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首页 慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响

慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响.doc

慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响

张采琳
2017-12-26 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响doc》,可适用于战略管理领域

慢病毒介导RNA干扰Sez对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响同济大学医学院硕士学位论文慢病毒介导RNA干扰Sez对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响姓名:李卓权申请学位级别:硕士专业:人体解剖与组织胚胎学指导教师:张军摘要摘要目的在体外筛选高效率干扰小鼠,,,,基因表达的,,,,,片段将高效,,,,,包装到慢病毒载体中构建,,,,,,,,,慢病毒系统。检测,,,,基因在,,种不同组织来源的人肿瘤细胞中的表达情况探讨,,,,基因与肿瘤细胞之间的关系为进一步研究,,,,基因的生物学功能提供理论依据。研究干扰小鼠小脑中,,,,表达后。小脑浦肯野细胞树突的生长发育与胞体的排列变化阐述,,,,基因表达在小鼠小脑浦肯野细胞生长发育过程中的作用。方法针对,,,,基因组第二外显子设计合成不同的,,,,,片段构建,,,,,,,,,,,,,,,,,干扰质粒同时构建,,,,第二外显子融合蛋白,,,,,,,,,,重组子干扰质粒与重组子在体外进行共转染,,,,,细胞筛选出高效率干扰,,,,基因表达的,,,,,片段。构建,,,,第二外显子融合蛋白,,,,,,,,,,重组子慢病毒系统转染,,,,,,细胞培养稳定表达融合蛋白,,,,,,,,,,的,,,,,,,,,,,细胞株。挑选最高效率的,,,,,片段构建,,,,,,,,,,,,,,质粒。体外培养,,种不同组织来源的人肿瘤细胞抽提总,,,运用,,(,,,检测,,,,基因的表达情况。建立小鼠小脑组织切片体外培养模型。应用构建成功的,,,,,,,,,,,,,,质粒建立,,,,,,,,,慢病毒系统感染切片培养的,,小鼠小脑干扰小脑组织切片神经细胞,,,,基因表达。结果流式细胞术检测筛选出干扰抑制效率达,,(,,的,,,,,片段,,,,,,、,,,,,,,,,,,检测证实,,,,,,,,,,,,,,质粒构建成功。,,,,在肿瘤细胞,,,,、,,,,,、,,,(,,、,,,,,、,,,,,,、,,,,、,,,,,、,,,,、,,,,(,,,、,,,,,、,,,(,,(,,,中表达其中在,,,,,、,,,,,、,,,,、,,,,(,,,、,,,,,及,,,(,,(,,,细胞系中高表达与阳性对照组无差异。在高转移性肿瘤细胞,,,,(,,,、,,,,,、,,,,,(,,,、,,,,,和,,,(,,中,,,,高表达与低转移性肿瘤细胞有显著性差异(尸(,(,,)。慢病毒系统,,,,,,,,,,,,,,转染体外培养小鼠小脑组织切片后观察到组织切片中浦肯野细胞生长发育变化:树突发育延后分支数量减少长度缩短(,,,(,,)浦肯野细胞胞体排列不整齐。结论建立高效的,,,,,,,,,慢病毒系统这为进一步应用慢病毒转染组织和动物活体打下基础。,,,,基因在部分肿瘤细胞中表达并在高转移性肿瘤细胞中高表达提示,,,,基因可能并与肿摘要瘤的转移有关。在小鼠小脑切片中慢病毒转染干扰,,,,基因表达后浦肯野细胞树突发育受到影响。,,,,基因表达蛋白质中具有,,,结构,,,对钙依赖性蛋白质问的相互作用是非常重要的,,,,基因的表达可能跟小鼠小脑浦肯野细胞迁移排列相关。关键词:,,,,基因浦肯野细胞慢病毒,,,,,组织切片培养,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,煎,,,,,,硭妊,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,簦颍酰悖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(弧,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(啊,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,西,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,氇,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,矾氇,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,饿,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,龋校罚罚龋保玻梗梗樱牵,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,,,,,,,(,,(,,,(,,,~,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,谢,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,曲,,,,,,,,,,,,,,曲,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,,,,,,,,,,一,,(,,,。,,)(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,遮越醇,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,同济大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名:年月日学位论文版权使用授权书本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本学校腥ū,嫜宦畚牡挠竞偷缱影妫捎糜坝跤琛只蚱渌侄伪,媛畚模谎,腥ㄌ峁柯技焖饕约疤峁狙宦畚娜幕蛘卟糠值脑睦婪瘢谎,腥ò从泄毓娑ㄏ蚬矣泄夭棵呕蛘呋顾徒宦畚牡母从〖偷缱影妫辉诓灰杂磕谌萦糜谘趸疃学康牡那疤嵯拢,梢允实备粗坡畚牡牟糠只蛉位论文作者签名:年月日第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,(,前言,,,干扰(,,,,)是近年来广泛应用的一种抑制基因表达及研究基因功能的有效方法。,,,,可由小干扰,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)介导,,,,,是一种长约,,,的短双链,,,它既可以通过化学合成的方法获得后直接转到细胞也可以通过短发卡,,,,(,,,,,,)在细胞内经过加工后获得【,,从而诱导内源靶基因的,,,,特异性的降解达到阻止靶基因表达的目的最终影响其生物学功能,,,。质粒载体,,,,,,,,,,含小鼠,,启动子是实验室条件下的模式化工具载体可以开展基于,,,,技术的基因及蛋白功能研究。有学者【,,,采用,,,聚合酶的启动子(,,和,,)在哺乳动物中表达,,,,,分子并且成功抑制了靶基因的表达为在哺乳动物中长期研究对特异性基因的抑制打下了基础。将基因导入细胞内的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。非病毒载体基因转移的效率一般较低在很多情况下不能满足研究需求而病毒载体的转基因效率一般较高是目前科研的较好选择。慢病毒为逆转录病毒科的一个亚科,,,它包括灵长类慢病毒如人类免疫缺陷病毒型(,,,)和型(,,,)慢病毒载体(,,,,,,,,,,,,,,,,,)以型人类免疫缺陷病毒(,,,)为代表,,,,,,可以穿过靶细胞完整的核膜能感染分裂及非分裂或终止分化的细胞包括神经元细胞。构建,,,,,慢病毒载体可以沉默基因从而使靶基因表达下调使能够观察转染前后细胞、组织以及活体的形态功能变化为进一步探索基因功能开辟道路。第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,(,技术路线,(,材料与仪器,(,(,,,,和,,,,,,引物均由上海生物工程有限公司合成(,)扩增小鼠,,,,基因组第二外显子部分序列引物:根据,,,,,,,公布的小鼠,,,,基因序列(,,,,,,:,,,,,)设计合成,,,,,,,(,,,,:,(,艘,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,鱼,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,上游引物,端加,,,,位点”,,,,”及起始密码子„,,,”下游引物,端加,,,位点“,,,,,,目的片段大小,,,,,,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建(,),干扰基因片段,,,,一,,,,,,(,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,,(,,,,,:,(,兀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,订,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,(,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,(,,,,,,(,,,,,:,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,兀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,:,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,不,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,(,,,,,,(,,,,,:,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,订,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,(,,,,,,(,,,,,:,(,不,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,下,,,,,,,,,,,不,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,(,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,,,,(一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,各正义链,端加,,,,(,,,,,,),,,,(,,,,,,)酶切位点修饰。(,)测序引物,,,,,,,,,,,,贝,〕序引物为,,启动子:,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,基因转移质粒,,,,,,,,,,上游测序引物:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,基因转移质粒,,,,上游测序引物:,(,,,,,,,,,觚,,,,,,,,,,,,,,(,(,)小鼠,,,(,,,,,,,,)引物,,,,,,,,:,”,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,、,,,,,,,,,,,,:,、一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,目的片段大小,,,,,,(,(,细胞株(,),,,,,,,(”本实验室保存于,,,,培养基(含,,,胎牛血清),,,,,,,,条件下常规培养。(,),,,,,:本实验室保存于,,,,培养基(含,,,胎牛血清),,”,,,,,,,条件下常规培养。,(,(,质粒及菌株(,)质粒:第三代慢病毒包装系统,,,,,(基因转移质粒)、,,,,,,(包装外壳蛋白质粒)、,,,,,,,(,,,,教授惠赠,,(包装结构基因质粒)由美国加州理工学院,,,,,,,,干扰用基因转移质粒,,,,由本实验在,,,,,基础上改建,,,,,,,,,,质粒由本实验室,,,,,,,,,,,,,,,在,,,,,,公司,,,,,,,,,(,,,,,质粒基础上改建。(,)菌株:大肠杆菌(,,,,,,,,,,,,,(,,,),,,,菌株、,,,,,菌株由本实验室保存。,(,(,主要试剂(,)生化酶制剂:限制性内切酶:,,,,、,,,、,,,、,,,购自,,,,,,,公司(,,,,,,,,,,)(,)试剂盒:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,公司,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司,,,(,,,,,),,,,,,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,公司,,,(,,,,,)。(,)总,,,抽提试剂:,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,公司,,,(,,,,,,,,)(,)细胞、组织培养及转染试剂:,,,,新生牛血清胎牛血清,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,公司,,,(,,,,,),(,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,(,,)丁酸钠(,,,,,,,,,,,,,,)(,,,,,公司)(,),,培养基:,,液体培养基(,,胰化蛋白胨(,,,,,公司),(,,酵母提取物(,,,,,公司),,,,,,,(,)。高压灭菌备用。,,固体培养基(,,胰化蛋白胨(,,,,,公司),(,,酵母提取物(,,,,,公司),,,,,,琼脂糖,,,(,)(,),,,,,,、,,,试剂:,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、,,,,?,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,)(碧云天公司,,,(,,,,,)高保真,,,聚合酶(,,,,,,公司,,,(,,,,,,),,,,(,,,,,公司)。(,),,,,,,,印迹相关材料及试剂:硝酸纤维素膜(,,,,,,,,公司)预染标准蛋白(,,,,,,,,,公司,,,(,,,,,,)脱脂奶粉(,,,)(光明乳业)兔来源,,,抗体(碧云天公司,,,(,,,,,)鼠(,,,,,)抗兔,,,,,单克隆抗体(,,,,,,,公司,,,(,,,,(,)山羊抗兔,,,,,,,,,标记二抗(,,,,,,,公司,,,(,,,,,,(,,,),,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,公司,,,(,,(,,,,,),,,(,,,,胶配方见表,(,:表,(,,,,(,,,,胶配方,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建其它常用试剂:,,,,,,(,,,电泳缓冲液,,,,,(,,,,上样缓冲液,,,(,,,,染色液蛋白转移缓冲液洗涤缓冲液(,,,,)磷酸盐缓冲盐溶液,,,,,,,,,丙烯酰胺封闭缓冲液,,,,,,,,(,,,,,,,,(,,,(,),,”,,,,,(,,,(,),,,、,(,,,乙酸钠(,,,(,)等参照分子克隆实验指南配制。(,)实验用,,,、,,,,,等常规缓冲液参照《分子克隆实验指南(第三版)》配置(,)其它生化试剂均为国产分析纯购自上海国药集团有限公司。,(,(,(实验耗材,(,,,、,(,,,、,,,,、,,,,,,管,,,,培养瓶六孔板、,,孔板(,,公司),(,(,计算机生物信息学(,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:(,,,,:,,,,,(,,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,(,,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,(,,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,,,,,,(,(,主要仪器和设备细胞培养箱:,,,,公司,,,,,(,,,型净化工作台:江南净化设备公司,,(,,型电热恒温水槽:上海华连医疗器械有限公司高压蒸汽消毒锅:,,,,公司,,,(,,,,型电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科技有限公司,,,,水处理系统:,,,,公司超低温冰箱:,,,,,,,,,台式离心机:,,,,,,,,,公司,,,,,型高速冷冻离心机:,,,,,,,,,公司,,(,恒温磁力搅拌器:上海志威电器有限公司,,,,,,荧光倒置显微镜,,,,,公司微量加样器:,,,,,,,,,公司,,,仪,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,、,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,凝胶、蛋白电泳系统:,,(,,,公司,,(,,多功能暗箱式紫外透射仪:上海顾村电光仪器厂,,,(,,,型凝胶成像系统:,,,,公司,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,,,,,,,,,,,,,可见分光光度计:,,,,,,,,,公司,,,,,型便携式酸度计上海精密科学仪器有限公司,,(,,自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,(,(,,,,,,,,,,流式细胞仪,,公司,,,,,,,红外荧光扫描成像系统,(,,,公司,,,,,,,,型酶标仪,,,(,,,公司,,,,,,,,,,,,电转仪,,,,,,,,,公司,(,实验方法,(,(,小鼠基因组,,,抽提采用,,,,,,,公司基因组,,,抽提试剂盒按操作说明进行。(,)小鼠腹主动脉取血,,,,,于,(,,,离心管肝素抗凝。(,)加入,,,,,细胞裂解液上下颠倒离心管,次充分混匀。室温静置,,分钟每隔,分钟混匀一次。(,)室温,,,,,转离心,,秒血白细胞即沉淀于管壁弃去上清剩余,,”,,,,,,液体涡旋振荡器重悬细胞。(,)加入核酸裂解液,,,,,移液枪充分吹打裂解白细胞至液体粘稠如溶液中仍有碎块未裂解于,,孵育至碎块完全裂解。加入,(,,,,,,,,混匀,,孵育,,,,,。(,)加入蛋自萃取液,,,,,涡旋振荡器震荡,,,室温,,,,,转离心,,,,。将上清移至干净,(,,,离心管。(,)加入,,,,,异丙醇上下颠倒离心管充分混匀直至见到白色线状,,,析出。室温,,,,,转离心,,,,管底可见,,,白色沉淀。小心移去上清沿离心管壁缓缓加入,,,,,,乙醇室温,,,,,转离心,,,,。(,)移液枪轻轻移尽上清离心管倒置于吸水纸上室温干燥,,,,,。(,)取,,,,,,,溶解液加入离心管,,水浴,,,溶解,,,。,,,,,,,,,,,,,分光光度计测量,,,浓度一,,冻存备用。,(,(,小鼠,,,,基因第二外显子扩增及,,,产物纯化(),,,,,,,,,,,扩增小鼠,,,,基因第二外显子,,,,体系:,第,章小鼠,,面高效率,,,,,筛进以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,反应条件,,,,“,(,,),,,,,,,〕,,”,(,,”,),,,,,,,,,蛐,甍,詈撕,簧弧(宣训能,,,产物,,琼脂糖凝胶电泳,,,,,,,,,紫外凝胶透射仪下分离目的片段利用,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司,,,,,,,,)回收目的片段洋细操作步骤见试剂说明书文后涉及切胶回收均采用此方法。,,(,质粒构建(,)各质粒结构示意图醪…。心,一”‖””,,,,第,章小鼠,,,,高效率,,,,?,筛选以及嘣,,,,,慢病毒系统构建,。缘,,。。”蓼么一,,,,目(,、…丫一臻,参…、廖。曼矽,。…,、心赫,,,,:…“,,,。毒…,图,符质粒结构示意豳,第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建(,)融合蛋白,,,,,,,,,,重组子构建,)双酶切反应:用,,,和,,,,在,,”(,条件下分别对,,,,,基因,,,产物和质粒,,,,,双酶切,小时酶切后的产物经,,凝胶电泳后割胶回收并定量。反应体系:,,,,,,,,,,,,,产物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

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