增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察(精)

增生期和成熟期皮肤瘢痕中的神经纤维形态学观察 作者：李霞 作者单位：山东大学附属省立医院烧伤整形科， 济南 250021 【摘要】 目的 观察不同时期增生性瘢痕(HS)中神经纤维数量和形态的变化。方法 标本取自烧伤或创伤后HS形成1月～23年的患者，分为增生期瘢痕组(≤6月)和成熟期瘢痕组(>6月)，正常对照组取自患者的供皮区。利用单克隆抗神经丝蛋白(NF)抗体免疫荧光染色技术，在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下观察不同时期瘢痕组织和正常皮肤组织中神经纤维的差异。结果 增生期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显高于正常对照组(P<0.05)，神经纤维分布杂乱，形态不规整，有局部的扭曲变细和肿胀断裂;成熟期瘢痕组神经纤维的阳性面积比明显低于正常对照组(P<0.05)，神经纤维排列较规整，内部结构和立体结构均接近正常。结论 瘢痕增生过程中神经纤维的密度和形态皆随时间变化而变化。 【关键词】 瘢痕 肥大性 神经微丝蛋白质类 神经支配 神经再生 (1. Department of Plastic Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China; 2. Shandong Medical College, Jinan 250002, China) To observe the changes of number and morphology of nerve fibers in different periods of hypertrophic scar(HS). Methods Samples were obtained from post burn or post traumatic(1 months 23 years) patients and divided into two groups: the proliferative HS group (six months). The control samples were taken from donor sites of patients. Immunofluorescent staining technique with anti neurofilament(NF) monoclonal antibody was employed to determine the expression of NF in scars and normal skin. The morphology of nerve fibers in hypertrophic scars and normal skin was investigated with a light microscope and a laser scanning confocal microscope (LSCM). Results The positive area ratio of nerve fibers was much higher in the proliferative HS group than in the control group(P<0.05), and the nerve fiber was in an irregular shape and had a disordered distribution with local swelling, twisting and disconnection. However, the positive area ratio of nerve fibers was much lower in the mature HS group than in the control group(P<0.05), and the nerve fiber was orderly arranged with the continuance of inner structure and stereoscopic structure similar to normal skin. Conclusion Innervation in HS gradually changes with scarring maturation, and nerve fibers may play roles in scar formation related to the morphologic changes. Key words: Cicatrix, hypertrophic;　Neurofilament proteins;　Innervation;　Nerve regeneration 实验证实[1]，神经因素在增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)的形成中发挥重要作用。为了研究不同时期HS的神经构筑，本实验采用免疫荧光技术对HS中神经纤维染色，用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)分别观察神经纤维的二维和三维空间结构。 神经丝蛋白(neurofilament, NF)对神经纤维染色的特异性高，而且较其他神经标记物能更有效地反映神经纤维损伤与修复的动态过程。本研究采用先进的LSCM技术，能对组织细胞进行分层扫描，逐层获取二维光学图像，然后对光学切片进行三维重建显示组织细胞的立体结构，更详细地观察神经纤维形态学的变化，从而为研究瘢痕组织中的神经支配提供形态学依据。 1  资料与方法 1.1  主要试剂和器材 恒温冰冻切片机(Leica CM 1850,德国);荧光显微镜(Leica DMIRE 2, Leica IM 50 系统,德国);LSCM(Zeiss LSCM 510型, LSCM 510 software version 2.5 系统,德国);单克隆鼠抗人NF抗体(ABCAM公司,UK,1∶500);异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG(SBA公司,德国，1∶250);缓冲甘油(0.5?mol/L pH 9.0的碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合)。 1.2  标本来源及分组 HS共30例，取自创伤愈合后1个月～23年来山东大学附属省立医院行瘢痕整复手术的患者。选取实验对象的标准：瘢痕明显高出皮肤，色红，质韧，瘢痕增生局限于皮损区，表面无破溃及感染，可见毛细血管扩张，伴或不伴瘙痒疼痛症状，局部未行任何治疗。取材前确认患者无皮肤病或其他慢性病史，肝功、生化等实验室检查结果皆正常。以6个月为界将实验对象分为增生期瘢痕组(≤6月)和成熟期瘢痕组(>6个月)，每组15例。从以上患者的供皮区切取全层皮肤作为正常对照组(n=10)。实验前征得患者及监护人同意。 1.3  标本处理 标本均切成0.5?cm×0.5?cm～1.0?cm×1.0?cm大小的全层组织块，放入标本袋中并做好标记，放于液氮罐口处，当组织块接触液氮开始气化沸腾时，使组织块保持原位，组织即由底部向表面迅速冷冻形成冻块，然后置入液氮罐中冷冻保存。实验时将组织块放入恒温冰冻切片机做冰冻切片，切片垂直于皮肤表面。每个组织块切2套切片：一套10?μm厚行免疫荧光染色、荧光显微镜观测;一套30?μm厚行免疫荧光染色、LSCM观测。每组皆设阴性对照。 1.4  抗体准备与组织化学染色 将一抗和荧光二抗原液在推荐工作浓度内，通过抗体滴度实验确定最佳浓度。10?μm切片放入4?℃纯丙酮中固定10?min，3%H2O2室温孵育10?min，PBS冲洗5?min/次×3次，10%山羊血清室温孵育20?min，倾去血清、勿洗，滴加50～100?μL的稀释一抗(1∶500)于湿盒中4?℃过夜，PBS冲洗5?min/次×3次，捞出玻片并吸干多余水份，滴加稀释二抗(1∶250)于37?℃温箱中避光孵育30?min，PBS冲洗5?min/次×3次，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。30?μm切片染色步骤同上，只是一抗和二抗的作用时间分别延长至72?h和1?h,漂洗的时间延长至30?min，染色后LSCM下观察。阴性对照皆用PBS代替一抗。 1.5  阳性判定标准及LSCM观察步骤 荧光显微镜及LSCM激发波长皆为488?nm，FITC被激发出翠绿色荧光，为免疫荧光染色阳性。淡绿色的背景为皮肤的自发荧光。LSCM的使用方法：① 选定观察区域;② 分层扫描:调节Z轴，选择激光全部波长，扫描厚度为0.5?μm，逐层将图像存入系统;③ 三维重建:选择全部或部分分层扫描获得的图像进行三维重建，并可旋转图像从不同角度观察。 1.6  数据采集及分析 将荧光显微镜下采集的图像(所有切片均放大200倍)利用形态分析软件(Leica Qwind Pro V3.3.1)进行半定量分析，计算神经纤维的阳性面积比(阳性神经纤维面积/视野总面积)。 1.7  统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行分析，实验数据用±s表示，多组间比较应用单因素方差分析(one way ANOVA)，组间两两比较应用最小显著差(LSD)t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2  结 果 2.1  荧光显微镜观察结果 正常对照组：神经纤维呈明亮的翠绿色条带状，形态规则，分布均匀，少见粗大神经束(图1A)。 增生期瘢痕组：神经纤维阳性面积比高于正常对照组(P<0.05)。神经纤维长短不一、粗细不均、分支增多、扭曲缠绕，呈现出较正常更为复杂的网络关系;分布不均，多成团或成簇出现(图1B)。 成熟期瘢痕组：神经纤维阳性面积比低于正常对照组(P<0.05)。神经纤维短小、粗细较均匀，神经纤维之间的交连较少;分布较规整(图1C)。 不同组间神经纤维阳性面积比见表1。 n神经纤维阳性面积比正常对照组100.62±0.23增生期瘢痕组15成熟期瘢痕组15 *图1 3组神经纤维荧光显微镜下形态(免疫荧光染色，×200) 2.2  LSCM下观察结果 正常对照组：分层扫描可见神经纤维内部结构完整连续，无不规则的断裂和肿胀，粗细均匀并体现出规律的渐变性;三维重建后可见立体结构完整，从各个角度观察均无病理改变(图2A,图3A)。 增生期瘢痕组：分层扫描和三维重建可见神经纤维内部结构不完整，局部有纵向或横向的断裂面出现、有破损甚至崩解、有不规则肿胀和扭曲变细，在不同层次的光学切片上、不同的旋转角度上观察到的病理改变程度不同(图2B,图3B)。 成熟期瘢痕组：分层扫描可见神经纤维内部结构较完整，无明显病理改变;三维重建可见神经纤维连续性增强，粗细较均匀，少有扭曲和肿胀，分支减少，形态接近正常对照组中的神经纤维(图2C,图3C)。图2 3组神经纤维LSCM三维重建图像(免疫荧光染色，×480) 3  讨 论 HS是一种常见的病理性愈合结果，随着瘢痕的形成，HS早期神经纤维的数量为明显增多，随着瘢痕的成熟，神经纤维的数量逐渐减少。但不论早期还是晚期，HS组织中始终比正常皮肤组织的神经支配[2]更密集。但Altun等[3]研究却发现，烧伤后7个月内HS组织中神经纤维比正常皮肤的少，比非增生性瘢痕的也少。由于HS中的神经纤维不但发生数量上的改变，也存在形态上的改变，所以本实验采用神经纤维阳性面积比作为评价指标，旨在更全面地考查神经纤维的变化情况。结果表明，增生期瘢痕中的神经纤维阳性面积比明显高于正常皮肤，而成熟期瘢痕中的神经纤维阳性面积比明显低于正常皮肤，提示神经纤维可能与瘢痕增生有着某种关系。因而推测：初期创伤愈合，需要较多的神经参与，以某种机制调节伤口的愈合，同时又有大量的细胞因子刺激神经纤维增生;瘢痕形成后，随着局部环境的稳定，炎症反应的消退，刺激因素减少，同时瘢痕的重塑或改构能够改善组织的结构和强度，逐渐恢复组织原有结构和功能，神经纤维也逐渐减少。 目前，虽有许多学者应用LSCM对神经轴突进行了研究，但对末梢神经的研究较少。LSCM 能观察神经轴突的三维结构，有可能观察到普通光镜下未能发现的神经组织的细微改变[4]。LSCM用激光作为光源，即使切片长时间且反复置于光源下，也不容易造成荧光的淬灭，可提供更多的观察机会;背景染色浅，让靶组织有很强的阳性对比标记，以增强图像分析的效果。 在实验方法上，本研究采用LSCM观察不同时期HS中神经纤维及神经末梢的空间结构的变化。结果表明，增生期瘢痕中神经纤维发生扭曲变形和断裂崩解，成熟期瘢痕中神经纤维形态逐渐接近正常。发生这种形态改变的原因可能是：增生期瘢痕内过度的炎症反应和缺氧等环境对神经末梢有着异常的刺激，使再生的神经末梢发生溃变，出现感觉异常;随着瘢痕的成熟，部分纤维无法与一定数目的靶器官建立联系并最终溃变，恢复接近正常的神经支配水平。上述神经构筑的改变可以解释不同时期HS感觉功能的异常。早期瘢痕红肿痒痛主要因为：创伤愈合，新生神经多，从解剖上提供了更多的感受器;神经产生的神经肽可以作为递质，同时其作为炎症介质可能导致炎症介质网络的变化，局部生物介质多，从而容易产生痒痛[5]。随着瘢痕的重塑，神经纤维分泌的神经炎症介质及各种生长因子减少，加之中性肽链内切酶活性恢复，则进一步抑制了SP的活性，瘢痕开始减轻[6]。临床可见老化成熟的瘢痕再破损后，愈合修复能力远比正常皮肤差，其局部的精细感觉也较正常皮肤差。可以推断：瘢痕感觉的恢复和神经功能的再生只是部分的。 Talor等[7]通过一系列实验发现，每一皮神经均有一动脉和静脉相伴随，除四肢外，头颈及躯干等部亦存在丰富的皮神经，神经血管伴行关系密切。与皮神经伴行的血管多为皮神经的营养血管，因此增生性瘢痕中微血管的变化会影响到神经纤维的再生。Polo等[8]研究发现，增生期瘢痕内微血管数目增多并有部分阻塞现象，但增生期瘢痕却并没有因为部分血管的阻塞而使其血供减少到低于正常组织，这种微血管的变化可以合理的解释本实验中观察到的神经纤维的构筑变化。神经纤维阳性面积增多并且部分再生的神经纤维内部出现了断裂、狭窄等类似“不通”的情况，但这种内在缺陷能够被神经纤维面积的扩大和分支的增多所代偿，所以增生期瘢痕组织的神经支配仍高于正常。