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【doc】PCR—SSP及PCR—SSCP在骨髓移植配型中的联合应用.doc

【doc】PCR—SSP及PCR—SSCP在骨髓移植配型中的联…

亲耐的爱我为何不懂我
2017-10-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《【doc】PCR—SSP及PCR—SSCP在骨髓移植配型中的联合应用doc》,可适用于社会民生领域

【doc】PCRSSP及PCRSSCP在骨髓移植配型中的联合应用PCRSSP及PCRSSCP在骨髓移植配型中的联合应用经f一ssf)f一c,f中华器官移植杂志年月第卷第期ChinJ嚷a力T~anspLant,July,VolNofffPCRSSP及PCRSSCP在骨髓移植配型中的联合应用孙玉英孔繁奚永志刘广贤陈兴国金荔屠敏,一一目的研究}【摘要】A抗原分型的方法方法对对已进行}A抗原血清学分型的骨髓移植供,受者采用序列特异弓I物聚合酶链反应(eCRSSP)及单链构象多态性聚合酶链反应(PCRSSCP)进行}A抗原的基因分型DNA的提取采用快速盐析法结果基因分型结果与血清学分型一致者有对,基因分型能明确判定而血清学分型无法判断者有对FCRSSP与PCRSSCP结果完全一致者有对对PCS分型为HLADRB相合而I)QB不相合,PCRSsCP分型为HLADRB有轻度差别,而DQB,DPB有明显差别,该倒患者骨髓移植后发生了级移植物抗宿主病结论PCRSSP与PCRSSCP联合应用有利于卜A配型的准确性,是一种较理想的配型方法【关键词】人白细胞抗原免疫测定聚合酶链反应CombinedapplicatkmofPCRSSPandPCRSSCPinbonenlrrtransplantatkmtypingSUNY馏,KONGFard~ua,Yongzhi,etgfthHospitalofthePLA,Beijing【Abstract】ObjectiveTostudythemethodforhttrnanleukocyteantigen(HlA)typingMethodsHLAget~typingWaSpcformoabyusingPCRSandPcRSSCPinpairsofbonemarrtransplantationdonorrecipientswhounderwentmmloglctypingDNAfrcxnpairsofsampleswefeextractedbyafasttilgxJtmethodResultsThes~rologidandget~otyplngl"~t!tSxereidenticalinCases,serologicaltypingvmfailureincaseswhocouldbetypedeasilybygetlotypingmethodsBetweenthetwogetlotypingmethodstherewerecasesofidemicalrestlltsandcaseofdifferentresultsAfterthepatientreceivedthegraft,hegotgradegraft~rsJhostdisease(GVHD)(Il珥inTheccmbindapplicaticmOfPCRSSPandPeRSSCPwasanidealtypingmethodandmightbehdpfu|tOaccunatelytpyeHLA【Key】HLAantigensIramuncassayPolymer~sechainreaction国外资料表明,HLA抗原的基因分型与血清学分型的相合率为踟左右,基因分型更为准确我们根据序列特异引物聚合酶链反应(PCRSSP),单链构象多态性聚合酶链反应(PCRSsCP)的特点,在临床骨髓移植(BMT)配型中发挥二者的优点,为移植成功提供可靠的保障对象与方法一,研究对象为我院准备行BMT的患者(】例及供者(】名,已做HLA抗原血清学分型二,PCR引物PCRSSP的引物及内部阳性对照引物见文献作者单位:北京解放军第医院免疫室eJ移植免疫,PCRSSCP的引物为第十一届国际组织相容性研讨会宣布的资料,即DRB为'()CCACAGCACGTTT~,'~ACTGTGAA~DQB为"CATGTGCTACTTCACCAAC~'CTGGTAGTTGTGTCIbCACAC一DPB为"~ACCATGTGTCAACTTAT一OG一三,DNA的提取及鉴定采用快速盐析法,即向g几乙二胺四乙酸二钠(玎A)抗凝外周血中加入m红细胞裂解液,rrain离心分钟,沉淀白细胞弃上清液,加m无菌水洗沉淀次,rrain离心分钟弃上清液,向管内加入踟x蛋白酶一K缓冲液,质量浓度为gL的蛋白酶一K(】,l中华器官移植杂志年月第卷第期CNnJOmanTransolemt,July,Vol,NogL十二烷基硫酸钠(SDS)txl和HO,水浴分钟加molLNaCo"l,充分混匀秒钟,rrain离心分钟,沉淀蛋白向上清液中加人ml体积分数为乙醇(加)沉淀DNA体积分数为O乙醇洗次,空气干燥,向沉淀中加水txlDNA的含量及纯度鉴定见文献四,HLADRB,DQB的PCRSSP方法见文献,五,HIADRBl,DQB,DPB的PCRSSCP方法根据}A类抗原多态性由类基因的第外显子决定的特点,对它们的第外显子进行特异性扩增,每个标本扩增管反应体积为O,除Mg浓度为mmolL外,其余同DRB扩增条件循环参数:分钟秒,秒,秒,共O个循环向扩增产物中加人体积的甲酰胺,秒,立即冰浴分钟,然后上样到gL非变性聚丙烯酰胺gL丙烯酰胺溶液m,gLTBE电泳缓冲液(),无菌水ml,g几过硫酸胺m,加N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED)凝胶中接上电源,vcm,电泳小时将揭下的凝胶放人含ng几溴化乙锭(EB)的O×TBE电泳缓冲液中,染色小时,置紫外灯下观察结果结果一,O对供,受者的血清学与基因分型结果血清学分型鉴定出培对供,受者HLA抗原型别一致,有对的结果无法判断基因分型共鉴定出对供,受者HLA类抗原相同,无法判定结果者没有,鉴定出对不相合,而这对血清学鉴定相合,其血清学鉴定结果为:供者为A,:B,()DR,DQ(),一受者为A,B,()DR,DQ(),一PCRSSP的结果为:供者为DR,DQB*受者为DR,DQB*,其DQB的电泳结果见图及图PCRSSCP结果为:供,受者DRB部分有较小差别,而I)QB及DPB则显示较强的不一致性,其电泳结果见图二,PCRSSP与PCRSScP的结果比较在()例骨髓移植配型中,PCRSSP与PCRSSI:P结果一致者共l倒,只有例,PCRSSP分型为供,受者的DRB结果一致,而PCRSSCP分型时发现供,受者DRB部分存在差异,见图,,该例患者在BMT后发生了级移植物抗宿主病讨论随着分子生物学技术的发展,在DNA水平对HLA的研究已获得很大进展,发现血清学的表型相同,DNA核苷酸序列并不一定完全相同,HLA的个体遗传学差异的本质不是在血清学方法所检测的基因产物,而在编码基因产物的DNA水平上一血清学分型较粗略,基因分型较细致,它可以检测出血清学由于抗血清缺乏而引出的抗原空位点本组有例血清学分型无法判定结果,这是由于血标本为白细胞污染和淋巴细胞活性差之故,而基因分型则不受这些因素的影响国外资料也表明,血清学分型误差率较高,平均达由此可见,基因分型在特异性及可行性方面,具有一定的优势,能提高骨髓移植的成功率,特别是在无关个体骨髓移植中将发挥更大的作用PCRSSP是以序列特异性寡核苷酸引物为特点的HLA抗原的基因分型方法,由于HLA类抗原的等位基因众多,因此不可能对每个等位基因进行特异性扩增,而且,HLA随人种,地域的不同,等位基因的频率也不一致,因而在设计引物时,应着重考虑本国及本人种的高发等位基因,反之则费时费力所以,本研究所使用的PCRSSP引物为组特异性引物,是低分辨的基因分型方法,国内其他单位所使用的PCRSSP引物绝大多数也为组特异性引物该方法的优点在于快速,简便,特异性高,能正确指出基因型别PCRSScP是利用一对寡核苷酸引物特异性扩增HLA类抗原的基因第二外显子,对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可分辨出一个碱基的差别,因而具有高分辨的特点,其缺点在于不能给出基因型别我们对这两种方法进行了有机组合,取长补短,发挥更大的作用例如对PCRSSP鉴定为不相合,而血清学相合的倒,为进一步验证基因分型结果,又进行了PCRSscP结果发现不仅DQB及DPB不一致,而且DRB部分也存在差异这一发现说明PCRSSI:P是PCRSSP的有力补充,这两种方法的结台有利于指导临床实践活动(本文图,见插页第页)饪植巧桃朽中华器官移植杂志年月第卷第期(nJ()咖TLs皿t,Ju,v【',No参考文虢刘广贤,孔繁华,张瑞芳,等PCRSSP基因丹型技术的建立及其在骨髓移植配型中的应用中国实验临床免疫学杂志,】,:孙玉英孔繁华,奚永志,等}n^D哑PGRSSP方法的建立及其在骨髓移植中的应用研究中国实验血{蓖学杂志,】,:KirauraASasazulTElev~thintemationohistooornpatihilityworkshoprekmprotocolfortheHLADNAtypingtechmqueI:TslKAizawaM,Sasa~ukLT,edsOxford:scieacePuhfications,金冬雁,黎盂枫分子克隆实验指南第皈北京科学出版社Jorda~FMcirmieAJTurnerSetGorrtl:~arisonD{HLADRBtypingbvDNARFLPPCRSSOandPCRSSPmethods皿ddeirapplicationinprovidingmatchedar~eNteddfxrsforbenerrtarlrowtrarL~plantadonTjssueAntigens:】(收稿:修回:J)l大剂量地塞米松治疗难治性移植肾急性排斥反应汪泽厚莫华杨唐俊张银甫严治林王平贤黄赤兵范明齐急性排斥反应是影响同种肾移植成功的主要因素之一,临床上常用甲泼尼龙(MP)冲击治疗,部分患者因治疗无效而改用抗^胸腺细胞球蛋白(AlG)治疗,但后者价格昂贵,临床应用受到很大限制近年来我们尝试罘用大剂量地塞米松(DM)治疗因用MP冲击治疗未能逆转的移植肾急性排斥,效果满意从年月至年月我院共行同种异体尸肾移植调,以DM治疗应用MP无效的急性排斥反应例,其中男性例,女性倒年龄岁按我院常规术前日晚和术日晨分别服硫唑嘌呤(A朋)mg,术中静咏滴注MPOg,术后头天每天静脉滴注MPg环磷酰胺g,天后用环孢素A,硫唑嘌畸及泼尼松三联抗排斥治疗急性排斥诊断是根据临床表现,体征,实验室检查及彩色多普勒超声等结果综合判断急性排斥反应发生时间,例在术后个月内,个月之后者例DM应用方法:先以MP冲击治疗,排斥反应未能逆转的患者改用DM,rng加人生理盐水rrd内静脉滴注,连续,天治疗期间环孢素A(csA)减量,泼尼松(ered)停用,Aza用量不变停用DM治疗后,恢复原三作者单位:(~J重庆第三军医l^学第附属医院苗屎外科联抗排斥治疗,并根据血中CsA浓度各值调整C用量调患者经DM冲击治疗后,有例完全逆转,逆转率,肾功能恢复正常例应用DM亦无效肾功能呈进行性损害,放弃治疗移植肾功能丧失,恢复透析治疗另倒因血压升高致脑血管意外而死亡主要并发症为感染,例中有例发生感染,其中泌尿系统真菌感染倒口腔真菌感染例,肺部感染例,例均在抗感染,对症处理及支持疗法治疗后,感染得到控制其余病例未发生严重并发症:肾移植后的急性排斥反应是影响肾移植成功率和长期带肾存活率的主要原因,尽管C等应用于临床以来,急性排斥反应发生率明显下降,但在术后头个月内的发生率仍在O左右急性排斥反应的治疗一般MP冲击治疗如用MP治疗无效可用ATG治疗,但其价格昂贵,临床应用受到很大限制,使许多患者因经济困难而失去了治疗的机会:我们近年来尝试采用大剂量DM治疗MP冲击治疗无效的急性排斥反应排斥反应逆转率达,效果较好,使许多用MP冲击治疗无效,而又无经济能力应用ATG等其它免疫抑制剂的患者获得了治疗的机会实验资料表明,I)M能够降低白细胞介素(IL一)mRNA的稳定性,抑制白细胞升素(IL一)等细胞因子的表达,这种作用呈现剂量依赖性小剂量DM短篇报道R(,抑制静止淋巴细胞活化而大剂量则能够抑制被激活的免疫活性细胞表达细胞因子采用大剂量DM可能是抑制了已被异体抗原(移植肾)激活的淋巴细胞表达细胞因子阻断免疫反应过程,从而逆转移植肾急性排斥反应Hran等发现糖皮质激素对淋巴细胞增殖的抑制作用存在个体差异,有些个体对一种糖皮质激素敏感,而对另种则可能耐受Purhalsky等观察到个体间对DM抑制淋巴细胞增殖呈现三种情况:()敏感()不敏感()处于前二者之间的中问状态本组病调在应用MP无效后改用DM治疗,大部分病例急性排斥反应逆转这可能与不同个体对MP和DM具有不弼的敏感性有关关于个体问对糖皮质激素在抑制淋巴细胞增殖方面的差异性,其机制尚不清楚,是否与靶细胞的糖皮质激素受体存在个体差异有关,还有待进一步研究近年研究资料表明DM能够诱导免疫细胞的凋亡,这是否与DM能够逆转酎MP的急性排斥反应有关,尚待证实:奉组病例结果表明,DM可用于治疗以MP冲击未能逆转的移植肾急性排斥,且DM价格低廉特别适用于那些经济较困难的患者必须指出的是,在应用大剂量DM治疗耐MP的急性排斥时应密切观察病情变化,防止发生感染,水及电解质紊乱等严重并发症(收稿:一l,修回:)

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