【doc】溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应

【doc】溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应 溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应 第28卷第10期 Vo1.28No.10 催化 ChineseJournalofCatalysis 2007年l0月 October2007 文章编号:0253—9837(2007)10-0915-04 溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应 研究 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 :915,918 于瑶一,靳艳,吴佩春,张卫 (1中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023;2中国科学院研究生院,北京100049) 摘要:研究了分离自珊瑚藻(CorallinofJicinalis)的溴过氧化物酶在水一有机两相体系中催化环己烯环氧化的反应.考察了氧 化剂种类与添加方式,pH,反应温度,酶浓度及KBr浓度等条件对环氧化反应的影响.最佳反应条件为:反应温度55?,在 含有50mmo1/LKHr和32u/ml溴过氧化物酶的pH6.0的Tris—HC1缓冲液中,每隔10min补加50l的2.29mol/LHaO2. 在此反应条件下,环氧环己烷的收率达到41.5%,选择性为82.2%. 关键词:溴过氧化物酶;环己烯;环氧化;l,2一环氧环己烷 中图分类号:0643文献标识码:A EpoxidationofCyelohexeneCatalyzedbytheVanadium BromoperoxidasefromCorallinaofficinalis YUYao一,JINYan,WUPeichun,ZHANGWei (1DalianInstituteofChemicalPhysics,TheChineseAcademyofSciences,Dalian116023,L iaoning,China; 2GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China) Abstract:TheepoxidationofcyclohexenecatalyzedbyavanadiumbromoperoxidasefromtheredalgaeCoralli— nao厂cinalishasbeeninvestigated.Thereactionwasperformedinawater— organicsolventbiphasicsystem. Theeffectsofoxidantsandtheirloadingmethod,pH,temperature,andtheconcentrationofvanadiumbro— moperoxidaseandKBrontheepoxidationwerestudied.Theoptimalconditionswereasfollows:thereaction temperaturewas55?,and50lof2.29mol/LH2O,wasaddedevery10mintotheTris— HClbufferatpH 6.0containing50mmol/LofKBrand32U/mloftheenzyme(finalconcentration).Undertheseconditions, themaximumepoxycyclohexaneyieldandselectivitywere41.5%and82.2%.respectively. Keywords:bromoperoxidase;cyclohexene;epoxidation;epoxycyclohexane 1,2一环氧环己烷(ECH)是一种非常重要的精细 化工原料,用于制备农药克螨特,光敏涂料,染料和 医药等,也是很好的环氧树脂稀释剂.目前,工业应 用的烯烃环氧化合成环氧化合物的方法主要有氯醇 法和Halcon法.在氯醇法中,合成反应会产生大量 含CaC1,及各种有机氯化物的废水,造成严重的环 境污染,而且设备腐蚀严重;Halcon法工艺流程太 长,投资大,对原料质量要求较高,操作条件严格,且 联产品多?.2J.故这两种生产方法均不能满足可持 续发展的要求.随着人们对环保的日益重视及对环 氧化产品需求的不断增加,发展工艺简单,污染小的 绿色环氧化合物合成新工艺显得更为迫切. 生物催化以其催化效率高,高度专一性,反应条 件温和及无环境污染等优点受到了有机化学家和生 物学家的高度重视.应用于烯烃环氧化的酶主要有 氯过氧化物酶(chloroperoxidase)和单加氧酶 (monooxygenase)j.氯过氧化物酶热稳定性差,且 易受体系中H2O2的作用而失活l3;单加氧酶催化 反应需要辅酶NADHl4J,辅酶回收与重复利用等问 题使经济性成为单加氧酶大规模应用的关键问题. 收稿日期:2007—04—10.第一作者:于瑶,女,1982年生,硕士研究生 联系人:张卫Tel:(0411)84379316;Fax:(0411)84379069;E— mail:weizhang@dicp.ac.cn. 基金来源:国家重点基础研究发展计划(973计划,2003CB716001);中国科学院知识 创新工程重要方向项目(KZCX2一Yw一209) 916催化第28卷 以钒为辅基的溴过氧化物酶(vanadiumbromoperox— idase,V—BPO)是海藻中含量比较丰富的一类卤素 过氧化物酶,该酶主要作用于海洋生物体内卤代天 然产物的形成过程[.V—BPO具有良好的热稳定 性及良好的对丙酮和甲醇等有机溶剂的耐受性_6J, 可以催化多种有机底物的溴化反应_7J以及有机硫 化物的氧化反应_8J,但未见其应用于烯烃环氧化的 报道. 本文以从大连海域的珊瑚藻(Corallinaoffici— nalis)中提取的V—BPO为催化剂,首次建立了水一有 机两相反应体系中V—BPO催化H()2与环己烯环 氧化反应生成环氧环己烷的新体系,并对其进行了 初步研究,对其催化机理进行了初步讨论. 1实验部分 1.1酶的制备 将采集自大连海域的珊瑚藻用去离子水清洗, 匀浆破碎,低温离心后,上清粗提液进行硫酸铵沉 淀.取30%,60%饱和度的蛋白质沉淀,以50 mmol/LpH8.3的Tris(Amresco公司)缓冲液重新 溶解,经过两次阴离子交换树脂DE一52层析柱纯化 后,冷冻干燥浓缩,得到初步纯化的溴过氧化物酶. 1.2酶催化反应 在20ml的单口圆底烧瓶中依次加入一定量的 KBr,V—BPO溶液,50mmol/LpH6.0的Tris缓冲 液和环己烯19.6mmol,使体系总体积为10m1,在 圆底烧瓶上加冷凝回流装置,使用恒温水浴加热保 持体系的温度,用磁力搅拌子在固定转速下搅拌. 以加入一定量H2O作为反应开始,以后每隔一定 时间加入一定量的Ho至反应结束. 取反应结束后的有机相,加入少量无水NaSO 吸收水分后,用GC—MS法(Agilent6890型气相色 谱仪,HP一5毛细管柱,30m×0.32mm×0.25"m, Agilent5973型质谱仪)检测反应产物.采用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲 线法(美国SRI8610型色谱仪,SE一54毛细管柱, 30m×0.25mm×0.5/am,FID检测器)对ECH定 量,ECH标准品(色谱纯)购于Sigma公司.检测条 件:柱温80?,保持20min,再以10oC/min的速 率升温至230?,保持5min,进样口与检测器温 度均为240?. 反应的收率和选择性分别定义为:收率= (ECH生成量/H2O2用量)×100%,选择性= (ECH峰面积/总产物峰面积)×100%. 1.3V.BPO活性测定 V—BPO活性测定参照文献[9]中的方法,以单 氯双甲酮(monochlorodimedone,购于Sigma公司, e..=19900L/(mol?cm))为底物,在单氯双甲酮, KBr和H2()2浓度分别为50~mol/L,100mmol/L 和2mmol/L的体系中进行溴化反应,用V一530型 紫外/可见分光光度计(日本JASCO公司)测定体系 在290nm处吸光值的变化,以每分钟消耗1#mol 单氯双甲酮所需的酶量定义为一个酶活力单位 (U). 2结果与讨论 2.1氧化剂与加入方式的影响 分别以H2O2和叔丁基过氧化氢(TBHP)作为 氧化剂进行环己烯环氧化反应,结果见表1.可以看 出,在相同的氧化剂浓度和加入方式下,V—BPO可 催化H2O2氧化环己烯生成ECH,而无法催化 TBHP氧化环己烯.其原因可能是TBHP的分子体 积比H2O2大,而V—BPO活性中心的钒位于漏斗形 底物通道(约1.5,2.0nm)的底端[如.11],TBHP由 于空间位阻效应而不能达到活性位点,反应无法进 行.因此,本研究选择HO作为氧化剂. 表1不同氧化剂及其加入方式对环己烯环氧化反应收率的影响 Table1Effectofoxidantsonepoxycyclohexane(ECH)yieldfor epoxidationofcyclohexenecatalyzedbyvanadiumbro moperoxidase(VBPO) Reactionconditions:V—BPO10U/ml,cyclohexene19.6 mmol,KBr50mmol/L,temperature50?,pH6.0,reac— tiontime6h. TBHP:t-butylhydroperoxide. 为避免体系中H2O浓度过高而抑制酶的活 性,本研究采用间歇补充的方式加入HO.结果表 明,每隔10min向反应体系中补加一次H,O,,每次 补加501,ECH的收率可达30.5%,说明反应体 系中HO2的浓度适量. 2.2温度的影响 考察了不同温度下V—BPO催化环己烯环氧化 收率和选择性的变化,结果见图1.温度较低时, ECH的收率随着温度升高而增大,在50和55?时 第10期于瑶等:溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应917 收率分别达到30.5%和31.0%,说明V—BPO在较 高的温度下能发挥更高的催化活性;温度高于55 ?时,因为酶的失活和H2O2的分解,收率随温度升 高而减小.ECH的选择性在80%左右波动.综上 所述,确定体系的最适温度范围为50,55?.反应 后酶活力测定结果表明,V—BPO具有良好的热稳 定性,温度低于55?时,反应后剩余酶活力高于 62%.将55?条件下反应后的V—BPO与有机相分 离,在相同条件下考察了游离V—BPO再次使用的情 况.经过两次反应后,ECH的收率为20.4%,酶活 力剩余18%. 邑 三l :三 Z U 图1反应温度对环己烯环氧化反应收率和选择性的影响 Fig1EffectofreactiontemperatureonECHyiddandselectivky (Reactionconditions:V—BPO10U/ml,cyclohexene19.6mmol, KBr50mmol/L,pH6.0,adding50lof2.29mol/L H2O2every10min,reactiontime6h.) 2.3pH的影响 研究了pH对环氧化反应的影响,结果见图2. pH小于6.0时,ECH的收率随pH增大而增大,在 pH为6.0时ECH收率达到最大值.pH大于6.0 后收率下降.在pH大于5.0后,体系pH对反应选 择性的影响很小.最佳pH为6.0. 2.4酶浓度的影响 研究了体系中的酶浓度对反应收率和选择性的 影响,结果见图3.ECH的收率随着酶浓度的增加 而增大,当酶浓度大于10U/ml时ECH收率增加 趋于平缓.酶浓度的变化对反应选择性影响不大. 在酶促反应中,当底物浓度足够大,足以使酶饱和 时,反应速度与酶浓度成正比.在本研究中,酶浓度 大于10U/ml后,KBr的浓度仍保持在50mmol/ L,其浓度不足,成为反应速度的主要限制因素,所 以反应收率并没有随酶浓度的增加而明显增加.综 一 ; U 图2pH对环己烯环氧化反应收率和选择性的影响 Fig2EffectofpHonECHyieldandselectivity (Reactionconditions:V—BPO10U/ml,cyclohexene19.6mmol, KBr50mmol/L,temperature55?,adding50"lof2.29mol/L H202every10min,reactiontime6h.) 一 三l .; 8 ? U 图3V.BPO浓度对环己烯环氧化反应收率和选择性的影响 Fig3EffectofV—BPOconcentrationonECHyieldandselectivity (Reactionconditions:cyclohexene19.6mmol,KBr50mmol/L, temperature55?,pH6.0,adding50lof2.29mol/L H202every10min,reactiontime6h.) 合考虑收率与经济效益两方面因素,确定最适酶浓 度为10U/m1. 2.5KBr浓度的影响 考察了KBr浓度对反应的影响,结果见图4. 反应收率随KBr浓度的增加而增大.当KBr的浓 度低于10mmol/L时,体系中未检测到ECH;当 KBr浓度由10rnrnol/L增大到50mmol/L时,ECH 收率与KBr浓度几乎成正比;当KBr浓度为50 mmol/L时,ECH收率达到了31.0%.KBr浓度继 续增加时ECH收率没有明显的增加,原因可能是 KBr浓度大于50mmol/L后,在实验条件下已使v, BPO达到饱和,在V—BPO浓度不变的条件下,仅增 918催化第28卷 加KBr的浓度并不能使ECH收率增加?因此,最适3结论 KBr浓度为50mmol/L. 图4KBr浓度对环己烯环氧化反应收率和选择性的影响 Fig4EffectoftheKBrconcentrationonECHyieldandselectivity (Reactionconditions:V—BPO10U/ml,cyclohexene19.6mmol, temperature55?,pH6.0,adding50lof2.29mol/L H2O2every10min,reactiontime6h.) 2.6V.BPO催化环己烯环氧化反应机理探讨 V—BPO催化环己烯反应的主要产物是环氧环 己烷,2一溴环己醇和1,2一二溴环己烷.KBr浓度对 反应的影响结果(见图4)证明,KBr是V—BPO催化 环己烯环氧化反应所必须的,这与V—BPO催化有机 底物溴化相同.V—BPO催化有机底物溴化的反应 机理为l12]:在V—BPO的作用下,H2O2先与Br一作 用生成氧化态溴中间体,在合适的有机底物存在的 情况下,中间体与有机底物反应生成含溴有机物,或 与过量H202反应生成单线态氧o2及溴离子.o2 是激发态的氧,与有机物的反应能力很强,在有机合 成中具有很重要的作用l1,在生物过程中也是与 H2O2等过氧化物同样重要的氧化剂_1. 综上所述,在本实验体系中,V—BPO催化环己 烯环氧化的反应机理可能为:H202和Br一在溴过 氧化物酶的催化下生成酶与溴的复合物中间体,在 水相中,主要与H2o2反应生成o2并将有机相的 环己烯氧化为环氧环己烷,少量中间体直接与环己 烯反应生成溴代环己烷副产物. 水一有机两相中V—BPO催化H2O2氧化环己烯 生成环氧环己烷的反应体系,反应条件温和,游离 V—BPO的操作稳定性良好,可以再次利用.根据对 反应机理的讨论可推测反应过程仅消耗少量KBr 生成副产物,理论上可实现KBr循环利用.强化反 应过程和改善反应环境将有助于进一步提高反应效 率及实现V—BPO和KBr的循环利用.因此,溴过氧 化物酶催化环己烯环氧化体系具有工业应用潜能, 值得进一步开发研究. 参考文献 1吕绍洁,徐成华,陈义均,邱发礼.合成化学(LilshJ, XuChH,ChenYJ,QiuFL.ChinJSynthChem), 2000,8(1):71 2韩飞.精细石油化工(HanF.SpecPetrochem),1998, (5):1 3BernhardtR.JBiotechnol,2006,124(1):128 4PinheiroL,MarsaioliAJ.JMolCatalB,2007,44(2): 78 5ButlerA.CoordChernRev.1999,187(1):17 6SheffieldDJ,HarryT,SmithAJ,RogersLJ.Phyto— chemistry,1993,32(1):21 7MartinezJS,CarrollGL,Tschirret—GuthRA,AItenhoff G,LittleRD,ButlerA.JAmCheDzSoc,2001,123 (14):3289 8BurtonSG.TrendsBiotechnol,2003,21(12):543 9ButlerA,WalkerJV.ChemRev,1993,93(5):1937 10IsupovMN,DalbyAR,BrindleyAA,IzumiY,Tanabe T,MurshudovGN,LittlechildJA.JMolBiol,2000, 299(4):1035 l1MesserschmidtA.WeverR.ProcNatlAcadSciUSA. 1996,93(1):392 12SoedjakHS,ButlerA.Biochemistry,1990,29(34): 7974 13SchweitzerC,SchmidtR.emRev,2003,103(5): 1685 14KangP,FooteCS.JAmChemSoc,2002,124(17): 4865 (EdLYX)