大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测

大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测 生物物理学报 第十三卷 第三期一九九七年九月 ACTA BIO P HYS ICA S I NICA Vol . 13 No . 3 Se . 1997p * 大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测 * * 徐建华瞿安连 叶 琴康华光周 专 ( ) 华中理工大学生物物理与生物化学研究所 武汉 430074 摘要 报道以直径 7m 的碳纤丝制作碳纤电极 , 在原代培养的大鼠肾上腺单个嗜铬细胞上检测诱 μ 发的儿茶酚胺激素分泌 。当用微管向细胞吹加 10m mol / L 乙酰胆碱或 60m mol / L 氯化钾时 , 2 - 5s() 延迟后记录到数目不等的峰形信号 。峰信号上升快约 1m s; 衰减则较慢 ,呈指数形状 。峰信号的 ( ) 检测要求电极上所加氧化电压足够大 。实验表明 ,以高钾刺激时 , 该峰信号依赖于外钙 2m mol / L 的存在 。根据峰信号对应于嗜铬细胞内单个囊泡的儿茶酚胺量子化释放的事实 ,我们推算每次量子 - 20 - 18 化释放的儿茶酚胺约为 10 —10 mol 量级 。 关键词 : 嗜铬细胞胞吐碳纤电极电化学测量儿茶酚胺 递质与激素的分泌机制 ,是当前生理研究的重要内容。 在单个细胞水平上的分泌检测 ,可 为揭示递质 、激素的胞吐过程和分泌调控机制提供精确的数据 。80 年代中期 ,在膜片钳方法的 基础上发展了膜电容测量技术 ,通过跟踪分泌时囊泡膜与质膜相融合所引起的膜表面积增加 , 1 , 2 () () 监测囊泡的分泌过程 。但是 , 由于胞吐 e xoc si s与胞饮 e n doc si s过程可能同时发 totoyy 生 , 又都使膜表面积和膜电容变化 , 因此该技术测量的是胞吐和胞饮的综合效果 , 而不仅仅 () 是分泌信号 。 1991 年以来又发展了碳纤电极 ca r bo n f i be r elect ro de , C F E电化学检测技 术 , 通过迅速氧化单个细胞分泌的递质或激素分子 、产生氧化电流信号 , 可以直接测量细胞 3 分泌。利用 C F E 记录技术 ,Wi ht ma n 等首次直接地提供了激素或神经递质量子化释放的 g 3 化学证据。由于 C F E 记录的灵敏度高 ,尤其是可以实时检测细胞的单个囊泡释放 ,因而已迅 3 - 5 6 7 , 8 速发展为细胞分泌研究的重要手段 。现已应用于嗜铬细胞 、肥大细胞 、胰腺细胞 、 9 颈上神经节细胞等 。 10 我们自 1995 年始探索应用 C F E 技术研究嗜铬细胞分泌机制。本文报告以自制聚丙烯 C F E 对原代培养的大鼠肾上腺单个嗜铬细胞量子化分泌的检测结果 。 1 材料与方法 1. 1 动物 Wi st a r 纯系大鼠 , 每只体重 200 - 300 克 , 雌雄不拘 。湖北省卫生防病站提供 。 1. 2 主要试剂 胶原酶 I 、透明质酸酶 、DN a seI 和多聚赖氨酸为 Si 产品 , D M EM 、胎牛血清为ma g Gi bco 产品 ,其他试剂为国产分析纯 。 1. 3 细胞制备 、培养 11 的方法略作改进 。急性处死大鼠大鼠肾上腺嗜铬细胞的原代培养按 Neel 和 L i n le y g * * * 国家杰出青年基金和自然科学基金资助项目 。通讯联系人 。 (两只 , 取其两侧肾上腺 , 剪除被膜及皮质 , 将髓质剪成小块 , 在 5ml 酶液 含 15m胶原酶 I 、 g ) DN a se I中 37 ?消化约 50mi n 。细胞悬液再经离心收集 , 滴加在预12m 透明质酸酶 、1m g g 涂有多聚赖氨酸的盖玻片上 ,加 90 %D M EM 与 10 %胎牛血清培养基进行培养 。 1. 4 碳纤电极的制作ca r bo n f i be r elect ro de 9 按 Zho u 等方法略加改动 ,自制碳纤电A ( ) 极 。取聚丙烯材料的微量取液器吸头 20l μ () 国营青云仪器厂 ,北京,于中段局部加热熔 化 , 水平拉细 , 套入长约 1. 5c m 、直径 7m μ B ( ) 的碳纤丝 Co ur t al d , L t d . ,英国。再次加热 并拉细 , 在碳纤丝表面形成 聚 丙 烯 绝 缘 薄 E PC - 9 a mlif ie rp (层 。再从碳纤丝裸露处切断即成 如图 1A 所 KCl o r A Ch iet t epp ) KCl 。示。使用前 ,由后端注入 3mol / LPul se + Pul se C E F f it 7. 63 1. 5 单个细胞分泌的检测reff e re nce 取培养 2 - 5 天的嗜铬细胞 ,用胞外液Cell ( M Cl2 , ) 2. 8 , m mol / L : N a Cl 140 , KCl g2 Maci nto sh Q ua dra 650 Ill ust rat io n s of a ca r bo n f i bre elect ro de 50AFi. 1p g () A a n d set - ufo r mic roelect roc he mical det ec2 p 2. 5s A () t io n of e xoc to si s f ro m si n le cell s B. yg Ca Cl2 , H E P ES 10 , ml , H7. 22 葡萄糖 2mp / g 10m mol / L A Ch 12 冲洗 3 次后 , 装入内盛 500l 胞外液的测量皿 μ40Ap () 直径 35m m中 。考察无钙高钾刺激的效应时 ,胞2s 外液中不加钙 , 并加入 0. 2m mol / L E GTA 。实 验在 25 ?1 ?下进行 。 如图 1B 所示 , 分泌检测时 C F E 与细胞高度 ( ) 60m mol / L KCl 接近 1m 左右, 并由 E PC - 9 膜片钳放大器 μ ( ) H E KA Elect ro nic s , 德国在电压钳方式下对 15Ap B 电极持续施加 780mV 直流电压 。电极附近的细 20ms 胞膜区域分泌儿茶酚胺激素时 , 儿茶酚胺分子扩 散至电极裸露的端面 , 被电压氧化并产生安培电 5 流信号。电流信号经 E PC - 9 放大 ,增益范围在 5 或 10mV / A ,输出滤波频率一般取 1k Hz 。以()p A Fi. 2cat2 A mp e ro met ric reco r di n g s of g ec hola mi ne relea se f ro m si n lerat c h ro maf2 g ( PUL S E + PUL S E F I T 7. 63 软件 H E KA Elec2 f i n cell s w he n st i m ulat e d wi t h 10 locall y ) t ro nic s , 德国采样并存储 , 采样频率为 2k Hz 。 () m mol / L A Ch o r 60 m mol / L KCl . BA 为了诱发嗜铬细胞的分泌 。以充有 10m mol / L t ical si ke .ypp ( A Ch 或 60m mol / L KCl 的 玻 璃 微 管 直 径 约 407 大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测 第 3 期 ) 5m在大约相距 30m 处向细胞局部吹加 ,时间约 10s 。 μμ 2 结果与分析 ( ) 碳纤电极 C F E入池后 , 施加 780mV 直流电压 ,先观察到一瞬态的电流变化 ,5mi n 内该 内 , 否则说明电极的漏电流较大 , 不宜采用 。如果电极的噪声超过电流应回至离基线 20A p 5A , 也不采用 。p () 实验时 ,电极尖与细胞表面高度接近 约 1m,以不损伤细胞为度。 向细胞吹加 10m mol / μ ( () ) L A Ch 或 60m mol / L KCl ,2 - 5s 延迟后 ,C F E 记录到数目不等的峰 si ke信号 图 2A。典 p () () 型的峰信号上升很快 约 1m s, 而依指数式缓慢衰减 ,常达数十 m s 甚至数百 m s 图 2B 。停止吹药后 5 - 10s 内 ,仍可记录到峰信号 。而未加刺激时则没有峰信号。实验表明 ,C F E 记录的 ( ) 峰信号与 A Ch 或 KCl 刺激之间存在偶联关系 n = 42, 是由细胞受刺激时释放于胞外的物质 所产生 。图 2A 中 KCl 刺激时记录基线的漂移 , 源于吹药过程中溶液流动使电极端表面物质 5 变化。 图 3 是一例在同一细胞上 , 分别对 C F E 施加 780mV 和 100mV 直流电压时检测细胞分 () () 泌的记录结果 。780mV 时检测到分泌的电流尖峰 图 3A ,C,而 100mV 时则无 图 3B 。这是 因为嗜铬细胞分泌囊泡内主要为儿茶酚胺类激素 , 在正常生理溶液中 , 儿茶酚胺的最低氧化 5 还原电位约为 200mV , 当电极上直流电压低于此值时 , 不足以使其氧化而产生电流 , 则 C F E 不能拾取分泌信号 。图示中的三个记录为依次间隔 15mi n 给予 KCl 刺激并观测 , 以避免 5 细胞内的分泌囊泡被排空。 由于嗜铬细胞的正常生理刺激 A Ch 既可通过烟碱型受体使外钙内流 ,又可通过毒蕈碱型 受体释放胞内钙库 ,故我们选择高钾为刺激物研究其在有钙和无钙胞外液中的分泌反应 ,以说 2 + 13 2 + 明嗜铬细胞分泌的 Ca依赖性。KCl 可使细胞膜去极化 ,激活电压依赖性的 Ca通道 , 使 A 780mV 5Ap 2s 2 + A 60m mol / L KCl + 2. 0m mol / L Ca 6Ap B 100mv 2s C 780mV 2 + B 60m mol / L KCl + 0m mol / L Ca at diff e re nt Fi. 3 A me ro met ric reco r di n sg p g Dee n de nceof KCl - i n duce d cat e2 Fi. 4p g D C o n t he ca r bo n f i bre elect ro de . c hola mi ne relea se o n e xt racell ula r calci u m . vol t a e sg O bse r vat io n s we re ma de o n t he sa me c h ro2 t he e xt racell ula r Ch ra maff i n cell s we re p lace d i n 2 + maff i n cell st i m ulat e d wi t h 10 s 60 m mol / L () ()sol ut io n co nt ai ni n .A 2 m mol / L Ca, o r B g 2 + KCl at a n i nt e r val of 15 mi n . no CaE GTA i n st ea d . a n d a ddi n 0. 2 m mol / Lg 2 + 外钙流入 。图 4 中当胞外液中存在 2m mol / L Ca时 ,施加 60m mol / L KCl 刺激 ,可由 C F E 记 () 录到细胞分泌信号 图 4A ; 如胞外液中未加入钙并加入 0. 2m mol / L E GTA 时 , KCl 刺激下 () 电极未能记录到儿茶酚胺的氧化电流信号 ,此时无分泌效应 图 4B 。 3 讨论 作为单个细胞分泌检测的初步报道 , 本文以大鼠单个嗜铬细胞为标本 , 分别观察了碳纤 电极在单个嗜铬细胞上记录的安培电流信号与乙酰胆碱 、高钾刺激 , 电极氧化电压 , 胞外钙 之间的相关性 ,初步证实峰信号所反映的是由激动剂诱发的 、钙依赖性的细胞分泌事件。 Cho w 等曾以 C F E 技术和膜片钳技术研究牛嗜铬细胞 , 发现在去极化刺激时 C F E 记录 ( ) 的峰信号的潜伏期呈泊松 Poi sso n分布 ,与 Ka t z 对微终板电位的观测一致 ,证明峰信号的时 5 ,14 间分布符合细胞分泌的“量子化”特征等则以快周期伏特法表明 ,C F E 在牛嗜。Wi ht ma n g () 铬细胞上记录的电流峰信号是儿茶酚胺分泌后氧化的结果 图 5, 且每一个峰代表着一个分 3 泌囊泡内儿茶酚胺的释放。峰的幅值 、时程 ,与记录电极离分泌位点的空间距离有关 ; 峰面 5 积则与囊泡内儿茶酚胺分子数目有关 。我们所获得的量子化信号 , 幅值一般在 10 —100A p 范围 ,时间宽度为 1 - 200ms . 应用法拉第定律 , 初步计算表明单个囊泡内释放的儿茶酚胺类 - 20 - 18 - 19 - 17 分子约在 10 - 10 摩尔范围 ,较 Wi ht ma n 等在牛嗜铬细胞上测出的 10 - 10 摩尔为g 3 低。这可能是源于种属差异 。对峰信号的单事件分析 ,将在积累更多实验数据后报道。 研究中我们试用了聚乙烯管和国产聚丙烯吸头制作碳纤电极 。相较而言 ,用国产吸头制作 较为简单 ,在灵敏度 、时间分辨率上与聚乙烯管和其它聚丙烯管制成的电极相当。 R R | | 2 2- C HC HN H - C H2 C HN H2 HO - O = + + 2 H + 2e ? HO - O = O xi dat i ve react io n of cat ec hola mi ne molec ule s re sul t i n i n i t s co r re so n di nFi. 5g pg g elect ro n s w hic h a re det ect e d b t he ca r bo n f i bre elect ro deui no ne fo r m , a n d t woy q nea r t he cell . Fo r a dre nali n , R = - C H3 ; fo r no ra dre nali n , R = - H . 409 大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测 第 3 期 参考文献 Gilli s K. D . : Tec h n i ues o r m e m b r a ne ca aci t a nce m eass u re m e n ts . In Si nle Cha n nel Reco r di n,1 q f p gg 2n d e dit io n , e ds . Be r t Sa k ma n n a n d Er wi n Ne he r ,1995 , Ple n u m Pre ss , New Yo r k , . 155 - 198.pp 曹忠升等 : 生物化学与生物物理进展 , 1992 ,19 : 14 - 17. 2 Wi ht ma n R . M . , et al . :P roc . N at l . A ca d . S ci . U SA , 1991 ,88 : 10754 - 10758. 3 g 4 Zho u Z. a n d Mi sle r S . : J . B i ol . C he m . , 1995 ,270 : 3498 - 3505. Cho w R . H . a n d vo n Rude n L . : Elect roc he m i cal det ect i o n osec ret i o n ro m si n le cel ls . 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EL ECTROC HEM ICAL D ETECTIO N O F CATEC HOL AM I NE REL EAS E F ROM S I NGL E RAT C HROM AFFI N CELL S Xu J ia n h ua Q u A nlia n Ye Qi n Zho u Zh ua n Ka n Hua ua n g gg ( I ns t i t u t e oB i oh s i cs a n d B i oc he m is t rH u a z ho n U n i v e rs i t oS cie nce a n d Tec h n ol o,f p yy g y f g y )W u h a n , 430074 ABSTRACT mic roelect ro de s f a brica t e d f ro m ca r bo n f i be r s ( ) B ut ilizi n Ø7m , i n duce d ca t e2y g μ c ul2 c hola mi ne relea se wa s mea sure d o n ra t a dre nal c h ro maff i n cell s i n si n leri ma r g p y t ure . W he n t he cell s we re st i m ula t e d b locall uff e ri n 10m mol / L acet lc holi neo r y y p g y 60m mol / L of 2 - 5 sec2 af t e r a c hlo ri de , we re o bse r ve d o t a ssi u msi ke susuall dela p p y y ( ) o n ds . T he se si ke sro se f a st , 1m sbutdeca e d slo wl i n a n e xo ne nt ialfo r m . Fo r p yy p si ke reco r di n ,i t i s nece ssa r to al hi h e no uhD C vol t a eto t he elect ro de . p g y pp y g g g e xa mle , ofExt racell ula r calci u m , fo r 2m mol / L , wa s fo r re ui re d hi h o t a ssi u m - i n2p qg p duce d re so n se .Si nce t he si ke swe re fo u n d to co r re so n dwi t h ua nt alrelea se of ca t2 pp pqec hola mi ne i n si n leve sicle s , ca t ec hola mi ne molec ule s of a si n le nt alrelea se we re uag gq - 20 - 18 10 - 10 e st i ma t e d he re to be a bo ut mole s . Wor ds : Ch ro maff i n cell Ca r bo n f i be r elect ro de KeExoc to si sy y Elect roc he mical mea sure me nt Ca t ec hola mi ne 本文于 1997 年 1 月 20 日收到 。