分子流行病学

分子流行病学 寻鸳,,,耦 中国公共卫生I992年第8卷第9蝴 ,一 . 分子流行病学R 上海医科大学流行病学教研室(上海200032) 1972年Laver和Weoster”等用分子病毒 学方法,把1968年出现的甲.型流感病毒的血凝 素Hs与以往甲型的血凝素H进行比较,与鸭, 马的流感病毒血凝素比较,从而提出甲.流感病 毒可能是甲:型病毒和动物流感病毒重组株的 设想.1973年在此研究基础上Kilbourne首先提 出”分子流行病学(Molecularepidemiology)” 这个名词,迄今已广泛应用.分子流行病学是把 分子生物学理论和技术应用于流行病学研究的 边缘学科,是对病原学在基因水平上分析其蛋 白质和核酸分子结构上的差异,确切的阐明病 原,宿主,环境及一些有关的流行病学问题. I常用的分子生物学方法 1.1寡核苷酸图谱分析(oligonucleotide fingerprinting)病毒RNA经某种特殊的 RNase~化后产生很多大小不同的片段,这些 片段经电泳后形成一个图谱.一定结构的RNA 呈显特定的图谱,具有诊断意义.常用RNase T-酶,此酶仅在鸟苷酸部位切断,当fA经 此酶消化后产生末端为鸟苷酸的片段.这些寡 核苷酸在双向电泳中能分开.双向电泳中第 一 个电泳用pH3.5缓冲液,由于寡接苷酸含有 A,C,G,u的量不同而造成净电荷不同(带 电荷顺序为C<A<G<U),pH为3.5时此4 种核苷酸的电荷差最大,易将它们分开.第二 个电泳用pH8.0缓冲液,根据寡核苷酸分子 量大小把它们分开.此方法敏感度高,甚至仅 有个别硷基差别亦能显示出来. 1.2限铺性内切酶图谱分析(restriction endonucleasepattern)限制性内切酶是细 菌的酶类,一种酶只能在一个特殊的硷基序列 位点上降解DNA,每个基因组切割位点是固 定的.用同一种酶对相同的病毒或菌株切割后 刘饭辅虫1934年5生教授 的DNA片段数及大小是一致的,这些片段经电 淋后能形成一种特异的图谱,亦称指纹.本方 法除应用于细菌和病毒的基因组DNA外.对 分子量相同或相似的质粒进行酶切,从图谱的 特点亦可鉴别质粒是否相同.在进行酶切图谱 分析时,首先要选择效果较好的内切酶,常用 的有EcoRl,Hind~,BamHI.某一基因组 经酶切后再进行凝胶电泳分析,凝胶板经溴乙 淀染色后可直接观察或再进行放射自显影法观 察条带. 1.3基因探针和棱酸杂交(geneticprO- bingandDNAhyoridization)DNA分子 由两条以氢键连接起来的互补脱氧核糖核酸多 核苷酸链组成的双螺旋结构,在热或偏碱条件 下,双链的DNA可形成单链,称DNA变性. 两条单链核苷酸链,若遇有同源顺序的核苷酸 存在,互补的碱基对(A:T,G三C)又能形成 氢键,从而产生双链,称DNA复性.基因探针 和核酸杂交是利用棱酸变性的可逆反应原 理,用一种已知顺序的核酸片段探针标记放射 性同位素或非放射性标记物去检测样品中有无 互补的碱基DNA存在.探针可以是细菌或病毒 的基因组,整个羼粒或某一片段,以及病毒的 cRNA等.探针本身的分子量小,结构清楚, 负责编码简单而均一的表性特征,其特异性 与敏感性较高.常用的杂交方法有下列几种t (1)斑点杂交(dotblDlhybridization), (2)印迹或转移杂交(southern或northern blot),(3)原位杂交(insitahybridization) I.4质拉图谱分析(plasmidpattern) 质粒是一种自身复制,染色体外的DNA,亦 称染色体外有遗传作用的物质.大多数细菌含 有大小不一,数目不同的质粒,质粒在细菌之 问也可以传递.有些细菌带有几种质粒,但在 址 一 定时间,一定地区质粒保持相对稳定.共价 闭合环状质粒的DNA在琼脂凝胶电泳时,其 相对迁移率与分子餐的对数篮呈负相关.某一 株菌所带的质粒全部情况构成其质粒图谱,按 图谱特点可判定流行株或非流行株等有关病原 学问题. 质粒DNA提取基本方法,应用溶菌酶处 理细菌后,用碱性SDS裂解菌体,染色体DN- A及细胞大分子物质在高盐溶液中沉淀,将含 有质粒DNA的上清液用酒精沉淀,提取后的 质粒DNA用珐腊糖凝胶电泳,再经澳乙锭染 色即可获得特异性质粒图谱. 1.5RMA病毒节段电泳分析(miation rateanalgofRNAgerlesegment)凡 具有RMA节段基因组的病毒,例如流感, 轮状病毒等,常采用聚丙烯酰胺电泳来对RNA 节段进行分析,电泳后的RNA条带用硝酸银 染色进行观察,不同类型病毒f矾A迁移图谱 不同,比较其条带的数目和宽窄就可鉴定各种 病毒.例如轮状病毒是双股RNA病毒,含有 11个节段,它们可以通过电泳加以区别. 1.6多聚酶链反应(p~ymerasec/lain reasonPRC)多聚酶链反应是试管内目的 I>NAk段在引物(prim时)作用下的酶增殖反 应.摸板DNA用两个己知序的引物(一般 每个引物约含有2O个核苷酸),Taq多聚酶帮四 种三磷酸盐脱氧核苷酸(dATPdCTPdGTP dTTP),在各种温度条件下进行不同反应过 程.94?lmin,使双股DNA变性为单股 ,A.5O?lmin,使一个引物与模板正键互 补的DNA结合,另一引物与负链互补的DNA 结合.72?2min,在耐热多聚酶的作用下, ~aNTP存在,使结合上的DNA引物向一定 方向伸展,最后形成两个新的双股EA,此为 第1个循环.第2次循环后形成4个DNA, 如此不断循环,DNA亦不断增加,其增殖数 呈2的指数增加(即2n),指数n为循环周期 数.pCR法敏感度高,待异度强. 2分子流行病学应用 当前在流行病学的研究中对病原体的鉴 定,主要根据其表型特点,如形态,生化反 应,代谢产物的分析,血清学的特点,耐药 谱,组织培养及动物的致病力等,而这些特征 不能解释病原体可能发生基因的变化.着几种 病原体共同感染能改变其表型特征,从而使新 分离到的株无法分型,分子生物学技术可以分 析病原体的基因型特征,基因型是遗传特征,相 当稳定,从基因水平来研究病原体,更易了解 流行的来龙去脉,更易制定有针对性控制流行 和预防措施. 2.1阐明疾病的传播规律Adler”„报道 HCMV在日托机构中儿童和他们父母间的 传播规律,用限制性内切酶图谱法观察26个 月,发现在日托机构中3株HCMV能以儿童 传给儿童,流行率在26个月中从25增歪61, 3岁以下儿童感染较多,传播速度相对较侵, 每月大约有1例儿童感染.多数儿童在原发感 染后排毒能持续24个月,虽然接触传染源的时 间较长,但至观察期满在3岁以下儿童中仍有 5O未感染.在日托机构感染HCMV儿童有 双亲58例,用限制性内切酶方法,证实有13例 从儿童中获得继发HCMV感染,嗣后有2例 父亲又从感染HCMV的母亲中获得感染,阐 明HCMV以日托儿童传入家庭,尔后又在家 庭内传播. Pass”应用同样方法,证明由儿童把HC- MV传入两个家庭. 2.2追踪传染源Brumm~”„等报道 1985年7月在某医院暴发一次以腺病毒3a引起 的上呼吸道炎症.6月24日有1例女性病员, 主诉近2年来有口腔溃疡,患淋巴细胞性自血 病,半年来常有呼吸道炎症,乏力,两个月来 有腹泻,流鼻涕,发热而入院,经各种抗菌素 治疗均无效,于住院后l5天死亡.自7月1日 至2O日,存38例曾接触过死亡病钶的工作人员 患急性上呼吸道感染,其中有l8侧分离到腺病 毒3型,有1例血请抗体逆转.另有34例接触 的工作人员,虽无急性上呼吸道症状,其中亦有 4例血清学抗体逆转.从原发病例及继发病佣 中分离到8株病毒,甩6种限制性内切酶进行 413 分析,从BamHI消化后的琼脂醣凝胶的条带 中发现,本次分离到的腺病毒与原来腺病毒3 型是不同,但从这次原发病例与继发病侧中分 离烈的病毒是完全一致,为腺病毒3a.本次医 院内工作人员中急性上呼吸道感染暴发的传染 源为女性死亡病倒,在她住院15天中引起接触 者继发感染,病原体为腺病毒3a. 2.3探讨茵(毒)抹的变异P叩lhei— m日?等应用白喉毒素探针及内切酶图谱法 进行白喉分子流行病学研究.从一位患膜性扁 桃体炎的婴儿分离到一株产毒的白喉杆菌,对 她的周围人群进行带菌检查,结果又分离到一 些产毒株与非产毒株,从这些菌株提取DNA后 再进行内切酶图谱分析,发现这些菌抹的DNA 相同,但与其他地区分离刭的白喉杆菌DNA 图谱明显不同.又用白喉BC探针检查,发现 凡产毒株均呈阳性反应.作者又进行一系列分 析,认为一株带有产毒的白喉杆菌传入一群有 免疫力的人群,以后又通过噬菌体的作用,将 当地人群中非产毒的菌群转化为产毒株,产毒 基因得以扩散,再次传入无免疫力人群可获得 感染而发病. 2.4耐药性茵抹的分离淋病双球菌对抗 菌素均较敏感,但近年来发现对青霉素产生耐 药性,治疗淋病所用的普鲁卡因青霉素G的剂 量增加数十倍.1976年出现有质粒介导的耐青 霉素淋球菌,它能产生青霉素酶(penic?fllina- seproducingNeisseriagonerrhoeae简称 PPNG).此菌株对青霉素,四环素及氨基苷 类抗菌素均耐药.PPNG含有染色体外编码B一 内酰胺酶(beta-Iactamase)的质粒(环状双股 DNA),该酶可破坏青霉素的内酰胺环而产生 抗药性.1976年美国 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 第一例感染PPlNG病 例,1980年前主要为输入性病例,1980年后 PPNG捡出率明显增加,1986年此类病例16648 例,井在继续增加.对PPNG{~行质粒分析可 了解它的地理分布及地方性流行株等. 2.5疾病地方性研究1978年9月在美国 路易斯安那州因食用不合适烹调方法的螃蟹而 引起11侧霍乱暴发}从病员的大便中分离到霍 乱弧菌O-1株,此菌株与1973年在得克萨斯州 所分离到的菌抹,从溶血反应及噬菌体分型来 看,两者极为相似,推测此菌株可能是美国海 湾的地方性株.作者”应用分子流行病学方 法进行观察,由于霍乱弧菌产生毒素(cholera toxinCT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(heatla— bjleen/~rotoxmLT)之间的【A序列是同 源性,可利用大肠杆菌LT基因制备成探针与 从霍乱弧菌中提取的DNA进行杂交来测定是 否有CT基因存在,研究墨西哥海淹的霍乱地 方性问题.用Hind?限制性内切酶降解古典 生物型霍乱弧菌的DNA,应用同源的LT探针 杂交后在凝胶电泳板上至少有2个片段,而EI Tot生物型仅有1个片段,在墨西哥湾地区分 离的霍乱弧菌除1株外(输入性)均有2个片 段,如用EcoRI内切酶则显示1个片段,与 世界各地区分离到的霍乱弧菌是不同,提示肠 毒素霍乱弧菌0一l株在美国的爨西哥海湾呈 地方性. 2.6保证优生优育诊断胎儿遗传性疾 病,庄用分子生物学方法研究基因结构,可了 解胎儿得遗传性疾病的可能性.例如镰刀状红 细胞贫血,病因为在B一血色素蛋白基因DNA 序列中腺嘌岭园突变而转成胸腺嘧窿,导致血 红蛋白中蹦,链N端第6位的谷氨酸为缬氯酸 所替代引起红细胞镰变的血红蛋白病.这种突 变破坏某种限制性内切酶的酶切点,改变了 DNA的序列,故应用限制性内切酶图谱可作判 别.An~onaek/s”„报道一对夫妇外表健康. 曾分娩一个B地中海贫血的患儿,现再次怀 孕,欲了解虑几双亲的基因型及这次妊娠胎儿 的命运.作者用Hil2c?与BamHI两种内切酶 分析,观察两种酶切点在双亲与患儿中的多态 性及胎儿羊水细胞酶切点多态性,通过分析确 定患儿B地中海贫血基因的来源及胎儿是B地 中海贫血的患者或携带者.BarnttI对第1l对 染色体的作用产生22kb与8.3kb?~个片段, H-mc?则产生7.6与6.0kb两个片段.B地 中海贫血是一种隐性遗传病,如其后代中有 一 名患者,则其父母必为该病基因杂合子的携 内切酶kb BamHI22 8.3 HincII. 7.6 患儿父母胎儿 …一 6.0… 附田BarnHI与HinzI两种内切? 带者.从酶切图可见,BamHI切割的22kb, H.hnctI切割的6.0kb片段为B地中海贫血的相 关基因.BamHI的22kb来自父亲,HintII 的6.0kb来自母亲.胎儿仅有琢nc?6.9kb, 是携带者,非患者故不必人工流产. 2.7疫苗制备以往使用的疫苗多采用死 疫苗或减毒活疫苗,随着对病原学研究的深 入,从分子水平分析病原体的核酸与蛋白,利 用病原体巳知核酸与蛋白的特性来制备疫苗, 主要有下列几种:(1)重组减毒活疫苗通过 与减毒株重组,获得能诱发有效免疫反应的减 毒株疫苗,可直接用于预防接种.例如流感病 毒冷适应减毒株,如与流行的新变异株鸯组, 可获得能诱发抗新毒株免疫力的减毒,活疫苗 株,用于预防接种,可控制新毒株的流行. (2)基因工程疫苗通过DNA重组技术,将 编码免疫原的基因插入载体,并引入细菌,酵 母或真核细胞中,可以产生大量免疫原,再经 过纯化,可用于预防接种.如将编码乙型肝炎 表面抗原的卸BV基因引入酵母菌中,lJ此酵 母菌可以表达HBsAg,经纯化而制备乙肝疫 苗.(3)台成疫苗某些病毒已能人工合成其 具有抗原活性韵多肽,如乙型肝炎病毒,流感 病毒,脊髓灰质炎病毒等的人工合成多肽.合 成多肽一般分子量较小,其免疫原性远比原有 病毒低.常需与载体蛋白结台,并选择一个好 的免疫佐剂,以增强其免疫效果. 2.8肿瘤病因研究自1980年发现肝细胞 肝癌(HeC)中有HBVDNA整合以来,对 唧与HCC的关系进状大量分子生物学研究, HBlv基因组由部分双链环形结构的DNA分子 构成,约含3200个核苷酸,它通过逆转录酶经 RNA中间体而完成复制.近年研究提示,HBV 持续感染与HCC的发生有一定关系.Shaf~一 z”„等对HCC患者血清和癌组织中的HBV DNA及HBV标志进行详细研究,他们认为在 HBV持续感染后导致HCC的过程中,根据 HBVEINA及其血请中HBV标志的变化可分 为6期.在第?期肝内复制的HBVDNA,由 于HBVC基因表达低下或短缺,致使病毒装 配受阻,复制的病毒【A积聚在旰内,从而 影响感染的结局,引起整台病毒的EINA扩增 而致癌.Raimondo”的实验结果也证观HCC 中的HBVC基因表达发生改变,不仅表达低 下,而且表达异常产物而致癌.HBeAg是免 疫细胞识别和攻击的靶抗原,当HBeAg编码 基因发生改变或表达异常时,可使受感染细胞 逃避宿主免疫细胞的攻击,病毒能持续感染, 在各种因素作用下,导致旰细胞转化或癌变. 对砭B阳性患者中HBeAg或抗HBe阳 性者进行观察,分析血清,肝组织与癌组织中 的HBVDNA.有4例I-IBsAg与HBeAg均阳 性,其中3例血清中HBVDNA阳性,盱 组织中有整合及复制型DNA,4例的癌组织 中均有整合的HBVDNA.9例gBsAg与抗 HBe均阴性,血请中HBVDNA均阴性,6例 旰组织有整合的HBVDNA,3例有复制型 HBVDNA,8例癌组织中有整台HBVDN- A,提示血清中HBVDNA阴性,但HBV在 旰脏中可继续繁殖. P,eeveF”“应用原位杂交研究人乳头状 癌病毒(HPV)与宫颈癌的关系,发现HPV 16,l8型与宫颈癌关系密切,相对危险度从2.1 ,9.1.Young”„等用PCR法研究HPV与宫 颈的关系,38例宫颈堕细胞学有异常者均为阳 性,其中36侧为HPV16型,22例为16型与l1 型双重感染.另有1O例细胞学正常者,其中有 7例为1l型或16型. 参考立越 i.WebsterRG,eta1.Antigenicvariationo/ _mnu阿1zaviruses.InKibourneED.Thein— fluenzavirusesandinfluenza.NewYork Academicpress1975:26g. 2.Ad1ersP.Molecularepidemielogyofcyto? megajnlB:Y.?altr舡l锄_培B~mongchil- drenattendingadaycarcenter?their (下转498页l 0,)幼儿搠l,4 悼———?—菥 _———?—丽日霸r—目8e-—ii=丁———酮币—06.0tJo.3 …?蜉暖墨扁53e.目I.1呼吸幕崭3r.oI4.6 0,,.缸齿瓤中毒I193.119.3传染病2J.?i0.1 死饲 l疆伤和中毒 恶性肿瘤 先异常 死亡卓 28.345.O 10.1I6.D 1.08r0 墨街和中毒48.337.4 6.9 砰暇系稿 脑血管病 恶性肿瘤 心脏病 稍化系病 „n. 17. 1?. 6. 2.上虞昌卫生局.上直县1D74,】975年恶性肿?l甓亡 葑属疆l查报告(内帮,l1). 3.橱树勤主犏.卫生统甘学.第2}北京?人民卫 生出版牡,-/988.:196.? 4.誊月犁,等.中国卫生年盥.第1版.北意.人民 卫生出版社,1988l524. 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