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基因體科學(8) 基因舞者 談基因體上的跳躍單元 Dancers in the Genome – Mobile elements 台灣大學謝豐舟教授 人類的基因體已知具有3X109鹼基對，其中屬於獨特序列（unique or single copy DNA意即整個基因體上只有一個copy）的部分約佔45％，另外55％則是反覆序列（repetitive sequence）。基因體中的主角當然是"基因"，因此這些佔了基因體一半以上的反覆序列，一向被視為垃圾（Junk）DNA。 然而，這些"垃圾"真是如此不堪嗎？近來對基因體的研究，學者慢慢瞭解這些"反覆序列"不僅是建構基因體的重要成分，更是形塑"基因體"性狀和功能的基因體工匠（genome artisan）。 反覆序列的分類(圖1) 反覆序列可以分為兩大類，其一為串聯反覆序列（tandem repeat）。這是一些單位序列反覆地再現，缺乏具體的組織結構；它包括（1）微衛星（microsatellite）：由2–10個鹼基的基本序列組成反覆數次到數十次，如(CA)n（2）迷你衛星（minisatellite）：由20–100個鹼基的基本序列反覆組成，可達500–20,000個鹼基的長度（3）端粒序列（telomere）位於各染色體的遠端，其一般結構為5′–(T/A)1-4 (G)1-8–3′。 串聯反覆序列約佔人類基因體的10–15％，它們通常聚集在染色體上的某些區段，例如染色體1號、9號、16號的長臂近端以及Y染色體的長臂。在每一個染色體的中心粒都有稱為α–衛星（α–satellite）的反覆序列，這是以171個鹼基為基本單位的反覆序列，據信α–衛星與細胞分裂時染色體的分離（segregation）有關。串聯反覆序列有人將之統稱為衛星（satellite）DNA，原因是早期在研究DNA時，使用Cesium chloride density gradient進行離心，大部分的DNA(含前述的獨特序列DNA)自成一區，而這些串聯反覆序列DNA較輕，所以另外集合成較小的三區，恰似行星旁邊的衛星，因此習慣上以"衛星"來稱呼這些串聯反覆序列(圖2)。讀者要注意，此一"衛星"與acrocentric染色體（13,14,15,21,22號）上的"衛星"不同，後者是型態上像染色體頭上長出兩粒，性質上則是好幾百個copy的ribosomal RNA gene，與前述串聯反覆序列的"衛星"完全不同，不可混淆。 散落性反覆序列(Interspersed repetitive sequence)(圖3) 反覆序列的另一大類是"散落性反覆序列"（Interspersed repetitive sequence）。與前述聚合在某些染色體區段的串聯反覆序列不同的是，這些散落性反覆序列在染色體上到處分佈，因此稱之為散落性反覆序列。它包括兩大類，一類是DNA跳躍子（DNA transposon），另一類則為反轉錄單元（retroelement）。前者類似果蠅的跳躍子（transposon），在人類基因體較不重要；倒是反轉錄單元（retroelement），在哺乳類基因體結構上扮演相當重要的角色。它們都能藉由中介RNA（RNA intermediate）進行擴增（amplification），並且移動到基因體上的新位置，因此被稱為反轉錄單元（retroelement）或反轉錄跳躍子（retrotransposon），因為它們能在基因組上移動，也有人稱之為移動單元（mobile element），據估計人類基因體的50％是由反轉錄單元衍生而來。 反轉錄單元（retroelement）又可分為自主性反轉錄單元（autonomous）及非自主性反轉錄單元（non autonomous）。自主性反轉錄單元雖然需要許多細胞內蛋白質協助其擴增，但其本身確實具有一些擴增所需的活性，相反地，非自主性反轉錄單元則必須藉助其他的自主性反轉錄單元提供協助，才能達到其擴增的目的。 自主性反轉錄單元以LTR（long terminal repeat）最為知名，它的結構與反轉錄病毒(retrovirus)相類似。頭尾兩端是long terminal repeats，中間則為數個開放轉錄區（open reading frame）以轉譯反轉錄移位（retrotransposition）所需的蛋白質；包括endonuclease，以切入欲結合的基因體位置，還有reverse transcriptase俾將RNA轉錄成DNA。在第一個LTR正下游則有能提供反轉錄起始點的特別部位（priming site）。與反轉錄病毒不同的是，LTR缺少合成病毒套膜及製造功能性病毒基因的基因組。有時候LTR也會缺少某些ORF以致不能自行擴增，而成為非自主性反轉錄單元。它們通常是來自古老的反轉錄單位，失去部分功能後變成不活動的假基因（pseudogene）。 非自主性反轉錄單元主要有SINE（short interspersed repetitive element）及LINE（long interspersed repetitive element）。SINE長度約90–300個鹼基，其中最重要的是Alu，LINE長度約6,000個鹼基，最著名的是L1。 Don Quixote, 1955 by Pablo Picaso L1 retroelement 人類的基因體上有近50萬個不活動的L1單元（5′truncated，inverted or mutated），但仍有5,000個全長6Kb的L1存在而其中60–100個具有retrotransposition的能力。完 整的L1，全長6,000Kb，含有（1）5′未轉譯區（5′UTR）（內含1 promoter），（2）1Kb之開放轉錄序列（ORF1），能產生具RNA結合能力的蛋白質（3）4Kb之開放轉錄序列（ORF2），能產生具endonuclease及reverse transcriptase能力的蛋白質（4）短的3′UTR（5）poly(A)tail(圖3)。L1插入染色體DNA是藉由所謂target primed reverse transcription （TPRT）的過程，其ORF2的endonuclease先切斷一處單鏈DNA，以切斷處之3′–OH作為引子，並以L1 RNA作為模板（template）進行反轉錄。 L1在基因體上的retrotransposition可經由下列四種機轉改變基因結構 （1） Insertional mutagenesis（cis） L1產生的蛋白質會作用於L1本身轉錄出來的RNA以產生新的retrotransposition event。新形成的L1可以是full length，5′truncation或是5′truncation加上inversion （2） Insertional mutagenesis（trans） L1產生的蛋白質偶爾會作用於其他非L1RNA，造成processed pseudogene（佔genome的1％）或Alu這類nonautonomous retrotransposon（佔人類genome的10％，約共五十萬copy）的散佈於基因體上。所謂processed pseudogene就是一個spliced mRNA被L1的reverse transcriptase反轉錄成DNA，再插入基因體。 （3） Endonuclease independent insertion 在極稀少的情況下，L1也能直接插入到一處DNA之double-strand break，不過插入後之L1常常是3′truncated並且缺少TSD（target site duplication）。 （4） Transduction L1在進行retrotransposition時，會涉及3′或5′（較少見）之flanking DNA，並將之帶到基因體上新的位置，也就是L1  會扮演"exon shuffling"的工作。位於基因intron的L1，當它進行retrotransposition時，會把其上游或下游的exon帶到基因體上的新位置，可能就把這個exon加到一個新的基因內，造成基因體重要的改變。 總之，L1大概直接或間接與人類基因體的三分之一脫不了關係。 Alu retroelement 人類基因體上另一個重要的retroelement就是Alu，總共有50萬copy，佔人類基因體的10–15％。完整的Alu長度約300bp，因為它具有一處Alu I restriction enzyme的切點，因此被冠上Alu這個奇怪的名稱。Alu常見於intron，基因的3′UTR以及intergenic genome region 。雖然Alu是SINE中最主要的成員，但Alu較多見於基因組上基因豐富（gene-rich）的區域，而非隨意散落各處。 演化上，Alu出現的時間正是65百萬年前靈長類誕生的時候。仔細分析Alu的鹼基序列，我們可以推定它源於7SL RNA基因，而此基因是ribosomal complex的一部分。Alu可能源起於靈長類演化早期的一次gene duplication，繼而發生不斷的amplication，而達到今日龐大的數目。事實上，所有的SINE（short interspersed repetitive element）均源於各種小型且具高度結構性的RNA如tRNA（transfer RNA），其轉錄則有賴於RNA polymeraseIII。 Alu是由二個monomer組成，二個monomer之間夾著一段富含A的序列（A2TACA6）。在5′的第一個monomer，具有兩個RNA polymerase III的promoter，在3′的第二個monomer則帶有一個31bp的insertion。第二個monomer的末端則是不同長度polyA tail。在整個Alu的頭尾兩端則是源於插入處的short intact direct repeats。Alu 會經由retrotransposition 擴增其數量，此過程是由Alu上的RNA polymeraseIII promoter啟動反轉錄，由於Alu並不具有使RNA polymeraseIII 停止轉錄的訊號，因此轉錄常延伸到鄰接的獨特序列 (unique sequence) ，直到出現TTTT序列才停止下來。因此，Alu之RNA轉錄稿在3′常有UUU的序列。目前推測Alu的retrotransposition可能要先由前述的L1之endonuclease對插入處的DNA，在TTAAAA的consensus site上先予以切斷(first nick) ，然後Alu的poly A tail與切斷處3′的TTTT結合，再以Alu為模板進行反轉錄，目前另一接合處(second nick)的機轉尚待釐清，不過，反轉錄及插入完成後新的Alu兩端會帶有新的direct repeats。