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稻瘟菌基因组DNA提取.doc

稻瘟菌基因组DNA提取

eva何_
2017-12-26 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《稻瘟菌基因组DNA提取doc》,可适用于综合领域

稻瘟菌基因组DNA提取DNA的提取包括以下几项:首先必须破碎(或消化)细胞壁释放出内溶物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将样品在干冰或液氮中快速冷冻后用研钵将其磨成粉末。其次必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA它可以螯合大多数核酸酶所需的辅因子镁离子。最后一旦DNA释放出来其剪切破坏的程度必须要降低到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。一般来说如果操作得当可以得到相对分子。质量长度为~kb的DNA不过分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。因为在DNA粗提物中往往含有大量的RNA、蛋白质、多糖和色素等杂质这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白质可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去绝大部分RNA则可通过RNaseA除去。但多糖类杂质一般较难去除这些杂质浓度高时常常使DNA抽提物呈胶状更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性从而阻碍Southern杂交或基因克隆同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。PVP可以去除多酚类物质以免酚类物质氧化带来的颜色影响所抽提DNA的质量。)Extractionbuffer:mMTrisCl(pH)mMNaClandmMEDTA(pH))SDS)MNaCl)CTABNaCl:CTABinMNaClsolutionSDS提取DNA(大量制备)操作步骤称取菌丝g放于研钵中加液氮将其研磨成粉末(尽量细)。将粉末转入ml离心管中加入ml提取液,混匀(此处可剧烈晃动使其充分混匀)。加μl的SDS轻轻混匀于水浴中温浴分钟(每隔分钟晃动一次注意防止将盖子弹出)。加ml的MNaCl小心彻底混匀。加ml的CTABNaCl溶液混匀于水浴中温浴~分钟(期间注意混匀)。待稍冷却后(如不冷却CTAB去多糖的效果不好)加入等体积的酚氯仿异戊醇混匀gmin(根据对DNA的质量要求可决定是否重复该步骤)。上清转入另一离心管加入倍体积的异丙醇室温沉淀分钟(放置时间长点可能产量高点或在下沉淀但有可能有部分SDS随DNA沉淀以后很难去除)gmin。沉淀用的乙醇洗涤后干燥。加入μl的TE溶解(含RNase)转入EP管于处理~分钟后放置min消化RNA。再加入等体积的酚氯仿异戊醇混匀gmin。上清转入另一离心管再加入等体积的氯仿异戊醇混匀上清转入另一离心管。gmin(如果上述步骤操作较好本步可以省略)。上清转入另一离心管加入体积的M的NaAC和倍体积的异丙醇沉淀分钟。gmin。去上清乙醇洗涤沉淀~遍。将沉淀干燥后溶于μl的TE中。SDS提取DNA(小量制备)DNA的大量制备往往用于基因组Southern和Plasmidrescue等分析。但当DNA需要量少且需要处理大量样品时一般采取小量制备的方法此方法所提取的DNA可满足于RAPD和基因敲除实验中PCR之用。操作步骤从平皿上刮下少量菌丝及孢子或试管摇培收集少量菌丝(一般约~mg)加入ml的EP管中。加入少许液氮用钢棒或玻棒在EP管中将其研成粉末。加入μl的抽提液悬浮混匀。加入μl的的SDS处理~h并间歇颠倒混匀数次。然后加入μl的M的NaCl混匀。加入μl的CTABNaCl溶液处理~min。(以上四步可以节减以×CTAB()代替)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(::)混匀rpm离心min上清转移至另一EP管中(本步可以重复提高DNA质量)。加入倍体积的异丙醇沉淀hrpm、离心min弃上清。沉淀用的乙醇洗涤次。将沉淀干燥后溶于μlTE(含μgml的RNase)中。

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