匀浆法-茶叶多酚氧化酶的活性测定.doc
茶叶多酚氧化酶的活性测定
一、目的要求
通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。
原理 二、基本
茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。
多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下:
多酚氧化酶
邻苯二酚(儿茶酚)，1?2 O2 ——————? 邻醌 ， H2O
三、材料、仪器及试剂
1、材料:茶树鲜叶。
、仪器:721型分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵或匀浆机;试管;移液管;纱2
布袋等。
3、试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP);0.1M磷酸缓冲液(pH6.5);硫酸铵;1%邻苯二酚溶液;0.1%脯氨酸溶液;6M尿素溶液或20%三氯醋酸。
四、操作步骤
1、粗酶液的制备
称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵(或匀浆机)中，加入2g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质)和100ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60,饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2、活性酶的测定
取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液(2.0ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液;0.4ml 0.1%脯氨酸溶液)，在37?恒温水浴中保温10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。4000rpm离心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波长处，在1~2min内测定吸光度值(A)。空白对照用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚，其它条件相同。
五、酶活性的计算
以每克样每分钟内A增加0.1为1个酶活力单位。 460
A×酶提取液总量(ml) 460-1-1酶活力(0.1A•g•min),——————————————————————————
0.1×反应时间(min)×样品鲜重(g)×测定时酶液用量(ml) 六、注意事项
1、反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效;邻苯二酚还可用儿茶素代替。
2、脯氨酸是用作有色氧化产物形成的稳定剂和加速剂。
3、聚乙烯吡咯烷酮是用作多酚类吸附剂，亦可用聚酰胺及TWEEN80等代替。
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