品，只要被测物和参比物中至少分别有1个或1组特征的且互不重叠的共振峰存在，则无需引入任何校正因子，可直接根据共振峰的面积求出所代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 的氢原子的数目［6］。奥沙西泮（oxazepam），又名去甲羟基安定，主要用于缓解焦虑、紧张、激动等症状，也可作为催眠、抗精神抑郁的辅助用药，具有显著的抗焦虑作用，并有较好的松驰肌肉和抗抽搐作用［7］。USP38收载了奥沙西伴原料、胶囊剂及其片剂［8］，EP8.0中收载了奥沙西伴原料药［9］，BP2015收载该品种的原料及其片剂［10］，中国药典2010年版收载该品种的原料及其片剂［11］。2015年版中国药典相对于2010年版，在奥沙西泮标准有关物质项下新增了2种已知杂质的检查，分别为（3RS）-7-氯-2-氧代-5-苯基-2，3-双氢-1H-1，4-苯并二氮杂-3-乙酸酯（杂质Ⅰ）和6-氯-4-苯基喹唑啉-2-甲醛（杂质Ⅱ）［12］1406。本文针对奥沙西泮杂质Ⅰ建立了1HQNMR法并进行了方法学考察，用于在对照品标定过程中辅助定值。Keywords：oxazepam；impurityⅠofoxazepam；impuritystandardsubstance；absolutecontentassay；dimethylterephthalate（DMT）；1Hquantitativenuclearmagneticresonance（1HQNMR）；methodsvalidation图1　奥沙西泮及其杂质的化学结构Fig.1　Thechemicalstructuresofoxazepamandimpurities1　仪器与试剂BrukerAVANCEⅢ500核磁共振仪（Bruker公司，瑞士）；电子天平（METTLERTOLEDOAX-260R）。氘代氯仿（纯度99.9%，含0.03%四甲基硅烷，CambridgeIsotopeLaboratories，Inc.）；对苯二甲酸二甲酯（纯度100.0%，TCI）；奥沙西泮杂质Ⅰ（北京益民药业有限公司）。2　方法与结果2.1　供试溶液的制备　精密称取奥沙西泮杂质Ⅰ约15mg及内标物对苯二甲酸二甲酯约3mg，置离心管中，加入氘代氯仿0.75mL，超声5min溶解，震荡摇匀后，转入核磁管静置待测。2.2　检测条件　采用noesyigld1d脉冲序列在恒温（25℃）下获取1HNMR谱。谱宽（SWH）δ20，射频中心（O1P）δ7.0，采样点数（TD）64k，采样时间（AQ）3.28s，驰豫延迟时间（D1）25s，采样次数（NS）16次，空扫次数（DS）4次，增益（RG）57。2.3　测定结果采集图谱　采集到的数据用MestReNova6.1.1软件处理，测定样品和内标对苯二甲酸二甲酯选定峰峰面积的相对比值，按内标法［12］52计算含量。样品及内标的氢谱见图2，样品的氢谱解析见表1。1、3.内标的氢信号（peakofaromatichydrogenofinternalstandard）　2.样品的定量氢信号（peakofsample）图2　奥沙西泮杂质Ⅰ及内标的氢谱图Fig.2　1HNMRspectrumofimpurityⅠofoxazepamandinternalstandardJournalofPharmaceuticalAnalysis药物分析杂志药物分析杂志·1698·药物分析杂志ChinJPharmAnal2016,36(9)Chinese表1　奥沙西泮杂质Ⅰ的氢谱解析Tab.1　1HNMRanalysisofimpurityⅠofoxazepamδH个数（number）峰型（peaktype）J/Hz归属（assignment）*9.491s/17.62~7.542m/13，177.54~7.462m/7，157.422t7.514，167.37~7.301m/67.201d8.785.971s/32.343s/20　注（note）：*编号同图1中杂质Ⅰ结构式上的编号（ThenumbersameasthatinimpurityⅠstructureofFig.1）2.4　精密度试验　将同一供试溶液连续测定5次，以δ5.97的单氢信号峰与内标对苯二甲酸二甲酯的定量峰δ8.10面积的比值计算RSD为0.08%。显示该方法具有量好的精密度。2.5　重复性试验　平行制备供试溶液6份，按“2.2”项下条件进行测定，按“2.9”项下 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算奥沙西泮杂质Ⅰ的含量平均值为99.8%，RSD为0.43%，显示该方法具有良好的重复性。2.6　稳定性试验　设定内标δ8.10峰的峰面积为1.000时，在制备供试溶液后第0、1、2、3、4、6h得到样品δ5.97峰的相对面积RSD为0.09%，说明供试溶液在6h内具有良好的稳定性。2.7　线性范围试验　精密称定奥沙西泮杂质Ⅰ7.890、10.960、12.294、15.736、18.652、21.980、24.214mg，分别放于不同的离心管中，分别加入精密称定的对苯二甲酸二甲酯约3.0mg作为内标，加氘代氯仿0.75mL，超声5min，振荡摇匀后，再将上述溶液转移至核磁管中进行分析。经过匀场、相位校正和基线校准后，积分得到奥沙西泮杂质Ⅰ（δ5.97）峰面积与内标（δ8.10）峰面积的比值，以该比值为纵坐标，奥沙西泮杂质Ⅰ与内标的质量比值为横坐标进行线性回归，得到线性方程：Y=0.14813X-1.9534×10-3　r=0.9999结果表明，NMR法用于奥沙西泮杂质Ⅰ的定量测定，质量8~24mg范围内线性关系良好。2.8　定量限　据文献［6］报道，1HNMR用于精确定量时，信噪比（S/N）需满足250，“2.7”项下最小称样量为7.890mg的样品的信噪比为5843，满足精确测定的要求，按文献［6］所列公式计算定量限为0.338mg。2.9　定量结果　平行配制6份供试溶液，按照选定的NMR条件测定峰面积，以内标法进行测定。奥沙西泮杂质Ⅰ的含量按下式计算：（As/ns）×Ms×mr（Ar/nr）×Mr×msWs=×Wr其中：As为被测样品定量峰的积分面积，ns为被测样品定量峰包含的质子数，Ms为被测样品的相对分子质量，Ar为内标物质定量峰的积分面积，nr为内标物质定量峰包含的质子数，Mr为内标物质的相对分子质量，mr为称取的内标质量，Wr为内标的质量百分含量，ms为样品质量。测定结果见表2，含量平均值为99.8%。表2　含量测定结果Tab.2　DeterminationresultsbyQNMRmethod样品号（sampleNo.）ms/mgmr/mgAsAR含量（content）/%115.5944.5380.5040675199.34214.4683.5920.5914008199.43312.2943.0480.59808661100.42416.0682.7740.8523605199.65514.8762.8420.77488581100.25615.7362.8780.8057714199.803　讨论3.1　内标及溶剂的选择　内标物应具有较高的纯度，较少的质子数，主要吸收峰与样品峰之间无干扰，且不与样品发生反应。从奥沙西泮杂质Ⅰ和对苯二甲酸二甲酯的核磁共振氢谱图（图2）中可以看出，对苯二甲酸二甲酯苯环上的氢（δ8.10）和奥沙西泮杂质Ⅰ3位上（δ5.97）的氢不重叠，且内标物的峰稳定，不与样品反应，满足定量要求。因此，本实验选择对苯二甲酸二甲酯作内标。样品奥沙西泮杂质Ⅰ与内标对苯二甲酸二甲酯均易溶于氘代氯仿，溶剂峰不干扰测定，故采用氘代氯仿为溶剂。3.2　内标物与被测物定量峰的选择　采用NMR技术对物质进行定量时，待测物和内标物通常会有多个峰。用于定量的内标峰和待测峰应选择与其他峰完全分离，附近基线平坦的峰。因此本文选取了对苯二甲酸二甲酯苯环上的峰δ8.10作为内标定量峰，以奥JournalofPharmaceuticalAnalysis药物分析杂志药物分析杂志·1699·药物分析杂志ChinJPharmAnal2016,36(9)Chinese沙西泮杂质Ⅰ中的峰δ5.97为被测组分的定量峰。3.3　仪器参数的选择　通过翻转恢复试验对所有的质子共振谱线的弛豫时间（T1）值分别进行测试，结果显示内标峰δ8.10的弛豫时间为3.804s，样品定量峰δ5.97的弛豫时间为4.745s。据文献［13］报道，在进行定量核磁共振试验时，为了保证积分结果的准确性，驰豫延迟时间不应小于T1的5倍，因此驰豫延迟时间选定为25s，最终结果表明，该选择可以满足测量精度的要求。3.4　与质量平衡法结果的比较　利用质量平衡法［14］计算奥沙西泮杂质Ⅰ的含量，公式为含量=（100%-干燥失重-炽灼残渣）×HPLC纯度。奥沙西泮杂质Ⅰ样品的干燥失重结果为0.11%，炽灼残渣结果为0.0%，高效液相色谱纯度为99.69%，即按质量平衡法计算奥沙西泮杂质Ⅰ的含量为99.6%。采用QNMR结果为99.8%，可见2种定量方法结果基本一致，可相互佐证。3.5　结论　在标准物质的标化过程中，含量确定是非常关键的步骤。相对于目前最常用的HPLC，QNMR法具有以下优点：第一，无需特定的对照品；第二，信号强度仅与氢原子数目相关，无需引入校正因子；第三，特异性强，可以避免色谱法中分离不完全或不出峰的情况。当然，QNMR法也具有其局限性，当化合物结构复杂，不具备1个或1组特征的且与其他峰基线能完全分离的共振峰时，则不适合采用此种方法进行精确定量。QNMR与色谱法原理不同，可与色谱法相互补充，相互佐证。本文建立了对奥沙西泮杂质Ⅰ含量的NMR分析方法。研究结果表明，NMR方法的定量重复性良好，测定结果与质量平衡法结果一致，此方法快速简便可靠。参考文献［1］　JUNGNICKELJL，FORBESJW．Quantitativemeasurementofhydrogentypesbyintegratednuclearmagneticresonanceintensities［J］．AnalChem，1963，35（8）：938［2］　HOLLISDP．Quantitativeanalysisofaspirin，phenacetin，andcaffeinemixturebynuclearmagneticresonancespectrometry［J］．AnalChem，1963，35（11）：1682［3］　TURCZANJW，MedwickT．QualitativeandquantitativeanalysisofamygdalinusingNMRspectroscopy［J］．AnalLett，1977，10（7/8）：581［4］　MALZF，JANCKEH．ValidationofquantitativeNMR［J］．JPharmBiomedAnal，2005，38（5）：813［5］　LINDONJC，NICHOLSONJK．Analyticaltechnologiesformetabonomicsandmetabolomics，andmulti-omicinformationrecovery［J］．TrendsAnalChem，2008，27（3）：194［6］　BHARTISK，ROYR．Quantitative1HNMRspectroscopy［J］．TrendsAnalChem，2012，35：5［7］　程东升，陈蕾，南楠．奥沙西伴原料及其片剂中有关物质的检查［J］．药物分析杂志，2008，28（4）：562CHENGDS，CHENL，NANN．HPLCdeterminationofrelatedsubstancesinoxazepamanditstablets［J］．ChinJPharmAnal，2008，28（4）：562［8］　USP38-NF33［S］．2015：4683，4684，4685［9］　EP8．0［S］．2014：2929［10］　BP2015［S］．2015：459，926［11］　中国药典2010年版．二部［S］．2010：1035ChP2010．VolⅡ［S］．2010：1035［12］　中国药典2015年版．二部［S］．2015：1406ChP2015．VolⅡ［S］．2015：1406，52［13］　HOLZGRABEU，WAWERI，DIEHLB．NMRSpectroscopyinPharmaceuticalAnalysis［M］．Oxford：ElsevierScience，2008：44［14］　EP7．0［S］．2010：641（本文于2015年9月23日收到）