日本血吸虫Sj31核酸疫苗联合IFN_重组质粒诱导小鼠保护性免疫的研究_cropped

日本血吸虫Sj31核酸疫苗联合IFN_重组质粒诱导小鼠保护性免疫的研究_cropped [ 论著 ] γ日本血吸虫 Sj31 核酸疫苗联合 IFN2重组质粒 ? 诱导小鼠保护性免疫的研究 陈欲晓 ,易新元 ,曾宪芳 ,唐连飞 ,王林纤 ,蔡春 ,袁仕善 γ摘要 :目的 探讨干扰素2重组质粒对日本血吸虫组织蛋白酶 B 核酸疫苗在小鼠抗血吸虫作用的影响 。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 γγ将小鼠干扰素2基因 PCR 扩增片段克隆入真核 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体 pCDNA311 以构建重组真核表达质粒 pCDNA3112IFN2,并 与日本血吸虫组织蛋白酶 B 真核表达质粒 VR10122Sj31 一同免疫小鼠 。小鼠分为 4 组 ,其中实验组 每 鼠 同 时 肌 注 μμμγγVR10122Sj31 及 pCDNA3112IFN2各 100g ,3 个对照组分别为 VR10122Sj31 肌注 100g ,pCDNA3112IFN2肌注 100g 和载 μ 体 VR1012 及 pCHAN311 肌注各 100g 。共免疫 3 次 ,每次间隔 2 周 。于末次免疫后两周免疫组化 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 表达质粒在小鼠肌细胞的表达 ,于末次免疫后 3 周经小鼠皮肤攻击感染 40 ?1 条日本血吸虫尾蚴 。45d 后杀小鼠计算减虫率 。 结果 γγVR10122Sj31 及 pCDNA3112IFN2均在小鼠肌细胞表达 ,日本血吸虫 Sj31 核酸疫苗联合 IFN2重组质粒免疫可诱导小 鼠 ( ) γ产生 27137 %的减虫率 ,与日本血吸虫 Sj31 核酸疫苗单独免疫组比较减虫率显著 P < 0105。 结论 IFN2表达 质粒能增强日本血吸虫组织蛋白酸 B 核酸疫苗的抗日本血吸虫的作用 。 γ关键词 :日本血吸虫 ;核酸疫苗 ;组织蛋白酶 B ;干扰素2 () 文献标识码 :A中图分类号 : R532121 文章编号 :1009 - 9727 200403 - 0307 - 03 Protective immunity to Schistosoma japonicum elicited by co2immunization of cathepsin B D NA vaccine with eukaryotic (γ plasmid encoding IFN2in mice1CHEN Yu2xiao , YI Xin2yuan ,ZHNG Xian2fang ,et al1 Department of Immunology ,Xiangya Medi2 )cal College ,Central South University ,Changsha 410078 , Hunan ,P. R. China . γAbstract :Objective To explore the effect of recombinant plasmid encoding IFN2on the action of cathepsin B DNA vaccine a2 ( ) γ gainst Schistosoma japonicum Sjin mice1 Methods PCR amplified DNA fragment of murine IFN2was cloned into eukaryotic γ expression vector pCDNA311 to construct recombinant expression plasmid pCDNA3112IFN2that was used to immunize mice with μcathepsin B DNA vaccine VR1012 - Sj311Mice divided into 4 groups were intramuscularly injected 100g of each VR1012 - Sj31 γ and pCDNA3112IFN2for the test group ,while for the 3 control groups mice were injected respectively the same dosage of VR1012 - γ Sj31 alone ,pCDNA3112IFN2alone and each of the 2 vectors1All mice were immunized 3 times with 2 weeks interval1The expression of the target gene in the quadriceps femoris was determined with Immunohistochemistry at 2 weeks after the last immunization ,while mice were percutaneously challenged with 40 ?1 Schistosoma japonicun cercariae 3 weeks after the last immunization1All the mice γ were sacrificed 45 days later and the worms recovered were counted1 Results Both VR1012 - Sj31 and pCDNA3112IFN2were γ expressed in muscular cells of the immunized mice1Co2immunization of cathepsin B DNA vaccine with plasmid encoding mIFN2 ( ) elicited 27137 % of worm reduction rate ,showing significant difference P < 0105as compared with that of cathepsin B DNA vaccine control1 Conclusion Partial protecive immunity against Schistosoma japonicum induced by cathepsin B DNA vaccine of Schistoso2 γ ma japonicum can be enhanced by co2immunization with plasimid encoding IFN21 γ Key words : Schistosoma japonicum ;DNA vaccine ; Cathepsin B ; IFN2 γ核酸疫苗被视为第三次疫苗革命 ,并以其造价低IFN2作为主要的 Th1 型细胞因子发挥细胞介导的免 5 廉 ,易于制备和纯化 ,其化学和生物学性状稳定 ,作用 疫应答 ,促进抗感染免疫。 基于核酸疫苗的优点及 1 持续时间长等优势而备受关注。 日本血吸虫组织蛋白酶 B 抗原潜在的免疫保护价值 ,本研究构建了小鼠干扰素2 日本血吸虫感染宿主后 ,通过其组织蛋白酶来降 2 γ(γ) 解宿主的血红蛋白 ,这是其摄取营养的途径。研究 的真核表达质粒 pCDNA2IFN2,并联合日本血吸虫 ( ) 组织 蛋 白 酶 B DNA 疫 苗 VR10122Sj31 一 同 免 疫 小 表明日本血吸虫组织蛋白酶 B 抗原可诱导小鼠产生 3 4 γ 保护性免疫。易新元等成功构建了日本血吸 虫 鼠 ,旨在观察 pCDNA2IFN2对日本血吸虫组织蛋白酶 组织蛋白酶 B 真核表达质粒 ,经小鼠肌肉注射免疫获 B DNA 疫苗的减虫效果的影响 。 得 5913 %,6910 %的肝组织减卵率 , 5716 %, 6211 % 1 材料与方法 γ 的肠组织减卵率 ,显示其高度的抗血吸虫生殖作用 ,111 主要材料及动物 E1 coli ER2502 、小鼠 IFN2原 核质粒 、pCDNA311 真核表达载体 、日本血吸虫组织蛋 但其减虫效果不理想 。研究显示在血吸虫病免疫中 , ? (()) 基金项目 : WHO/ TDR 资助课题 No1980268;湖南省科委资助课题 00jzy2115 作者单位 :中南大学湘雅医学院免疫学教研室 ,湖南 长沙 4100781 作者简介 :陈欲晓 ,女 ,博士 1 毕业于中南大学湘雅医学院 ,副教授 ,主攻抗感染和免疫 1 () 4 组小鼠切片均设立与 PBS ,与正常小鼠进行 。另外 白酶 B 重组真核表达质粒 VR10122Sj31均为本室保 β 存 。B am H ?和 Xho ?、TDNA 连接酶 、2Agarase ?、血清反应的阴性对照 。4 2 结果dNTP 为 New England Biolabs 公司产品 。6 周雌性昆明 211 重组质粒的鉴定 抽取阳性重组菌质粒经 B am小鼠由中南大学湘雅医学动物学部提供 。 H ?和 Xho ?双酶切后 ,检测到插入子 ,其大小约为112 构建真核表达质粒及测序 根据已知小鼠 IFN2 γ470bp ,与 IFN2基因的理论值一致 。抽提重组菌质粒 γ() 基因序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物 New England Biolabs 合成扩增 为模板进行 PCR ,扩增片段大小也与酶切后插入子段 γγIFN2, 用 以 构 建 真 核 表 达 质 粒 pCDNA3112IFN2。正 () γ大小相符 图 1。测序结果采用 Blast 与 IFN2基因进 引物 5’CGCGGATCCATGAACGCTACACACTGCATC3’含 γ 行核苷酸序列同源性比较显示与 GenBank 已知 IFN2B am H ?酶 切 位 点 , 反 引 物 5 ’CCGCTCGAGTCAGC () 基因序列吻合 图 2。 AGCGACTCCTTTTCCC3’含 Xho ?酶 切 位 点 。扩 增 参 数为 94 ?4min 后 ,94 ?45s ,62 ?45s ,72 ?1min ,共 30 个循环 , 最 后 72 ?延 伸 7min 。分 别 用 限 制 性 内 切 酶 B am H ?和 Xho ?对纯化的 PCR 产物和真核表达载 () 体 pCDNA311 双酶切 37 ?,2h,经低溶点胶电泳后回 β收 DNA ,用2Agarase ?消化琼脂糖后 , TDNA 连接酶 4 () 连接 16 ?过夜,将重组子转化入感受态 ER2502 中 。 提取阳性重组菌质粒 DNA , B am H ?和 Xho ?双酶切 检测插入子的大小 、PCR 鉴定并测序 。 图 1 重组表达质粒的鉴定 113 质粒 的 大 量 制 备 用 碱 裂 解 法 大 量 制 备 pCD2 Fig11 Identification of the recombinant expression plasmid γNA311 、VR1012 、pCDNA3112IFN2和 VR10122Sj31 ,最终 γ M :DNA marder ;Lane 1 : pCDNA2IFN2recombinant plasmid di2 溶于无菌生理盐水 ,致终浓度为 1mg/ ml 或 2mg/ ml ,臵gested with B am H ?/ Xho ?;Lane 2 :pCDNA311 vector digested - 20 ?备用 。γ with B am H ?; Lane 3 : pCDNA2IFN2recombinant plasmid di2 4 组 ,每组动物随机分为 114 动物免疫和攻击感染 gested with B am H ?;Lane 4 : PCR Product of recombinant plas2 μ股四头肌注射 1 种或 2 种 DNA , 每种 100g/ 只 , 共免 mid γ 疫 3 次 。A 组为试验组注射 pCDNA2IFN2加 VR10122TGGGCCTCTGNATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGC CCTTCGCGGATCCA TGAACGCTACACACTGCATCTTGGCTTTGCAGCTCTTCCTCATGG Sj31 ,B 组为 VR1012 - Sj31 DNA 疫苗对照组 , C 组为 CTGTTTCTGGCTGTTACTGCCACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAA γ pCDNA2IFN2重 组 DNA 对 照 组 , D 组 为 VR1012 加 CTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGA GGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAGATTATCTCTTTCTA pCDNA311 空载体 对 照 组 。于 免 疫 前 1d 每 鼠 股 四 头 CCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTC μ肌注射 015mg/ ml 盐酸布比卡因 50l ,末次免疫后 2 周 ATTGAATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCAT TCATGAGTAATTGCCAAGTTTGAGGTCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAA 剖杀每组小鼠 2 只 , 取注射部位股四头肌切片做 HE TGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTCGCCGGAATCCAGCCTCAGGAAGCGGAA 染色和免疫酶组织化学鉴定 DNA 在小鼠肌细胞的表 AAGGAGTCGCTGC TGACTCGA GCGGAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTA 达 。每组剩余小鼠继续实验 ,于末次免疫后 3 周经皮 CTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGNTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCCTCACAATNCCCCCAACATACNAGCCGGAAGCATAAAGNGTA () 肤攻击感染日本血吸虫尾蚴 40 ?1条 ,感染后 6 周剖 AAGCCTGGGGGGNCCTAATGAGNGANCTAACTCCCATTNATTGNGTTGGGCTCACTGN 杀小鼠冲虫 ,计算减虫率 。各组间均数比较使用 SPSS CCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTNG γ图 2 重组质粒 pCDNA3112IFN2核苷酸序列测序结果 统计软件进行 ANOVA 分 析 , P < 0105 表 示 差 异 显 著 γ 斜体 部 分 为 IFN2基 因 的 起 始 和 中 止 密 码 子 , 划 线 部 分 为 性 。 B am H ?和 Xho ?酶切位点 115 酶免疫组织化学方法 取 A 、B 、C 、D 4 组小鼠免 γ Fig12 The nucleotides of recombinant plasmid pCDNA2IFN2by se2疫注射用部位的股四头肌石蜡切片进行酶免疫组织 quencing γ Initiation and termination codons of IFN2gene are italic while diges2γ 化学染色 ,其中 A 组小鼠切片分别与 IFN2单克隆抗 tion sites of B am H ? and Xho ? are undelined 体和组织蛋白酶 B 小鼠抗血清作用 ,B 组小鼠切片与 组织蛋白酶 B 小鼠抗血清作用 ,C 组小鼠切片与 IFN2 212 免疫组织化学鉴定 A 、B 、C 、D 4 组小鼠股四头 γγ 单克隆抗体作用 ,D 组小鼠切片分别与 IFN2单克 肌组织切片 HE 染色显示组织切片部位正确 ,组织结 隆抗体和组织蛋白酶 B 小鼠抗血清作用 。日本血吸 构清晰 。酶免疫组织化学结果可见小鼠 A 、B 、C 3 组 ( ) 虫组织蛋白酶 B 小鼠 抗 血 清 1 ?100 稀 释由 本 室 制 均有特异性深棕色染色颗粒 ,圆形或卵圆形存在于肌 () γ备 , IFN2单克降抗体 1?50 稀释为 Pharmingen 产品 , 细胞的胞浆及胞膜上 ,大小不等 ,肌细胞核呈蓝色 。D ) (HRP 标记羊抗鼠 IgG1?2 000 稀释为 New England Bi2 组空载体对照 、PBS 阴性对照 、正常小鼠血清阴性对照 () olabs 产品 ,其次试剂为 MB I 产品 。具体操作按说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 均未见深棕色产物 图 3。 3 23 ,多种日本血吸虫抗原的质粒 DNA 鸡尾酒疫苗肌 肉注射免疫 3 次后 ,诱导小鼠产生 34 %,45 %的抗攻 击感染力 ,此时小鼠脾细胞体外实验表现为 Th1 型细 γ胞免疫 ,脾细胞产生 IFN2增加 。 γ鉴于 IFN2在血吸虫病免疫中的重要作用和核酸 γ 疫苗方法的独特优点 ,本研究将小鼠干扰素2cDNA 克 γ隆至真核表达载体 pCDNA311 中 ,获得小鼠干扰素2基 () (γ图 3 小鼠肌组织免疫组织化学染色因的真核表达重组质粒 pCDNA2IFN2,并联合 干扰素 γ1 空载体对照组的表达 ;2 pCDNA3112IFN2; γ) γ 2,并联合干扰素2的真核表达质粒和日本血吸虫组 3 VR10122Sj31 的表达 织蛋白酶 B DNA 疫苗一同免疫小鼠 。结果显示两种质 Fig13 Murine muscular tissue stained by immunohistochemistry γ1 Vacant vector control ;2 The expression of pCDNA3112IFN2; 粒均在小鼠肌肉细胞中表达 ,并且日本血吸虫组织蛋白 3 The expression of VR10122Sj31 γ 酶 B DNA 疫苗与 pcDNA2IFN2联合免疫能诱导小鼠 213 免疫保护性效果 攻击感染日本血吸虫尾蚴后27137 %减虫率 ,与日本血吸虫组织蛋白酶 B DNA 疫苗 6 周剖杀小鼠冲虫 ,计算减虫率 。结果 A 组减虫率为 ( ( ) ) 单独 免 疫 12129 %比 较 , 减 虫 显 著 P < 0105, 表 明 ( ) 27137 % ,与 B 、C 、D 3 个对照比较减虫显著 P < 0105γIFN2表达质粒 DNA 免疫具有增强日本血吸虫组织蛋 () 表 1。 白酸 B DNA 疫苗效果的佐剂作用 。进一步研究将动态 γ表 1 重组 IFN2表达质粒对组织蛋白酶 B 核酸疫苗 观察小鼠免疫前后 、感染过程中细胞因子水平变化 ,为 诱导的小鼠减虫率的影响 γ今后研究干扰素2表达质粒对日本血吸虫组织蛋白酶 γ Table 1 Action of recombinant IFN2expression pasmid on worm reduction rate elicited by cathep sin B DNA vaccine in mice B DNA 疫苗的作用机制提供参考依据 。 平均检获虫数 减虫率 Worms 组别小鼠数 Worm reduction 参考文献 : recovered )( rates Groups Mice n ( ) 1 Prugnaud JL1DNA vaccinesB J 1Ann Pharm FR , 2003 , 61 4 : 219 , ( )vs D % ( )x ?s 23311 VR10122Sj31 + 2 pCD3 27137 % 8 ()γNA2IFN2A 188 ?5133 222 Brindley PJ , Kalina BH , Dalton J P , et al 1Proteolytic degradation of host ()#hemoglobin by schistosomesJ 1Mol Biochem Parasito ,1997 ,89 :1,91 VR10122Sj31 B 12129 % 8 27163 ?4169 3 陈炎 ,易新元 ,曾宪芳 , 等 1 日本血吸虫 31/ 32kDa 抗原诱导小鼠产 γ( )6 pCDNA2IFN - C 3011323183 4140 % ( ) 抗卵免疫的初步研究J 1 中国血吸虫病防治杂志 ,1995 ,7 2:72,() VR1012 + pCDNA D7 31150 ?3186 3 # 751 注 : 为 P < 0105 vs B ,C ,D ; 为 P > 0105 vs C ,D 4 易新元 ,曾宪忠 ,曾宪芳 , 等 1 日本血吸虫组织蛋白酶 B DNA 疫苗 3 讨论 研究显示核酸疫苗能够诱导宿主产生抗日() 抗生殖免疫的研究J 1 中国人兽共患病杂志 ,2000 ,16 1:45,471 本血 5 Mosmann TR ,Sad S 1The expanding universe of T2cell subsets : Th1 ,Th2 and () more J 1Immunol Today ,1996 ,17 3:138,1461 6 ,7 吸虫免疫 ,不失为日本血吸虫疫苗的新途径。Li C 6 Verity CK , McManus DP , Brindley PJ , Vaccine efficacy of recombinant 8等 用 Sj32 全长 cDNA 肌肉注射免疫小鼠获 5517 % cathepsin D aspartic protease from Schistosoma japonicum J 1Parasite Im2 9 减卵率 。Shi Y 等用 pcD2Sj32 免 疫 小 鼠 获 56101 % () muno ,2001 ,23 3:153,1621 减卵率及 38130 %减虫率 。 7 Verity CK , McManus DP , Brindley PJ , Cellular responses to Schistosoma japonicum cathepsin D aspartic protease J 1Parasite Immunol , 2002 , 24 DNA 疫苗研究表明细胞因子佐剂能增强核酸疫 () 7:363,3671 γ 苗的抗血吸虫免疫 , IFN2作为主要的 Th1 型细胞因 8 Li C and Shi Y 1Observation on the effect of Sj32 DNA vaccine of Schistoso2 10 子在抗血吸虫感染免疫中作用重大 。冯新港等以 ma japonicumJ 1Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing () Za Zhi ,1999 ,17 2:70,731pcD2IL22 真核表达重组质粒作为佐剂对日本血吸虫脂 9 Shi Y ,Xie L ,Li C ,et al 1DNA vaccine pCD2Sj32 and its efficacy of protec2 () 肪酸结合蛋白的基因真核表达质粒 pcD2Sj FABPc的 tive immunity against infection of Schistosoma japonicum J 1Chin Med J DNA 疫苗的保护性免疫作用进行研究 ,结果佐剂 pcD2 ( ) () Engl,1999 ,112 8:667,6801 γ IL22 能增强体外 NK 细胞的杀伤性 、提高血清 IL2水 10 冯新港 ,余新炳 ,吴忠道 ,等 1 从 pcD2IL22 为基因佐剂的含日本血 吸虫 SjFABPc 基因克隆直接表达重组质粒裸 DNA 免疫小鼠的研究 平及 PCD2Sj FABPc 的 DNA 疫苗的保护性免疫 。Dupre 11() J 1 中国人兽共患病杂志 ,12001 ,17 6:7,101( ) L 等 用 IL218 编码质粒与曼氏血吸虫 Sm 28 GST 编 11 Dupre L , Kremer L ,Wolowczuk I ,et al 1Immunostimulatory effect of IL2182 码质粒一同注射时 ,观察到 BALB/ C 小鼠脾细胞的特 encoding plasmid in DNA vaccination against murine Schistosoma mansoni γ异性 IFN2产生增加 ,为单独 Sm 28 GST 编码质粒免疫 infectionJ 1Vaccine ,2001 ,19 :3606,36101 12 Zhou S ,Liu S ,Song G ,et al 1Protective immunity induced by the full2length 小鼠的 30 倍 ,并诱导出 28 %的减卵率和 23 %的减虫 cDNA encoding paramyosin of Chinese Schistosoma japonicum J 1Vaccine , 12 率 。Zhou S 等用日本血吸虫中国株的副肌球蛋白 () 2000 ,15 ,18 27:3196,32041 () 全长 cDNA pCMV - Sjc97免疫小鼠获得显著的抗血 13 Zhang Y ,Tayor MG ,Johansen MV ,et al 1Vaccination of mice with a cock2 γ吸虫的保护性免疫 ,并诱导了 Th1 型细胞因子 IFN2、 tail DNA vaccine induces a Th12type immune response and partial protection against Schistosoma japonicum infectionJ 1Vaccine ,2001 ,20 :724,7301 13 IL22 的产生 。Zhang Y 等用 Sj62 , Sj28 , Sj23 和 Sj4 2 收稿日期 :2003 - 12 - 05