马尾松种子萌发初始阶段生理生化变化【精品-doc】

马尾松种子萌发初始阶段生理生化变化【精品-doc】 马尾松种子萌发初始阶段生理生化变化 作者:白婷、谢德晋 导师:喻方圆 摘要:种子萌发是种子植物个体发育中最为关键的时期,是植物为适应环境(气候变化、温度差异等因 素)以保持自身繁殖而形成的一种生物学特性,它关系到是否能够保证种群顺利繁衍和进化,具有非常重要 的生物学意义。种子萌发在本质上是种胚由静止状态恢复到连续生长状态,开始进行新的遗传程序即基因的 相应转录。目前对种子萌发过程有很多研究，但对从置床到露白期间的种子生理生化变化的研究比较少， 这个阶段是种子萌发的关键时期，研究这个阶段的生理生化变化并建立其与马尾松种子萌发进程之间的关 系有很重要的意义。 关键字:马尾松种子;萌发;生理生化变化 Abstract: Seed germination is the most critical period during the development of seed germination, which is a biological characteristic in order to adapt to the environment (Climate change, temperature differences and other factors). Moreover, it is related to reproduction and evolution of populations and has very important biological significance. Seed germination is that embryo is from the state of rest to the state of continuous growth, starting a new genetic program that the corresponding gene transcription. Currently, there are a lot of s researches about seed germination, but the research of seeds’ physiological and biochemical changes which is from home bed to Lu bai. This stage is a crucial period for seed germination. Studying this phase of the physiological and biochemical changes and establishing the relationship the pine seed germination’s process has very important significance. Key words: Pine Seeds; Germination; Physiological and biochemical changes 本项目研究马尾松种子萌发初始阶段相关生理生化指标的变化规律，建立马尾松种子萌 发过程中生理生化变化与种子萌发进程之间的关系，揭示马尾松种子萌发的生理机制。 一、 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1 种子来源 马尾松种子由江西省赣州市林木种苗站提供。种子采集时间为2008年12月，发芽率为 60%。 2种子培养 将马尾松种子均匀撒播于铺有湿润脱脂棉的发芽盒中，置于(25?1)?培养箱中培养。 从置床开始，每5h取出适量种子样品，分别用于呼吸速率及生理、生化指标的测定。用于 生理、生化指标测定的样品取出胚乳，并将胚乳用密封袋密封，放入-76?的超低温冰箱保 存。种子“露白”(胚根刚突破种皮)时取样结束。 3 测定方法 3.1呼吸速率的测定 在种子按2中的方法培养过程中，，每隔5h取5g种子，迅速用吸水纸吸干其 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的水分， 放入棉纱布中，用美国LI-COR公司生产的LI-6400光合作用呼吸仪来测定种子的呼吸强度。 3.2 生理生化指标测定 3.2.1 可溶性糖含量测定 采用蒽酮比色法(李合生，2004)。取0.3g胚乳，加10mL的蒸馏水研磨并转移到试管中，用塑料膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)。提取液过滤到25mL容量瓶并用蒸馏水定容。吸取0.2mL提取液于试管中，加入1.8ml蒸馏水，再依次加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯和5mL98%的浓硫酸，用振荡器充分震荡每个试管，立即放入沸水浴中保温1 min，自然冷却后在630nm波长下测定OD值，每个处理重复3次。得到的OD值代入葡萄糖标准曲线查找相应的葡萄糖含量，按下式计算出样品中可溶性糖含量。 CVn，， ，100可溶性糖含量(%)= 6 10α，W 式中:C:标准方程换算出的糖含量，(µg);V:提取液体积，(mL); W:样品重，(g);n:稀释倍数;a:测定时吸取样品液体积，(mL) 3.2.2淀粉含量测定 采用蒽酮比色法(李合生，2004)。将提取可溶性糖的过滤残渣用10mL热蒸馏水转移 -1到试管中，放入沸水浴15min，再加9.2mol?L高氯酸2mL，充分提取15min。然后冷却过滤，用蒸馏水定容至25mL容量瓶中。吸取0.2 mL提取液于试管中，依次加入1.8mL蒸馏水、0.5mL2%蒽酮乙酸乙酯及5mL98%的浓硫酸，然后在振荡器上充分震荡混匀，立即投入到沸水浴保温1min，自然冷却后在630nm波长下测定OD值，每个处理重复3次。得到的OD值代入葡萄糖标准曲线查找相应的葡萄糖含量，按下式计算出样品中淀粉含量。 CV，，0.9 ，100淀粉含量(%)= 310α，W 式中:C:标准方程换算出的糖含量，(mg);V:提取液体积，(mL); W:样品重，(g);a:测定时吸取样品液体积，(mL) 3.2.3可溶性蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量(李合生，2004)。在电子天平上准确称取0.3g胚乳，加5mL蒸馏水研磨并转移到离心管中，在6000 rpm离心20min，取0.5mL上清液，稀释至15mL，再吸取1.0 mL稀释液于试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250，充分混合，放置2 min后在595nm下比色，测定吸光度。该测定重复3次。数据带入下式计算蛋白质含量。 ，，CVnT-13可溶性蛋白质含量(mg?g)= VW，，10S 式中:C:查标准曲线值，(μg);V:提取液的总体积，(mL); W:样品鲜重，(g);T V:测定时加样量，(mL);n:稀释倍数 S 3.2.4粗脂肪含量测定 粗脂肪含量测定采用索氏抽提法(李合生，2004)。在电子天平上准确称取0.5g胚乳，放入称重(W)的脱脂滤纸中(滤纸已事先烘干)，严密包裹。包裹的样品在105?烘2h后1 干燥称重(W)。然后放在索氏提取器的承受瓶中，加入约瓶1/2体积的石油醚，置于70?2 水浴中反复抽提16h。待脂肪提取完，取出滤包并在105?下烘2h使乙醚完全挥发，放入干燥 器冷却称重(W)，至恒重。该测定重复3次。 3 WW-21，100粗脂肪含量(%)= WW-23W:烘干脱脂滤纸重，(g);W:烘干脱脂滤纸和样品总重，(g);W:抽提后烘干脱脂123 滤纸和样品总重，(g)。 3.2.5蛋白酶活性测定 采用Folin-酚法测定(王家源，2005)。在20mL试管中加入5mL2%的牛血清蛋白溶液，在25?温水中10min，然后加入1mL酶提取液，在25?温水中再保温60 min，结束后加入10mL，5%的三氯乙酸，在振荡器上混匀，室温放置30 min后过滤。 同时做一对照管，取酶液1mL，加入10mL，5%的三氯乙酸，然后加入5mL2%的牛血清蛋白溶液，在振荡器上混匀，在25?温水中再保温60 min，然后室温放置30 min后过滤。 -1取50mL的三角瓶，加5mL滤液、0.5mol?LNaOH溶液10mL，摇匀后加2mL的Folin-酚试剂，摇匀，在室温下放置5~10 min，以对照溶液为空白进行比色，在580nm条件下测定其光密度值。 5110，，，，8C-15蛋白酶活力[μmol?(g?h)]= Wt， 式中:(5+1+10):酶促反应停止时反应液的总体积，(mL);5:颜色反应时吸取酶促反应液体积，(mL);8:粗酶液制备的总体积，(mL);C:从酪氨酸标准曲线上查的相应光密度值的酪氨酸微摩尔数，(µmol);W:样品重量，(g);t:酶促反应时间，(h) 3.2.6氧化途径关键酶活性测定 ?试剂 准确称取NADP0.197g、D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐0.076g、MgCl?6HO 0.051g，然后用22-10.1 mol?L，pH=7.4 Tris缓冲液溶解并定容至50 mL，放在0~4?的冰箱中备用。NADP由Sigma公司生产;MgCl?6HO由上海统亚化工科技发展有限公司生产。 22 П 酶液提取 -1 准确称取胚乳0.4g，加入2 mLTris缓冲液(浓度为0.1 mol?L，pH=7.4)，在冰浴中研 -1磨，然后用3 mL的缓冲液清洗研钵，一同转入10mL的离心管中，在6000r?min、0~4?的温度条件下离心15 min，然后过滤，在同样条件下再离心35 min，上清液即为待测酶液，放在0~4?的冰箱中备用。 3.2.6.1磷酸己糖异构酶活性测定: 通过测定6-磷酸果糖的产量间接反应磷酸己糖异构酶活性(浦新春，1994)。测定时吸取0.1mL酶样放入10mL离心管中，加1.0mL15mM 6-磷酸葡萄糖在30 ?水浴中反应5 min，然后加入0.5mL10%(w/v)的三氯乙酸停止反应，反应液在6000rpm、0~4?的温度条件下离心10min，取上清液1.0 mL，加入6 mL 30%HCL和2 mL 0.1%的间苯二酚溶液，在80?的水浴中震荡反应8 min，自然冷却后用核酸蛋白仪DU800在520nm波长下测定吸光值。以加入0.1 mLTris缓冲液为对照，每样品设3次重复，并以每克鲜重OD值表示磷酸己糖异构酶活性。 AV×T-1?DW)= 磷酸己糖异构酶活性(OD?gs×WV 式中A:测定的OD值 ;V:提取液总体积，(mL);W:材料鲜重，(g); T Vs:测定酶样体积，(mL)。 二、结果与分析 1 呼吸速率的变化 种子萌发过程中呼吸代谢不断加强，呼吸速率也会随着种子含水量的增加而上升。 70 60 50 40 30 20 10 0呼吸速率/μmol?g - 1?5101520253035404550556065707580859095100105110115120min – 1 置床时间/h 图1马尾松种子萌发初始阶段呼吸速率的变化 Fig.1. Changes on respiratory rate of P.massoniana seeds during initial germinating stages 2马尾松种子胚乳贮藏物质及相关酶活性的变化 种子萌发的初始阶段，贮藏物质在酶的作用下被分解为简单小分子化合物，并从子叶或胚乳中运送到胚轴，为胚的生长提供营养物质和能量来源，促进种子萌发和幼苗生长。淀粉、蛋白质及脂肪是植物种子中贮藏的主要物质。 2.1胚乳可溶性糖含量的变化 从图2可以看出，马尾松种子胚乳可溶性糖含量在培养最初40h内，下降幅度较大，从1.80%下降至1.43%。培养40h后可溶性糖含量下降缓慢，原因一方面是细胞膜的修复;另一方面是细胞内代谢趋于稳定，糖代谢趋于平衡，可溶性糖被利用较少。但在培养75h后，胚乳代谢加强，可溶性糖作为能源物质被大量消耗，其含量下降幅度变大，在培养120h时降为最低值0.85%。在培养40~50h、75~85h间可溶性糖含量有短暂的回升，这可能是由于淀粉、脂肪等大分子物质大量转化为小分子糖的缘故。 2.1 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1可溶性糖含量/% 0.9 0.75101520253035404550556065707580859095100105110115120 置床时间/h 图2马尾松种子萌发初始阶段胚乳可溶性糖含量的变化 Fig.2 Changes of soluble sugar content in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 2.2胚乳淀粉含量的变化 从图3可以看出，马尾松种子置床20-35h，淀粉含量下降较大，从28.81降至25.35%。可能由于在置床培养初期，预存在种子中的磷酸化酶分解淀粉，产生ATP，积累能量。种子在培养35~55h期间淀粉含量降低不明显，从25.35%降为 24.74%，含量仅降低0.61%。此阶段的变化表明，在种子萌发初期种子胚乳中淀粉的代谢已经由第一阶段的分解缓慢过度到第二阶段。在培养55~100h期间淀粉含量大幅下降，说明淀粉代谢再次启动。有淀粉水解酶开始分解淀粉积累能量。培养70h后，淀粉含量再次大幅度下降，并于实验结束时，含量降至最低值的14.63%。淀粉含量的再次大幅度降解说明淀粉代谢启动，原贮藏的淀粉被水解为可溶性的碳水化合物，供胚生长所用。 31 29 27 25 23 21淀粉含量/%19 17 155101520253035404550556065707580859095100105110115120 置床时间/h 图3马尾松种子萌发初始阶段胚乳淀粉含量的变化 Fig3 . Changes of starch content in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 2.3 胚乳可溶性蛋白质含量的变化 - 1 马尾松种子在培养50h后，可溶性蛋白质开始被肽链水解，由31.57mg?g 降为 - 123.55mg?g ，比置床培养初期降低8.02%。可溶性蛋白含量的急剧下降主要集中在置床50h前，是由于此段时间种子内的代谢较强，不断生长的胚轴对可溶性蛋白质需求增加，促使可溶性蛋白大量水解成氨基酸的缘故。培养50-120h期间，可溶性蛋白变化幅度不大，含 - 1量保持在22.18-23.54mg?g 。这个阶段胚乳内粗脂肪等物质降解转化为蛋白质较多，为胚突破种壳后的迅速生长提供更多的物质和能量，而且种子萌发必须合成蛋白质和磷酸。 35 30 25 20 可溶性蛋白质含量/mg?g - 1155101520253035404550556065707580859095100105110115120 置床时间/h 图4马尾松种子萌发初始阶段胚乳可溶性蛋白质含量的变化 Fig.4. Changes of soluable protein content in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 2.4胚乳粗脂肪含量的变化 由图5可知，随着置床时间的延长，马尾松种子胚乳脂肪不断的降解，其含量总体上呈下降的趋势。在培养5~65h期间，马尾松种子胚乳中脂肪含量，呈现缓慢下降趋势。从最初的57.81%降至46.86%，此阶段胚乳代谢尚未启动，粗脂肪含量的降低主要转化为蛋白质。65~70h，脂肪含量下降很强，70h~120h下降趋势也很明显，说明此阶段种子生理活动趋向旺盛，胚需要更多的养料和能量来满足生长的需要，脂肪既可通过乙醛酸循环转化为糖，作为呼吸基质被消耗掉，又可作为原料物质供胚利用，致使其含量下降幅度变大。 60 55 50 45 40 35 30脂肪含量/%25 20 155101520253035404550556065707580859095100105110115120 置床时间/h 图5马尾松种子萌发初始阶段胚乳脂肪含量的变化 Fig.5 . Changes of lipid content in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 2.5胚乳蛋白酶活性的变化 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，蛋白质在蛋白酶的作用下被降解为蛋白胨、肽类，最后降解为小分子的氨基酸，为幼胚的形态建成提供原料。从图6可以看出，马尾松种子在置床培养过程中，随着培养时间的延长，胚乳中蛋白酶活性都呈逐渐升高的趋势。 7 6 5 4 3 2 1 蛋白酶活性/μmol?(g?h)-105101520253035404550556065707580859095100105110115120 置床时间/h 图6马尾松种子萌发初始阶段胚乳蛋白酶含量的变化 Fig.6 Changes of proteinase activity in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 3马尾松种子胚乳呼吸代谢关键酶活性的变化 3.1磷酸己糖异构酶(PGI)活性的变化 从图7可以看出，马尾松种子萌发初始阶段胚乳中PGI活性表现出先上升后下降的趋势。 -1马尾松种子培养后胚乳中PGI活性就迅速升高，并于培养70 h达到最大值42.28OD?g?DW。此阶段，胚乳生理生化反应微弱，幼胚的生长需要能量和原料较少，EMP途径作为高等植物有氧呼吸或无氧呼吸必须进行的途径被激活。培养70h后，PGI活性又迅速下降。在培养115h -1时PGI活性降为最低值26.38 OD?g?DW。PGI活性在萌发初始阶段的变化规律说明EMP途径是马尾松种子置床培养初期的重要代谢途径，但随着种子萌发进程的深入，EMP途径作用降低并逐渐被取代。 45 40 35 30 25 205101520253035404550556065707580859095100105110115120磷酸已糖异构酶活性/OD? g-1?DW置床时间/h 图7 萌发初始阶段马尾松种子胚乳磷酸已糖异构酶活性的变化 Fig. 7 Changes of PGI activity in the endosperm of P.massoniana seeds during initial germinating stages 4马尾松种子萌发初期贮藏营养物质与相关酶活性之间的相关分析 4.1 马尾松种子胚乳中淀粉含量与淀粉酶活性之间的关系 2从图8中可以看出马尾松种子胚乳中淀粉含量与淀粉酶活性呈负相关，R为0.865。相关系数r=-0.930。说明当胚乳中淀粉酶活性增大时，淀粉含量就会减小。 4y = -0.1488x + 5.05472R = 0.86453 2 1 淀粉含量/%0 16212631 淀粉酶含量/ mg?(g?min)-1 图8马尾松种子胚乳中淀粉含量与淀粉酶活性之间的关系 Fig.8 The relationship between starch content and amylase activities in the endosperm of P.massoniana seeds 4.2 马尾松种子胚乳中蛋白质含量与蛋白酶活性之间的关系 2从图9中可以看出马尾松种子胚乳中蛋白质含量与蛋白酶活性呈负相关，R为0.883，相关系数r=-0.940。说明当胚乳中蛋白酶活性增大时，蛋白质含量就会减小。 7y = -0.5307x + 17.2962R = 0.88335 4 3 2 1 0蛋白质含量/mg?g - 1 20253035 蛋白酶活性/μmol?(g?h)-1 图9马尾松种子胚乳中蛋白质含量与蛋白酶活性之间的关系 Fig.9 The relationship between soluable protein content and proteinase activities in the endosperm of P.massoniana seeds 三、讨论 1(萌发初始阶段种子呼吸速率的变化 呼吸作用是一切活细胞所共有的生命活动，是植物新陈代谢的一个重要组成部分，与植物的生理活动过程有着重要而密切的关系。随着吸水滞缓期的出现，呼吸速率也出现了滞缓期。本实验中，马尾松种子的呼吸速率的变化呈上升趋势。在30-60h，呼吸速率增长变得缓慢，出现了种子呼吸的滞缓期。 2萌发初始阶段马尾松种子胚乳营养物质及相关酶活性的变化 2.1萌发初始阶段马尾松种子胚乳营养物质的变化 种子萌发初始阶段，幼胚中各种生理活动都需能量来支持，幼胚的生长也需要大量的原料，因而萌发初始阶段形成了以水解为主，呼吸作用强烈的代谢特点。该阶段中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、粗脂肪等贮藏物质在相关酶的作用下水解生成易被胚吸收的小分子物质， 并从胚乳运送到胚轴，为胚细胞的生命活动提供C源和N源，引起胚的迅速生长。 马尾松种子在萌发初始阶段，可溶性蛋白质和粗脂肪最先降解，它们分别在置床培养15h和5h后，含量开始迅速下降。而淀粉和可溶性糖分别于培养20h和25h代谢趋向旺盛。蛋白质和粗脂肪是马尾松种子萌发初始阶段首先利用的贮藏物质。 2.2萌发初始阶段马尾松种子胚乳营养物质相关酶活性的变化 种子萌发初始阶段胚乳贮藏的营养物质降解是在一些列酶的作用下进行的。从本实验结果可以看出，马尾松胚乳中淀粉酶、蛋白酶活性都有不同程度的变化，这与淀粉、蛋白质及脂肪的物质代谢密切相关。 本研究测定的蛋白酶活性呈显著上升的趋势，马尾松种子萌发初始阶段蛋白酶活性的升高可能是种子代谢活动逐渐增强，胚生长需要较多的N素营养，而蛋白酶作为水解蛋白质的主要酶类，活性也随之升高。置床培养最初的30h酶活性增量较小，随后蛋白酶活性迅速上升，在胚根突破种壳时达到最大值。胚乳可溶性蛋白质含量在萌发初始阶段随着蛋白酶活性的升高逐渐降低，二者之间成负相关关系，r=-0.940。 3萌发初始阶段马尾松种子胚乳氧化途径关键酶活性的变化 呼吸代谢是植物新陈代谢的一个重要组成部分，在植物整个生命活动中占有关键性的地位(宋松泉，1988)。从实验研究可知，整个培养过程糖代谢主要以EMP途径为主，其中培养最初35h，EMP和PPP途径同时存在，但以EMP途径为主。随后胚乳代谢活动加强，幼胚的生长需要大量的能量和原料，而EMP途径满足不了种子生命活动的需要，其活性逐渐降低。随着EMP途径活化程度的降低，催化PPP途径的关键酶活性不断升高，胚乳的呼吸代谢由EMP途径转向PPP途径。使得PPP途径成为培养中后期的主要代谢途径。在研究西洋参种子休眠解除时指出，种子休眠萌发主要是受EMP/ TCA途径和PPP途径的平衡调节，当PPP途径逐渐增强并达到一定比例时种子就萌发(赵永华，2001)。呼吸代谢中磷酸戊糖途径(PPP)的不充分活化是引起结缕草种子不能顺利萌发的主要原因(浦心春，1994)。可见，马尾松种子在萌发初始阶段呼吸途径由EMP途径向PPP途径的转变是种子顺利萌发的标志。 高等植物呼吸代谢不一定只遵循一条固定不变的路线进行，而可能存在多条并行的途径，这些途径进行的程度和速度是随着植物的发育情况及外界环境而改变的(邢惕，1985)。马尾松种子在置床初期EMP和PPP途径同时存在，而以EMP途径为主，中后期EMP和PPP途径同时存在，PPP途径占主导地位。 参考文献 1. 比尤利J.D.，布莱克M. 种子萌发的生理生化，第二卷，生活力、休眠与环境控制[M]. 南京:江苏科学技术出版社出版社，1979. 2. 陈禅友，刘磊.长豇豆种子萌发进程中生理生化指标动态变化[J].种子，2006，9(25): 30~33( 3. 陈丽培.油松种子萌发初始阶段生理生化特定研究[D].南京林业大学硕士论文，2009. 4. 郭建军，李玲.GA 调节禾谷类α-淀粉酶基因表达的信号传导及分子机制[J].植物学通 报2002，19(1):63~69( 5. 国家质量技术监督局. GB2772-1999《林木种子检验规程》[M]. 北京:中国标准出版 社.2000. 6. 韩克杰，孙霞，邢世岩，等. 欧洲榛子贮藏及萌发生理特性研究[J].武汉植物学研究， 2006， (5):435~440 7. 李合生. 植物生理生化试验原理和技术[M]. 北京:高等教育出版社，2004. 8. 李清芳，范永红，马成仓，等.大豆种子萌发过程中蛋白质、脂肪和淀粉含量的变化[J]. 安徽农业科学，1998，(4):299~300. 9. 路英华.蛋白酶的研究进展[J]. 生命科学信息，1991;8(2):8 10. 潘瑞炽.植物生理学(第五版)[M].北京:高等教育出版社，2004. 11. 浦新春，韩建国，李敏，等.结缕草种子打破休眠过程中的代谢调控[J].中国草地，1994， (3):20~24. 12. 宋松泉.高等植物呼吸代谢的调节[J].长沙水电师院学报，1988. 13. 树木学(南方本)编写委员会.树木学[M].北京:中国林业出版社.1998. 14. 王家源.青钱柳种子解除休眠及萌发生理的研究[D].南京林业大学，2005 15. 邢惕.植物代谢途径的多样性[J].生物学通报，1985. 16. 颜启传.种子学[M].中国农业出版社，2004. 17. 赵永华，杨世林，刘惠卿，等.西洋参种子休眠解除与磷酸戊糖途径关系的研究[J].中草药，2001，(3):259~261.