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增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察(精).doc

增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察(精)

不是不是羁绊
2019-06-16 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察(精)doc》,可适用于职业教育领域

增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察作者:李霞作者单位:山东大学附属省立医院烧伤整形科济南【摘要】目的观察不同时期增生性瘢痕(HS)中神经纤维数量和形态的变化。方法标本取自烧伤或创伤后HS形成月~年的患者分为增生期瘢痕组(≤月)和成熟期瘢痕组(>月)正常对照组取自患者的供皮区。利用单克隆抗神经丝蛋白(NF)抗体免疫荧光染色技术在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下观察不同时期瘢痕组织和正常皮肤组织中神经纤维的差异。结果增生期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显高于正常对照组(P<)神经纤维分布杂乱形态不规整有局部的扭曲变细和肿胀断裂成熟期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显低于正常对照组(P<)神经纤维排列较规整内部结构和立体结构均接近正常。结论瘢痕增生过程中神经纤维的密度和形态皆随时间变化而变化。【关键词】瘢痕肥大性神经微丝蛋白质类神经支配神经再生(DepartmentofPlasticSurgery,ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan,ChinaShandongMedicalCollege,Jinan,China)Toobservethechangesofnumberandmorphologyofnervefibersindifferentperiodsofhypertrophicscar(HS)MethodsSampleswereobtainedfrompostburnorposttraumatic(monthsyears)patientsanddividedintotwogroups:theproliferativeHSgroup(sixmonths)ThecontrolsamplesweretakenfromdonorsitesofpatientsImmunofluorescentstainingtechniquewithantineurofilament(NF)monoclonalantibodywasemployedtodeterminetheexpressionofNFinscarsandnormalskinThemorphologyofnervefibersinhypertrophicscarsandnormalskinwasinvestigatedwithalightmicroscopeandalaserscanningconfocalmicroscope(LSCM)ResultsThepositivearearatioofnervefiberswasmuchhigherintheproliferativeHSgroupthaninthecontrolgroup(P<),andthenervefiberwasinanirregularshapeandhadadisordereddistributionwithlocalswelling,twistinganddisconnectionHowever,thepositivearearatioofnervefiberswasmuchlowerinthematureHSgroupthaninthecontrolgroup(P<),andthenervefiberwasorderlyarrangedwiththecontinuanceofinnerstructureandstereoscopicstructuresimilartonormalskinConclusionInnervationinHSgraduallychangeswithscarringmaturation,andnervefibersmayplayrolesinscarformationrelatedtothemorphologicchangesKeywords:Cicatrix,hypertrophic Neurofilamentproteins Innervation Nerveregeneration实验证实神经因素在增生性瘢痕(hypertrophicscar,HS)的形成中发挥重要作用。为了研究不同时期HS的神经构筑本实验采用免疫荧光技术对HS中神经纤维染色用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)分别观察神经纤维的二维和三维空间结构。神经丝蛋白(neurofilament,NF)对神经纤维染色的特异性高而且较其他神经标记物能更有效地反映神经纤维损伤与修复的动态过程。本研究采用先进的LSCM技术能对组织细胞进行分层扫描逐层获取二维光学图像然后对光学切片进行三维重建显示组织细胞的立体结构更详细地观察神经纤维形态学的变化从而为研究瘢痕组织中的神经支配提供形态学依据。 资料与方法 主要试剂和器材恒温冰冻切片机(LeicaCM,德国)荧光显微镜(LeicaDMIRE,LeicaIM系统,德国)LSCM(ZeissLSCM型,LSCMsoftwareversion系统,德国)单克隆鼠抗人NF抗体(ABCAM公司,UK,∶)异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG(SBA公司,德国∶)缓冲甘油(molLpH的碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合)。 标本来源及分组HS共例取自创伤愈合后个月~年来山东大学附属省立医院行瘢痕整复手术的患者。选取实验对象的标准:瘢痕明显高出皮肤色红质韧瘢痕增生局限于皮损区表面无破溃及感染可见毛细血管扩张伴或不伴瘙痒疼痛症状局部未行任何治疗。取材前确认患者无皮肤病或其他慢性病史肝功、生化等实验室检查结果皆正常。以个月为界将实验对象分为增生期瘢痕组(≤月)和成熟期瘢痕组(>个月)每组例。从以上患者的供皮区切取全层皮肤作为正常对照组(n=)。实验前征得患者及监护人同意。 标本处理标本均切成cm×cm~cm×cm大小的全层组织块放入标本袋中并做好标记放于液氮罐口处当组织块接触液氮开始气化沸腾时使组织块保持原位组织即由底部向表面迅速冷冻形成冻块然后置入液氮罐中冷冻保存。实验时将组织块放入恒温冰冻切片机做冰冻切片切片垂直于皮肤表面。每个组织块切套切片:一套μm厚行免疫荧光染色、荧光显微镜观测一套μm厚行免疫荧光染色、LSCM观测。每组皆设阴性对照。 抗体准备与组织化学染色将一抗和荧光二抗原液在推荐工作浓度内通过抗体滴度实验确定最佳浓度。μm切片放入℃纯丙酮中固定minHO室温孵育minPBS冲洗min次×次山羊血清室温孵育min倾去血清、勿洗滴加~μL的稀释一抗(∶)于湿盒中℃过夜PBS冲洗min次×次捞出玻片并吸干多余水份滴加稀释二抗(∶)于℃温箱中避光孵育minPBS冲洗min次×次缓冲甘油封片荧光显微镜下观察。μm切片染色步骤同上只是一抗和二抗的作用时间分别延长至h和h,漂洗的时间延长至min染色后LSCM下观察。阴性对照皆用PBS代替一抗。 阳性判定标准及LSCM观察步骤荧光显微镜及LSCM激发波长皆为nmFITC被激发出翠绿色荧光为免疫荧光染色阳性。淡绿色的背景为皮肤的自发荧光。LSCM的使用方法:①选定观察区域②分层扫描:调节Z轴选择激光全部波长扫描厚度为μm逐层将图像存入系统③三维重建:选择全部或部分分层扫描获得的图像进行三维重建并可旋转图像从不同角度观察。 数据采集及分析将荧光显微镜下采集的图像(所有切片均放大倍)利用形态分析软件(LeicaQwindProV)进行半定量分析计算神经纤维的阳性面积比(阳性神经纤维面积视野总面积)。 统计学处理采用SPSS统计软件对实验数据进行分析实验数据用±s表示多组间比较应用单因素方差分析(onewayANOVA)组间两两比较应用最小显著差(LSD)t检验P<为差异有统计学意义。 结果 荧光显微镜观察结果正常对照组:神经纤维呈明亮的翠绿色条带状形态规则分布均匀少见粗大神经束(图A)。增生期瘢痕组:神经纤维阳性面积比高于正常对照组(P<)。神经纤维长短不一、粗细不均、分支增多、扭曲缠绕呈现出较正常更为复杂的网络关系分布不均多成团或成簇出现(图B)。成熟期瘢痕组:神经纤维阳性面积比低于正常对照组(P<)。神经纤维短小、粗细较均匀神经纤维之间的交连较少分布较规整(图C)。不同组间神经纤维阳性面积比见表。n神经纤维阳性面积比正常对照组±增生期瘢痕组成熟期瘢痕组*图组神经纤维荧光显微镜下形态(免疫荧光染色×) LSCM下观察结果正常对照组:分层扫描可见神经纤维内部结构完整连续无不规则的断裂和肿胀粗细均匀并体现出规律的渐变性三维重建后可见立体结构完整从各个角度观察均无病理改变(图A,图A)。增生期瘢痕组:分层扫描和三维重建可见神经纤维内部结构不完整局部有纵向或横向的断裂面出现、有破损甚至崩解、有不规则肿胀和扭曲变细在不同层次的光学切片上、不同的旋转角度上观察到的病理改变程度不同(图B,图B)。成熟期瘢痕组:分层扫描可见神经纤维内部结构较完整无明显病理改变三维重建可见神经纤维连续性增强粗细较均匀少有扭曲和肿胀分支减少形态接近正常对照组中的神经纤维(图C,图C)。图组神经纤维LSCM三维重建图像(免疫荧光染色×) 讨论HS是一种常见的病理性愈合结果随着瘢痕的形成HS早期神经纤维的数量为明显增多随着瘢痕的成熟神经纤维的数量逐渐减少。但不论早期还是晚期HS组织中始终比正常皮肤组织的神经支配更密集。但Altun等研究却发现烧伤后个月内HS组织中神经纤维比正常皮肤的少比非增生性瘢痕的也少。由于HS中的神经纤维不但发生数量上的改变也存在形态上的改变所以本实验采用神经纤维阳性面积比作为评价指标旨在更全面地考查神经纤维的变化情况。结果表明增生期瘢痕中的神经纤维阳性面积比明显高于正常皮肤而成熟期瘢痕中的神经纤维阳性面积比明显低于正常皮肤提示神经纤维可能与瘢痕增生有着某种关系。因而推测:初期创伤愈合需要较多的神经参与以某种机制调节伤口的愈合同时又有大量的细胞因子刺激神经纤维增生瘢痕形成后随着局部环境的稳定炎症反应的消退刺激因素减少同时瘢痕的重塑或改构能够改善组织的结构和强度逐渐恢复组织原有结构和功能神经纤维也逐渐减少。目前虽有许多学者应用LSCM对神经轴突进行了研究但对末梢神经的研究较少。LSCM能观察神经轴突的三维结构有可能观察到普通光镜下未能发现的神经组织的细微改变。LSCM用激光作为光源即使切片长时间且反复置于光源下也不容易造成荧光的淬灭可提供更多的观察机会背景染色浅让靶组织有很强的阳性对比标记以增强图像分析的效果。在实验方法上本研究采用LSCM观察不同时期HS中神经纤维及神经末梢的空间结构的变化。结果表明增生期瘢痕中神经纤维发生扭曲变形和断裂崩解成熟期瘢痕中神经纤维形态逐渐接近正常。发生这种形态改变的原因可能是:增生期瘢痕内过度的炎症反应和缺氧等环境对神经末梢有着异常的刺激使再生的神经末梢发生溃变出现感觉异常随着瘢痕的成熟部分纤维无法与一定数目的靶器官建立联系并最终溃变恢复接近正常的神经支配水平。上述神经构筑的改变可以解释不同时期HS感觉功能的异常。早期瘢痕红肿痒痛主要因为:创伤愈合新生神经多从解剖上提供了更多的感受器神经产生的神经肽可以作为递质同时其作为炎症介质可能导致炎症介质网络的变化局部生物介质多从而容易产生痒痛。随着瘢痕的重塑神经纤维分泌的神经炎症介质及各种生长因子减少加之中性肽链内切酶活性恢复则进一步抑制了SP的活性瘢痕开始减轻。临床可见老化成熟的瘢痕再破损后愈合修复能力远比正常皮肤差其局部的精细感觉也较正常皮肤差。可以推断:瘢痕感觉的恢复和神经功能的再生只是部分的。Talor等通过一系列实验发现每一皮神经均有一动脉和静脉相伴随除四肢外头颈及躯干等部亦存在丰富的皮神经神经血管伴行关系密切。与皮神经伴行的血管多为皮神经的营养血管因此增生性瘢痕中微血管的变化会影响到神经纤维的再生。Polo等研究发现增生期瘢痕内微血管数目增多并有部分阻塞现象但增生期瘢痕却并没有因为部分血管的阻塞而使其血供减少到低于正常组织这种微血管的变化可以合理的解释本实验中观察到的神经纤维的构筑变化。神经纤维阳性面积增多并且部分再生的神经纤维内部出现了断裂、狭窄等类似“不通”的情况但这种内在缺陷能够被神经纤维面积的扩大和分支的增多所代偿所以增生期瘢痕组织的神经支配仍高于正常。

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