PCR 原理

实验一PCR扩增基因【实验原理】聚合酶链式反应是一种选择性体外扩增DNA的方法，它包括:变性、退火和延伸三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。实验步骤：1 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物上游引物（与母链相同）保护碱基+酶切位点+KOZAC序列（增强子）+ATG+标签+目的序列（25~35）下游引物目的序列+标签+终止密码子+酶切位点+保护碱基再换算成反向互补将引物送去公司合成2PCR体系模板10ng,引物——上游引物（2个）下游引物各1ul,dNTP4uL,5Buffer10ulstar酶0.5ul,DDW31.5ul涡旋震荡微型离心机1）94℃预变性3min；2）94℃变性30sec3）55℃退火45sec；（退火温度一般要比Tm值低2-10度，退火温度越高，特异性越好，但退火温度越低，利于引物与模板配对延伸）4）72℃延伸1min20sec；（延伸时间1kb约1min）5）重复步骤2~4,29次；6）72℃延伸10min；1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2.退火：溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。1、琼脂糖凝胶电泳二PCR产物纯化制备琼脂糖凝胶（1%）1×TAE200ml琼脂糖2g放入锥形瓶中，加热溶化。加入EB，200ml液体中加入10ul混匀。倒胶，插入梳子，自然冷却。凝胶在室温下放置30min，使其自然凝结，小心拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。2.加样电泳取PCR样品，外面混匀再上样LoadingBuffer:染色；其成分有甘油，将样的密度加大，包裹样品，沉到点样孔。开始电泳（100V），注意正负极，120V50Min，当溴酚蓝迁移到距凝胶下缘2cm时，停止电泳。利用紫外投射仪观察DNA条带。3回收PCR产物在高盐存在的情况下，DNA片段选择性地吸附于离心柱内的硅基质膜上，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤去蛋白液和漂洗液将引物，核苷酸，蛋白酶等杂质去除，最后低盐，高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。操作步骤1.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。2.将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。注意：先称一个空1.5ml离心管重量，然后放人凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。3.加三倍体积溶胶/结合液DB.注意：如果凝胶重为0.1g，其体积可是为100l,则加入300l溶胶液。4.56℃水浴放置10分钟（或直至胶完全溶解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。5.每100mg最初的凝胶重量加入150l的异丙醇，震荡混匀。注意：加入异丙醇可以提高回收率，加入后不要离心。6.将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。注意：如果总体积超过750l，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。7.加入700l漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。8.加入500l漂洗液WB12,000rpm离心1分钟，弃掉废液。9.将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇以致下游反应。10.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加15l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。三酶切酶切载体PCDNA3.1载体（50ul体系）质粒2ugBuffer(Green/Tango2X)Green10ulTango5ul酶BamHI2ulxhoi2ul水酶切目的基因体系相同注意：后半个小时在酶切载体中加入碱性磷酸酶防止自连酶切之后，PCR产物要做PCRcleanup加样品和3xBufferPCR-A(吸附)加700ulBufferW2(洗涤)加20-30ulElement(洗脱)注意洗涤之后空离心一次载体最好要做挖胶回收，然后跑胶看浓度~四连接注：之前切胶回收之后测量了质粒以及DNA的浓度测量质粒浓度方法：打开ND-1000V3.71软件--Nuleicacid--加水2-5ul--OK--Blank--Measure--加样2-5Ul--Measure--记录浓度根据浓度计算所需体积Vector2ul10XBuffer2ul水11ulDNA4ulT41ulvector:DNA=1:3~10vector约50ng-100ng碱基约为5.3KbDNA约为1.3kb实验步骤加入pMD18-TVector（约0.03pmol，质粒载体DNA）1μL，及上个实验回收的DNA（约0.1～0.3pmol，插入片段）的DNA溶液（TE缓冲液或去离子水）4μL，总体积为5μL。加入与DNA溶液等量的SolutionI（其中包括连接酶、Buffer、双蒸水）5μL。混合均匀后,3000-4000rpm离心20-30秒；最好再混合并离心一次。16℃下连接45分钟至1小时。4℃过夜~当直接进行转化时，取上述连接反应液10μL转化至100-200μL的感受态细胞。五转化1取感受态细胞放在冰盒中，待其融化2用枪吸取10ul质粒加入到感受态细胞中3冰浴30min(充分混合，质粒贴壁)4热击法让质粒进入到感受态细胞中（42度，90s）5冰浴2min6加入无抗LB800ul混匀737度水浴40Min,同时取LB平板，37度预热8涂布平板，注意提前准备超净台937度恒温培养过夜第二天挑取单菌落，试管（AMP培养基）摇床培养过夜六提取质粒1取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管，12000rpm离心1Min收集细菌，尽量吸弃全部上清。2向留有菌体沉淀的离心管中加入250ulBufferP1,使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀3加入250ulBufferP2，温和的上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3Min4加入250UlBufferE3,立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5Min，12000rpm离心10min，吸取上清，将上清加入过滤柱，12000rpm离心1min过滤，滤液收集到离心管中向滤液加入225Ul异丙醇，上下颠倒混匀，沉淀DNA5柱平衡200ulBufferPS,12000离心2分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回6将步骤5中滤液与异丙醇的混合液转移到平衡好的吸附柱中712000离心1Min,倒掉废液，重新放回8向吸附柱中加入600ulBufferPW，12000离心1Min，倒掉废液9重复一次10将吸附柱重新放回收集管中，12000离心2Min，倒掉废液，吸附柱置于室温干燥5Min11将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附柱中加入水，室温放置几分钟，12000离心2Min，将质粒收集到离心管中，-20度保存。七酶切电泳鉴定酶切体系（10ul）singlecuttwocut10X（FD）1UL1UL酶BamhI0.5ULHindlll0.5ulXholO.5ulDNA1.5ul1.5ul水7ul6.5ul37度水浴30min最后加酶酶要放到冰盒电泳上样twosinglevectormarker跑胶之后使用仪器观察条带鉴定将连接转化入大肠杆菌的质粒提取出来，注意无菌操作！FBS谷氨酸供能培养基配制加试剂顺序DMEM（180）+FBS(20)+LG(2)+P/S(2)八细胞传代1将培养基倒掉后，加入2ml左右的EDTA,清洗，倒掉2再加入2Ml左右的EDTA消化1-2Min（沿侧壁加入，不要吹起细胞）3观察消化情况，倒掉消化液4加入培养基，管不要吸进去，不要掠过盖。九如何转染一个细胞准备：紫外杀菌，热培养基，293细胞已过表达TrkB基因，已提取质粒，电转杯灭菌的无菌水，用枪抽吸入电转杯中，清洗，滤纸吸干吹风，紫外灭菌，取质粒具体步骤：1取出细胞培养皿，倒掉，加入EDTA消化细胞1-2min,倒掉（其功能主要是通过鏊合钙离子等,改变细胞间的连接,使组织或细胞分散成单个细胞,制成细胞悬液用于进一步的实验。）2加入PBS缓冲液，沿着培养皿侧壁加入，吸到试管中注：PBS是磷酸缓冲液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释，原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选注:PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性3配平，离心610rpm3min4弃上清，加入PBS，吹散细胞，分装到3个ep管中离心5加入DNA三组分别是空质粒空载体6加入电转Buffer100ul，质粒的浓度最好大于500ul7加入到电转杯，电转8将电转后的细胞转入装有培养基的培养皿中，操作时先吸取少许培养基到电转杯，再转入皿中，4,5个小时换液十western仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸具体操作步骤1.收集蛋白样品加入等体积的2XSDS-PAGELD（0.125mol/LTris-HCl，4%SDS，2%beta-巯基乙醇，20%甘油，0.2%溴酚兰，pH6.8），煮沸10分钟，14000g离心5分钟，取上清10uL进行SDS-PAGE。剩下的分装几管，放在-20度（反复冻融会对蛋白质有影响而这样做的）。将SDSloadingbuffer煮沸，加于细胞上，快速将细胞刮下，置沸水中煮五分钟，再超声1min(强度6），最后离心12000g,10min,4度，即可取上清加样。电泳(1)SDS-PAGE凝胶配制一、清洗玻璃板二、配胶材料：玻璃板、梳子、架子、枪（100-1000、20-200、2-20）、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧2、配分离胶与浓缩胶，浓缩胶先不加TEMED3、加入玻璃板中4、加异丙醇1ml等待０.5小时5、用水冲洗分离胶，滤纸吸干，注意不要碰到胶上7、浓缩胶加入temed8、将玻璃板加满浓缩胶9、放入小梳子，注意梳子不要插反！等待０.5小时2上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。两边2加上Buffer~电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。电压可以设置在120V左右。3转膜选用PVDF膜。可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为60分钟。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜时注意正负极4封闭(Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。一般将滤纸一同转入漂洗的盒子中，再除去滤纸和胶~加入封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。5.一抗孵育按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。吸尽封闭液，并用TBST漂洗膜，再加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入TBST洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，4次。6.二抗孵育按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。倒掉洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5min,4次~7显色1）1:1配好显色液，用枪吸到手套上2）用镊子捏起膜，扣到显色液体上，注意避免气泡，显色2-4分钟3）将显色之后的膜放到透明片子上，两张片子将其夹在中间，胶带封好4）拿到暗室，胶片放到膜的上面，不同时间段曝光，将胶片放到机器里，待其出来后观察胶片上的条带SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。十一裂解细胞1倒掉细胞培养皿中的培养基，沿着侧壁加入PBS，进行清洗，废液用卫星台式真空泵吸弃重复以上步骤2加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），吹打细胞，将其转入两个准备好的EP管中，标记3裂解40Min(层析柜静音混合器),再离心10min(层析柜里面)，取上清，即我们所要的蛋白41:3加入4Xbuffer（30ulBuffer,90样品）,煮沸5min.（提前准备好Buffer,将样品加到Buffer里面）之前裂解好的细胞还可留出一些用于做IPIP实验一原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。1）弃培养液，PBS清洗细胞一遍。2）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解40min（冰上操作）3）4℃离心，12,000g，45min后取上清20ul；（置于冰上操作）4)加入抗体，置于层析柜中的静音混合器里，过夜5）早上加入珠子，剪掉一块枪尖，加上珠子后放到静音混合器里转动1h~6)去上清，TNE洗，加上TNE后离心2Min,洗6次7）去上清，约剩余10ul，加入30ul4xbuffer，煮沸4min.