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大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学论文【精品论文】

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大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学论文【精品论文】大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学论文【精品论文】 大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学 论文 【关键词】 甘氨酸 关键词: GABA;甘氨酸;延髓;免疫电镜;大鼠 摘 要:目的 观察大鼠延髓背角(MDH,三叉神经脊束核尾侧亚核)浅层(?, ?层)内降钙素基因相关肽(CGRP)阳性终末与γ-氨基丁酸(GABA)能和甘 氨酸(Gly)能神经元的突触联系. 方法 包埋前GABA或Gly免疫组织化学染色 方法结合包埋前CGRP免疫金...

大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学论文【精品论文】
大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学论文【精品论文】 大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系_医学 论文 【关键词】 甘氨酸 关键词: GABA;甘氨酸;延髓;免疫电镜;大鼠 摘 要:目的 观察大鼠延髓背角(MDH,三叉神经脊束核尾侧亚核)浅层(?, ?层)内降钙素基因相关肽(CGRP)阳性终末与γ-氨基丁酸(GABA)能和甘 氨酸(Gly)能神经元的突触联系. 方法 包埋前GABA或Gly免疫组织化学染色 方法结合包埋前CGRP免疫金标记电镜技术. 结果 GABA或Gly阳性产物广泛分 布于神经元胞体、轴突和树突内,CGRP阳性标记主要见于无髓和薄髓轴突内. 约53%和51%的CGRP阳性轴突终末分别与GABA和Gly阳性神经元的胞体或树突 形成非对称性突触,其中的多数为轴-树突触,轴-体突触较少. 结论 含CGRP 的初级传入纤维直接与MDH浅层内的GABA能及Gly能抑制性中间神经元形成突 触联系. Keywords:GABA;glycine;medulla oblongata;microscope, immunoelectron;rats Abstract:AIM To investigate the synaptic connections be-tween calcitonin gene-related peptide-immunoreactive(CGRP-ir)terminals andγ-aminobutyric acid(GABA)-and glycine(Gly)-ir neurons in the superficial layers(laminae I and II)of rat medullary dorsal horn (MDH).METHODS Pre-embedding immunohistochemical detection of GABA or Gly,combined with pre-embedding gold marking technique,was used to identify CGRP-immunoreactivity.RESULTS Densely stained GABA-and Gly-ir neuronal cell bodies as well as axonal and dendritic profiles were observed in laminae?and?of the MDH,while CGRP- immunoreactivity was found distributed mainly within thin myelinated and unmyeli-nated axons and their terminals.About53%of CGRP-ir ter-minals made asymmetric synapses with GABA-ir cell bodies and dendrites and so did51%of CGRP-ir terminals with Gly-ir cell bodies and dendrites,the majority of which were axon-dendritic synapses and the minority were axo-somatic synaps?es.CONCLUSION CGRP-containing primary afferent fibers make direct synaptic connections with GABAergic and glycinergic inhibitory interneurons in laminae?and?of the rat MDH. 0 引言 延髓背角(MDH,三叉神经脊束核尾侧亚核)的浅层(?,?层)由投射神 经元和中间神经元构成,主要接受传递面口部伤害性信息的初级传入纤维,1, 2, .MDH浅层内有γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)能的抑制性中间神经 元,它们在外周伤害性信息向中枢传递的过程中,发挥着重要的调控作用.P物 质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)是三叉神经节发出的无髓或薄髓初级传 入纤维的神经活性物质,主要参与伤害性信息向MDH的传递,3,4, .我们以 往的研究观察到含SP的初级传入终末与GABA和Gly能神经元形成突触联系 ,5, .本研究用包埋前GABA或Gly免疫组化染色方法结合包埋前CGRP免疫金标记的电镜技术,对MDH浅层内CGRP阳性终末与GABA及Gly能抑制性中间神经元的突触联系进行了观察. 1 材料和方法 1.1 材料 ?实验动物SD大鼠8只,体质量200,250g,雌雄不拘,由第四军医大学实验动物中心提供;?实验仪器Philips CM100电子显微镜. 1.2 方法 1.2.1 取材 在ip戊巴比妥钠(100mg?kg-1 )的深麻醉状态下开胸,经左心室插管至升主动脉,先用100mL生理盐水冲洗血液,再灌注500mL含40g?L-1 多聚甲醛、2g?L-1 苦味酸和0.5g?L-1 戊二醛的0.1mol?L-1 磷酸缓冲液(PB;pH7.3),持续1.5,2.0h.灌注完毕立即取脑并置于上述新鲜固定液中后固定4,6h.振动切片机冠状切脑干,片厚40μm,切片分2组收集.经冷冻保护后,用液氮对切片进行冻融,以增强抗体穿透细胞膜的能力.再将切片置入含0.2L?L-1 正常羊血清的0.05mol?L-1 Tris盐酸缓冲盐(TBS)溶液中孵育0.5h,以阻断非特异性免疫反应. 1.2.2 免疫细胞化学染色 切片经0.05mol?L-1 磷酸缓冲盐溶液(PBS;pH7.4)漂洗后,用ABC法对第1组切片在室温下进行GABA/CGRP的免疫细胞化学染色,步骤如下:将切片在豚鼠抗GABA血清(1?1000;Chemicon)和兔抗CGRP血清(1?1000;Incstar)的混合液中孵育24h;用结合有生物素的驴抗豚鼠IgG(Jackson)和结合有1.4nm免疫金颗粒(1?100;Nanoprobes)的羊抗兔IgG的混合液孵育16,18h.对第2组切片进行Gly/CGRP的免疫细胞化学染色,步骤如下:将切片在兔抗Gly血清(1?1000;Chemicon)和小鼠抗CGRP单克隆抗体(1?200;Chemicon)的混合液中孵育24h;用结合有生物素的驴抗兔IgG(1?100,Jackson)和结合有1.0nm的免疫金颗粒 (1?100;Aurion)的羊抗小鼠IgG的混合液孵育16,18h.在上述各步骤之间,均用0.05mol?L-1 的TBS清洗.对抗体和复合物稀释时都用含0.2L?L-1 正常驴血清的0.05mol?L-1 的TBS.此后,对切片进行下列处理:?10g?L-1 戊二醛后固定10min;?HQ Silver Kit(Nanoprobes)进行银加强8,14min;?ABC Kit(Vector)孵育2h.切片在含0.2g?L-1 二氨基联苯胺和0.03mL?L-1 双氧水的0.05mol?L-1 Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内呈色10,20min.上述各步骤之间均用PBS洗片3次,每次10min.将免疫组化染色后的切片置入10g?L-1 锇酸溶液固定1h,在含700mL?L-1 乙醇的饱和醋酸铀溶液中过夜,梯度乙醇及环氧丙烷脱水,Durcupan(Fluca)平板包埋、聚合.在解剖显微镜下取出延髓背角浅层,粘接在环 氧树脂柱上,超薄切片,将切片裱于铜网.枸橼酸铅染色,电镜观察、摄片. 1.2.3 对照实验 在省略一抗的条件下,其余染色步骤同上,进行了对照实验,电镜下未见GABA或Gly阳性反应产物及CGRP免疫金标记. 2 结果 在电镜下,GABA和Gly阳性反应产物广泛分布于MDH浅层神经元的胞体、树突、轴突及其终末内(Fig1,2).在阳性神经元胞体内,GABA和Gly阳性反应产物见于胞膜下以及胞内的线粒体、内质网等膜性结构的表面;在树突内,阳性反应产物则见于树突膜下和树突内的细胞器表面及其内部;在轴突内,阳性反应产物主要分布于突触小泡膜下.CGRP免疫金标记颗粒分布于薄髓和无髓的轴突终末内,主要见于颗粒小泡中(Fig1,2).CGRP阳性终末与GABA或Gly阳性神经元的胞体及树突形成非对称性突触联系.在GABA和CGRP染色的标本上观察到的95个CGRP阳性终末中,有53%(50个)与GABA能神经元形成突触,其中42个(84%)为轴-树突触(Fig1),8个(16%)为轴-体突触;在Gly和CGRP染色的标本中,观察到69个CGRP阳性终末,有51%(35个)与Gly能神经元形成突触,其中30个(86%)为轴-树突触(Fig2),5个(14%)为轴-体突触.在CGRP阳性轴突终末内,有大量的多形性突触小泡.其中,圆形清亮小泡最多,颗粒小泡次之,偶见扁平小泡(Fig1,2). 此外,在电镜下尚可见含大量扁平小泡的GA-BA能轴突终末与GABA能树突形成对称性突触联系(Fig1). 3 讨论 GABA和Gly是重要的抑制性神经递质,在MDH内,主要存在于抑制性中间神经元.在中枢内源性镇痛系统中,GABA可能通过激活GABAB 受体,参与对伤害性信息的调控,6,7, .在MDH浅层,GABA能和Gly能抑制性中间神经元通过对初级传入纤维、兴奋性中间神经元和投射神经元的抑制效应,对外周伤害性信息向中枢的传递进行调制.MDH浅层内分布着大量的GABA和Gly能神经元的胞体和突起,在GABA阳性神经元中,约有一半也呈Gly阳性,而Gly阳性神经元中,大多数都同时呈GABA阳性,5, .在MDH浅层内,GABA能和Gly能神经元的胞体和树突直接与含SP的初级传入纤维的终末形成突触联系,提示它们直接接受外周伤害性传入信息,5, ;而GABA能和Gly能的轴突则与投射神经元形成对称性(抑制性)突触,可能抑制面口部伤害性信息向上位中枢的传递,8, .此外,我们以往的研究表明,内源性镇痛系统的下行投射纤维终末在MDH浅层内密集分布,9-11, ,也参与了对伤害性信息传递的抑制,12, . 图1 , 图2 略 因为MDH既不接受来自中枢的CGRP能投射,也没有CGRP阳性神经元,所以,MDH内的CGRP阳性终末均来自于初级传入纤维.在MDH内,CGRP既能增强兴奋性神经递质谷氨酸和SP的释放,也能直接兴奋部分延髓背角?层的神经元,3, .此外,尚有研究表明鞘内注射CGRP抗血清后,大鼠足底注射弗氏佐剂或角叉菜胶引起的热痛敏、机械性痛敏现象消失,13, .上述结果表明,CGRP在MDH的?,?层内发挥兴奋性作用,促进伤害性信息向中枢的传递.我们对MDH?,?层内GABA阳性及Gly阳性神经元与CGRP阳性终末的突触联系进行了观察,见到GABA阳性及Gly阳性神经元的胞体和树突位于CGRP阳性终末的突触后,两者之间主要形成非对称性(兴奋性)突触,但未见到GABA或Gly阳性终末与CGRP阳性初级传入纤维之间的突触联系.上述结果提示外周伤害性刺激可能促进CGRP的释放,经由兴奋性突触将伤害性信息传递给GA-BA能及Gly能 神经元,激活MDH浅层中的抑制性环路,对伤害性刺激进行调制.此外,我们在 电镜下还观察到突触前和突触后均为GABA阳性的轴-树突触(Fig1).此类突触 可能通过抑制GABA能中间神经元,对投射神经元发挥脱抑制 (disinhibitior)作用,使投射神经元的兴奋性增强,进而促进伤害性信息的 传递. 参考文献: ,1,Azerad J,Woda A,Albe-Fessard D.Physiological properties of neurons in different parts of the cat trigeminal sensory complex ,J,.Brain Res,1982;246(1):7-21. ,2,Dubner R,Bennett GJ.Spinal and trigeminal mechanisms of no- ciception ,J,.Annu Rev Neurosci,1983;6:381-418. ,3,Rossum DV,Hanisch UK,Quirion R.Neuroanatomical local-ization, pharmacological characterization and functions of CGRP,related peptides and their receptors ,J,.Neurosci Biobe-hav Rev,1997;21 (5):649-678. ,4,Tashiro T,Takahashi O,Satoda T,Matsushima R,Uemura-Sumi M, Mizuno N.Distribution of axons showing calcitonin gene-related peptide-and/or substance P-like immunoreactivity in the sensory trigeminal nuclei of the cat ,J,.Neurosci Res,1991;11(2):119-133. ,Wang D,Li YQ,Li JL,Kaneko T,Nomura S,Mizuno,N.γ-,5 Aminobutyric acid-and glycine-immunoreactive neurons postsy-naptic to substance P-immunoreactive axon terminals in the su-perficial layers of the rat medullary dorsal horn ,J,.Neurosci Lett,2000;288 (3):187-190. ,6,Yan L,Zhao H,Li YQ.Co-localization of GABAB receptor and serotonin in neurons of the central endogenous pain control sys-tem of the rat ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),2001;22(10):868-872. ,7,Yan L,Zhao H,Li YQ.Localization of GABAB receptor in the central endogenous pain control system of rats ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),2001;22(10):873-877. ,8,Wang D,Wu JH,Dong YX,Li YQ.Synaptic connections be-tween trigemino-parabrachial projection neurons andγ-aminobu-tyric acid- and glycine-immunoreactive terminals in the rat ,J,.Brain Res, 2001;921(1-2):133-137. ,9,Li YQ,Rao ZR,Shi JW.The serotoninergic projections from the midbrain periaqueductal gray to the spinal trigeminal nucleus caudalis in the rat ,J,.Shenjing Jiepouxue Zazhi(Chin J Neu- roanat),1990;6(2):159-164. ,10,Tao FS,Zhang JL,Mei GT,Li YQ.Projection of serotoniner-gic neurons to the trigeminal motor nucleus and sensory nucleus ,J,.Di- si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),2000;21(11):1321- 1324. ,11,Zhang YH,Yang K,Li YQ,Shi JW.Connections between SP receptor-like immunoreactive neurons and thalamic ventral pos-teromedial nucleus-or lateral parabrachial nucleus-projection neurons and5-HTergic or GABAergic terminals in the caudal spinal trigeminal nucleus of the rat ,J,.Di-si Junyi Daxue Xue-bao(J Fourth Mil Med Univ),1997;18(Special issue):52-55. ,12,Li JL,Xiong KH,Wang CM,Li YQ,Li JS.Connections be-tween serotoninergic axon terminals and substance P receptor-like immunoreactive neurons in the superficial laminae of the caudal spinal trigeminal nucleus in the rat ,J,.Di-si Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ),1997;18(Special is-sue):24-26. ,13,Kawamura M,Kuraishi Y,Minami M,Satoh M.Antinocicep-tive effect of intrathecally administered antiserum against calci-tonin gene-related peptide on thermal and mechanical noxious stimuli in experimental hyperalgesic rats ,J,.Brain Res,1989;497(1):199-203.
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