ELISA所需缓冲液的配方

---.可修编.一、做ELISA确定抗原最佳包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？选择好一份已知为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CBPH=9.6或1*PBPH=7.4进行倍比稀释（8个条件）后加入96孔板每孔100ul。（一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进行试验选择）4度过夜取出后甩干，加入20%NBS封闭每孔200ul。37度2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释（倍比稀释4个梯度）即可。棋盘滴定就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N的包被搭配E的试验2．抗原和抗体最佳工作浓度的确定 抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。 1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。 　　方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。 二、ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作1最适工作浓度的选择 1．1间接法测抗体     酶标抗体工作浓度的选择：①用IgG进行包被，洗涤。②将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。③加酸终止反应后，读取吸光度(A)。读取A值在1．0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标IsC的工作浓度应为1／1 600。     棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：①用包被液将抗原由1：50开始作比倍稀释后进行包被，洗涤。②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。③加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后读取A值。⑤选择强阳性参考血清的A值为0．8左右、阴性参考血清的A值小于0．1的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。 1．2夹心法测抗原     在夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10．0、1．0和0．1微克／毫升，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤。②在1个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另1横行加入弱阳性抗原液，第3横行加入阴性对照液，保温、洗涤。③将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1 000、1：5 000和1：25000。分别加入每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。⑤以强阳性抗原的A值在0．8左右、阴性参考的A值小于0．1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。 2测定 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的标准化 2．1加样     ELISA中除了包被外，一般需进行96孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如 规定 关于下班后关闭电源的规定党章中关于入党时间的规定公务员考核规定下载规定办法文件下载宁波关于闷顶的规定 为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出现气泡。 2．2保温     在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度。 2．3洗涤     洗涤在ELISA过程中不是反应 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 ，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附，在ELISA中最为常用。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L反应液；将洗涤液注满板孔；放置2分钟，略作摇动；吸干孔液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3-4次，有时甚至需洗5-6次。如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量。 2．4比色     阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。在目测法中，待检血清与抗原对照反应孔和待检血清与特异抗原反应孔均呈无色HYPERLINK".yz1688./"或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色，而与特异抗原呈橘黄色，判为阳性。如用比色计测定结果，其准确性则决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。 三、ELISA法抗原包被的浓度如何确定？ELISA法进行抗原包被的时候，抗原包被的浓度是如何确定的。看到有些资料中方阵滴定法，稀释抗原和血清，以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适条件。为什么选择这个为最适条件？弱阳性血清有什么用处？ 在摸索包被浓度的时候，血清中抗体的含量是固定的吗？需要提前定值吗？急需答案一般我们做的时候抗原抗体两个变量，抗原的浓度是根据你的抗原的纯度来定的，一般纯化的蛋白是2ng，有时候是要抗体的滴度，抗原浓度固定，抗体或者血清就要拉稀释度，这和酶标仪的灵敏性有关.一般OD值在1.0左右酶标仪比较灵敏，测量的数据比较准确.OD值如果很深,达到2点几就不灵敏了.所以我们一般选OD值在1.0左右进行分析.OD1.0-1.5之间最佳，当然依据酶标仪的性能而定。个人觉得棋盘ELISA一定要选择OD1.0的点是个误区。首先不同型号的灵敏度应该是不一样的；其次OD为1.0指的是某个抗原抗体浓度条件下的OD值，并不代表通过此次棋盘得到的最佳抗原抗体的浓度所做的各种后续ELISA实验的值也是1.0左右，所以说选择处于酶标仪灵敏度的最佳状况并不一定符合后续的实验。（不善表达，不知自己描述清楚没有）我自己觉得要根据不同的实验类型（间接，双抗夹心或是竞争等）来选择最佳抗原抗体工作浓度。象竞争ELISA，做棋盘的目的是包被抗原和一抗的量，试想如果包被抗原太浓，意味着需要竞争抗原浓度也不能小（毕竟是竞争对手不能悬殊太大），这就注定了竞争ELISA的检测限不好（因为竞争抗原往往是要检测的东西，所需浓度越大IC50也就越大）。而一抗也不能足量，否则即能与包被抗原反应又能与检测抗原反应，就不能称为竞争ELISA了。也不能太少，否则整体OD读数太低。双抗夹心ELISA也是同样的道理，找到包被抗体和酶标抗体的平衡点，即能OD与本底之间的平衡点。四、elisa试剂盒Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM抗体ELISA检测。（一）、ELISA简介HYPERLINK"baike.baidu./albums/3101710/3101710.html"\l"0$1e71f724714097694d088de7"\t"_blank"\o"查看图片"  elisa技术流程ELISA的基础是HYPERLINK"baike.baidu./view/20489.htm"\t"_blank"抗原或HYPERLINK"baike.baidu./view/66869.htm"\t"_blank"抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其HYPERLINK"baike.baidu./view/71799.htm"\t"_blank"免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。　　然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。（二）Elisa试剂盒测定技术的发展　　临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的HYPERLINK"baike.baidu./view/3180075.htm"\t"_blank"生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。（三）基因工程试剂对免疫测定技术发展的影响　　免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的HYPERLINK"baike.baidu./view/117180.htm"\t"_blank"单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用HYPERLINK"baike.baidu./view/2721.htm"\t"_blank"基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用ParlEhrich学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml（四）测试剂盒检测原理ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是HYPERLINK"baike.baidu./view/61891.htm"\t"_blank"中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入HYPERLINK"baike.baidu./view/5204409.htm"\t"_blank"孔中并孵育，如果其中存在HEVIgM抗体，这些抗体就会与HEV的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（HYPERLINK"baike.baidu./view/557024.htm"\t"_blank"辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEVIgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEVIgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长:450nm处测量O.D.值,按照本HEVIgM抗体elisa试剂盒的测试标准,O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。（五）操作步骤方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二　用于检测未知抗体的间接法1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；2.次日洗涤3次；3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；5.37℃孵育30-60分钟，洗涤；6.’最后一遍用DDW洗涤。　　其余步骤同“HYPERLINK"baike.baidu./view/1766479.htm"\t"_blank"双抗体夹心法”的4、5、6。（六）试剂器材试剂　　（1）　包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:NaHCO31.59克NaHCO32.93克　　加蒸馏水至1000ml　　（2）　洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15MKH2PO40.2克Na2HPO4·12H2O2.9克NaCl8.0克KCl0.2克Tween-200.05%0.5ml　　加蒸馏水至1000ml　　（3）　稀释液：HYPERLINK"baike.baidu./view/1149780.htm"\t"_blank"牛血清白蛋白（BSA）0.1克　　加洗涤缓冲液至100ml　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。　　（4）　终止液（2MH2SO4）：　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。　　（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml0.1M柠檬酸（19.2克/L）　24.3ml　　加蒸馏水50ml。　　（6）　TMB（HYPERLINK"baike.baidu./view/4329982.htm"\t"_blank"四甲基联苯胺）使用液:TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml　　底物缓冲液（PH5.5）　10ml0.75%H2O232μl　　（7）　ABTS使用液:ABTS0.5mg　　底物缓冲液（PH5.5）　1ml3%H2O22μl　　（8）　抗原、抗体和酶标记抗体。　　（9）　正常人血清和阳性对照血清。器材　　（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。　　（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。（七） 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 1.做好对照　　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。2.实验条件的选择　　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:　　（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　　（2）包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。　　（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接HYPERLINK"baike.baidu./view/2291414.htm"\t"_blank"ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。　　（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。（八）试剂盒的清洗试验原理　　试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板进行检测。先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。自备材料1．蒸馏水。2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。3．振荡器及磁力搅拌器等。安全性1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。操作注意事项1．试剂应按标签 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露HYPERLINK"baike.baidu./view/1397806.htm"\t"_blank"于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。（九）ELISA的应用ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用围日益扩大，　　可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。五、Protocols/Recipes2012-03-299:05Protocols/RecipesAbC-Arrays:10xPBSRecipefor1literDissolvein800mldistilledwater:80gNaCl{Reanal,No.:2464-1-22-38,Nátrium-klorid,Ph.Eur.5;MW:58.44}2gKCl{Reanal,No.:18050-1-01-38,Kálium-klorid,a.r.;MW:74.56}14.24gNa2HPO4*2H2O{Reanal,No.:08973-1-01-38,di-Nátrium-hidrogén-foszfát2-hidrát,a.r.;MW:177,99}2gKH2PO4 {Reanal,No.:17890-01-38,Kálium-dihidrogén-foszfát,a.r.;MW:136.09}Adjustvolumeto1literwithH2OFiltratethroughan0.22umfilteranddividein500mlaliquotesStoreatroomtemperature1xPBSRecipefor1liter[137mMNaCl,2.7mMKCl,8mMNa2HPO4,1.46mMKH2PO4]Dissolvein800mldistilledwater:8gNaCl{Reanal,No.:2464-1-22-38,Nátrium-klorid,Ph.Eur.5;MW:58.44}0.2gKCl{Reanal,No.:18050-1-01-38,Kálium-klorid,a.r.;MW:74.56}1.424gNa2HPO4*2H2O{Reanal,No.:08973-1-01-38,di-Nátrium-hidrogén-foszfát2-hidrát,a.r.;MW:177,99}0.2gKH2PO4 {Reanal,No.:17890-01-38,Kálium-dihidrogén-foszfát,a.r.;MW:136.09}Adjustvolumeto1literwithH2OFiltratetroughan0.22umfilterorsterilizebyautoclaveStoreatroomtemperaturePBS-Tweenfor1liter [0.05%Tween20,PBS]Mixonmagneticstirrer:0.5mlTween20{SigmaNo.:P-1379,Polyoxylethylene-sorbitanmonolaurate(Tween20)}1literPBSPBS-TweenBSAfor300ml [0.05%Tween20,5%BSA,0.05%azide,PBS]Mixonmagneticstirrer:300mlPBS-Tween15gBSA{Sigma,No.:A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}1.5mlSodiumazide(from10%NaN3 stocksolution)Filtratethroughan0.45umfilterAliquot50ml/falconStoreat4°CCa2+ Mg2+ stocksolutionfor5ml [0.25MCa2+,0.07MMg2+]Dissolvein5mlMilliQwater:0.1838gCaCl2*2H2O{Reanal11024MSZ24161-65Kalcium-klorid,szárítottMW:147.02CaCl2*2H2O}0.0712gMgCl2*6H2O{ReanalNo.:20281-1-01-38Magnézium-klorid6-hidrátMW:203.30MgCl2*6H2O}Ca-Mg-VBS(veronalbufferedsaline)for25ml(forserumdilution)[2.5mMCa2+,0.7mMMg2+,0.05%Tween20,5%BSA,VBS]Mixonmagneticstirrer:5ml5xVBS250ulCa2+ Mg2+ stocksolution[0.25MCa2+,0.07MMg2+]1.25gBSA{Sigma,No.:A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}12.5ulTween20{SigmaNo.:P-1379,Polyoxylethylene-sorbitanmonolaurate(Tween20)}Adjustvolumeto25mlwithMilliQwaterFiltratethoughan0.45umfilterAliquot1ml/eppendorfStoreat-20CMg-EGTA-VBSsolutionfor10ml(diluteserum5xwithit)[2.5mMMg2+,6.2mMEGTA,5%BSA,0.05%Tween20,VBS]Mixonmagneticstirrer:2ml5xVBS310ul0.2MEGTA25ul1MMgCl2 stocksolution0.5gBSA{Sigma,No.:A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}50ul10%Tween20{SigmaNo.:P-1379,Polyoxylethylene-sorbitanmonolaurate(Tween20)}Adjustvolumeto10mlwithMilliQwaterFiltratethoughan0.45umfilterAliquot1ml/eppendorfStoreat-20CEDTA-VBSsolutionfor10ml(diluteserum5xwithit)[25mMEDTA,5%BSA,0.05%Tween20,VBS]Mixonmagneticstirrer:2ml5xVBS500ul0.5MEDTA0.5gBSA{Sigma,No.:A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}50ul10%Tween20{SigmaNo.:P-1379,Polyoxylethylene-sorbitanmonolaurate(Tween20)}Adjustvolumeto10mlwithMilliQwaterFiltratethoughan0.45umfilterAliquot1ml/eppendorfStoreat-20C0.2MEGTAstocksolutionfor10mlMixonmagneticstirrer:8mlMilliQwater0.7608gEGTA{ethyleneglycol-bis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraaceticacid(EGTA)SigmaE-4378LOT111K5411FW380,4}AdjusttopH8with10NNaOHotherwiseitwon'tdisolve(becarefulEGTAisanacid)Adjustvolumeto10mlwithMilliQwaterStoreat4C1xVeronalbuffer(VBS)[145mMNaCl,1,8mMNa-diethyl-barbiturate(C8H11O3N2Na),3mM5,5’-diethylbarbitureacid(C8H12N2O3),pH7.3]Dilute5xVeronalbufferwithMilliQwater5xVeronalbufferfor500ml(5xVBS) [727mMNaCl,9.12mMNa-diethyl-barbiturate(C8H11O3N2Na),15.63mM5,5’-diethylbarbitureacid(C8H12N2O3),pH7.3]Makesolution'A':0.94gNa-diethyl-barbiturate(C8H11O3N2Na){5,5-Diathylbarbitursaure.Na-salzServa18797;MW:206.2}21.25gNaCl{Reanal,No.:2464-1-22-38,Nátrium-klorid,Ph.Eur.5;MW:58.44}~300mlMilliQwaterMakesolution'B':1.44g5,5’-diethylbarbitureacid{5,5-dietil-barbitursavReanal04049;MW:184.2}~100mlMilliQwaterBoilitotherwiseitwon’tdissolve,thencoolitdownMixsolution‘A’and‘B’setpHto7.3withapp.50-70μl10NNaOHFillupuntil500mlwithMilliQwater,thenstoreitat+4CELISA:MethodCoatELISAplatewith50ul/well0.2-10ug/mlprotein(purityshouldbeabove3%)inPBSorcarbonatebufferfor2honR/TorO/NinthefridgeWash3xwithPBS-Tween(alternative:followingwashingincubateinELISA-blockingbufferfor30minR/Tandwash3xwithPBS-Tween)IncubateinPBS-Tweendilutedantibody/proteinsolutionfor1hat37C(ideallyafter5hreachtheequibrium)Wash3xwithPBS-TweenDevelopewithTMBAdd100ulTMBdevelopingsolutiontowellsFor1ELISAplatemix:11mlTMBbuffer110ulTMBsolution22ulH2O2 {Hydrogenperoxide30%solutionSigmaH-1009}Add100ul2MH2SO4 tostopthereactionDetectabsorbanceat450nmCarbonatebufferpH9.5for1liter(forELISAcoat)Disolvein1literMilliQwater:1.6gNa2CO32.9gNaHCO3AdjusttopH9.5StoreatR/TELISAblocking-bufferfor10ml [0.05%Tween20,5%BSA,0.05%azide,PBS]Mixonmagneticstirrer:10mlPBS-Tween100mgBSA{Sigma,No.:A3059-100G,Albumin,bovineserum,FractionV}50ulSodiumazide(from10%NaN3 stocksolution)Storeat+4CTMBsolutionfor1ml [10mg/mlTNBinDMSO]Disolvein1mlDMSO{Dimethylsulfoxide,minimum99.5%GCSigmaD5879-100ml}10mgTNP{3,3',5,5'-tetramethyl-benzidineSigmaT-2885FW240.3}Storeat+4CTMB-bufferfor1liter[0.1MNa-acetate,pH5.5]Disolvein950mlMilliQwater13.6gNa-acetate{Nátriumacetát,kristályvizesCH3COONa*3H2OM:136.08Reanal14021}AdjustpHto5.5withapp.700ulcc.Aceticacid{Ecetsav96%Reanal0914-1-08-65M:60.05}Adjustvolumeto1literwithMilliQwater4MH2SO4 for1literCarefullypour392mlH2SO4 {Sulphuricacid96%H2SO4 CarloErbareagentsCodeno.410301(Reanal17769)FW98.078}into608mlMilliQwater(alwayspouracideintowater)2MH2SO4 for100mlmix50mlMilliQwater+50ml4MH2SO4 solutionELISA技术及相关问题在我们的论坛中有许多，在此作一总结如下，其中包括了你需要的容:六、ELISA的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。一、试剂的制备ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。（一）固相载体可作ELISA中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10％。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。（二）抗原和抗体在ELISA实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。ELISA所用抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen）。重组抗原（rebinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂，其应用仍十分普遍，特别是对那些天然抗原不易得到的试验，更显出其独到之处。用于ELISA的抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的IgG可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，则效果更好。（三）免疫吸附剂固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4℃过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。（四）酶和底物ELISA中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。ELISA中最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。在ELISA中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。反应式如下：在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国在ELISA中一般均采用HRP。除HRP和AP以外，在商品ELISA试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体没有源酶（酶的化学发光底物见第十八章）。（五）结合物酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。1．戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。举例如下：2～5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中，4℃下对同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下，缓慢加入1％戊二醛0.05ml，在室温下放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡，即得酶标抗体。辣根过氧化物酶可溶解于50％饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50％饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体，弃去上清中游离酶。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。2．过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18％碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便，但效果不如用SephadexG-200凝胶过滤的好。二、最适工作浓度的选择在建立某一ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。（一）间接法测抗体1．酶标抗抗体工作浓度的选择（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。表15-1间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择各类血清抗原稀释度 1:501:1001:2001:4001:800 强阳性1.201.040.840.680.42 弱阳性0.640.410.300.220.19 阴性0.230.130.080.660.05 稀释液0.090.020.020.020.04 （二）夹心法测抗原在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：表15-2夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度参考抗原 强阳性（25ng/ml）弱阳性（1.5ng/ml）阴性 10μg/ml1:10001.170.150.09 1:50000.460.030 1:250000.1200 1μg/ml1:1000＞20.250.10 1:50000.910.120.01 1:250000.250.010 0.1μg/ml1:10000.420.130.13 1:50000.110.030.02 1:250000.0300 （1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。三、测定方法的标准化要使ELISA测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中短期保存，使用前应观察是否变质。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。测定的实施中，应力求各个步骤操作的标准化，下面以板式ELISA为例，介绍有关注意事项。（一）加样在ELISA中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀