荧光标记法比较4种表面处理方式种植体骨矿化沉积率的研究_戚娟娟

荧光标记法比较4种 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面处理方式种植体骨矿化沉积率的研究_戚娟娟 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 荧光标记法比较4种表面处理方式种植体骨矿化沉积率的研 究_戚娟娟 ?302?广东牙病防治2012年6月第20卷第6期 ?硕博专栏? 荧光标记法比较4种表面处理方式种植体骨矿化 *沉积率的研究 ,,,，徐平平，黄晓虹，梁彩英，刘丹，黄建生,戚娟娟, 南方医科大学附属口腔医院?广东省口腔医院，广东广州(510280) 【摘要】目的荧光标记法观察比较4种表面处理方式种植体周围骨矿化沉积率的差异。方法微创拔除4只Beagle犬双侧下颌4颗前磨牙，待拔牙创愈合3个月后，植入奥齿泰种植体40颗，其中机械形态表面(ma-chinedmorphology，MM)组4颗，SA)组、喷砂加酸蚀(sandblastedwithaluminaandacidetched，可吸收性研磨介质(resorbableblastingmedia，RBM)组和生物化学喷砂酸蚀组(biochemistrysandblastedwithaluminaandacidetched，Bio-SA)组各12颗，愈合3个月，处死前13、14d和3、4d分别注射盐酸四环素和钙黄绿素，制取标本并置于70%酒精固定，采用塑料包埋技术制作骨磨片，荧光显微镜下观察，测量骨矿化沉积率。结果螺纹间及远离螺纹区域新骨矿化沉积率在4组间的差异均没有统计学意义(P,0(05);单独比较每组种植体螺纹间及远离区域 RBM组及SA组组内差异没有统计学意义(P,0(05)，SA组组—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 内差异具骨矿化沉积率的差异性，而MM组和Bio- 有统计学意义(P,0(05)。结论采用塑料包埋技术，通过荧光 标记法能成功观察到新骨矿化沉积的情况;种植 4种不同粗糙程度的种植体螺纹间及远离螺纹区域骨矿化沉积率 没有差异性，体植入3个月后，而经机械形态表 面处理的种植体和生物化学喷砂酸蚀处理的种植体，螺纹间骨矿 化沉积比远离螺纹区域快。 【关键词】骨整合; 【主 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 词】骨整合;种植体;塑料包埋;骨矿化沉积率;荧光观 察荧光牙种植，骨内;塑料包埋;钙化，生理性; 【中图分类号】R783(1【文献标识码】A【文章编号】1006, 5245(2012)06,302,06 【引用著录格式】戚娟娟，徐平平，黄晓虹，等(荧光标记法比 较4种表面处理方式种植体骨矿化沉积率的研究( 2012，20(6):302-307(广东牙病防治， Comparisonofbonemineralappositionratesofimplantationsof4surfacetrea tmentmethodsbyusingfluores-cencelabelingmeasuringmethodQIJuan-jua n，XUPing-ping，HUANGXiao-hong，LIANGCai-ying，LIUDan， HUANGJian-sheng(TheAffiliatedStomatologicalHospitalofSouthernMedi calUniversity,GuangdongProvincialSto-matologicalHospital， Guangzhou510280，China —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 【Abstract】 ObjectiveTocompareandobservethedifferencesofbonemineralappositionratesaroundtheimplanta- Fourpremolarsoftionsbyadoptingtheplasticembeddingtechniqueandusingthefluorescencelabeling(Methods 4Beagledogswereremovedbyminimallyinvasivetechnology(After3mont hsofthehealing， totally40OSSTEMwereimplantedwhichweredividedinto4groups: machinedmorphology(MM)(4teeth)， sandblastedwithaluminaandacidetched(SA)(12teeth)， resorbableblastingmedia(RBM)(12teeth) andbiochemistrysandblastedwithaluminaandacidetched(Bio-SA) (12teeth)(Hydrochloridetetracyclineandcalciumcalceinwererespectivelyinjectedintothedogs13or14daysand3or4daysbeforetheyweresacrificedafterthe3-monthhealing(Specimenswereputinto70%alcoholfixed; groundboneslidesweremadebyadoptingtheplasticembeddingtechniqueandtransferredtofluorescencemicro-scopetoobserveandmeasurethebonemineralappositionrate(ResultsNosignificantdifferencewasfoundamong4groupsintermsofthemineralappositionrates(MAR) ofnewboneintheareawithinthethreadorfarawayfromthethread(P, —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 0(05)(WhenseparatelycomparingMARdifferenceofimplantationthreadandthatawayfromtheareaineachgroup， groupRBMandgroupSAhadnostatisticssignificanceofwithin-subjectseffects(P,0(05)， whilegroupMMandgroupBio-SAshowedsignificantdifferenceofwithinsubjectseffects(P, 0(05)(ConclusionThroughtheflu-orescencelabelingandadoptingtheplasticembeddingtechnology， thesituationofthenewbonemineralizationapposition*基金项目:广东省 科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2008B030301185) E-mail:huangjiansh@263(net,,戚娟娟:南方医科大学在读 研究生,,,通讯作者:黄建生 广东牙病防治2012年6月第20卷第6期?303? couldbesuccessfullyobserved((Thestudyshowedafter3monthsimplantin gthenewbonemineralappositionwithinthebutthenewbonemineralappositionratewith-threadandfarawayfromthethreadin4groupsimplantshadnodifference， inthethreadofgroupMMandgroupBio-SAwasfasterthanthatfarawayfromthethread(【Keywords】Osseointegration;observation 【MeSH】Osseointegration;Fluorescence —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ Dentalimplantation，endosseous; Plasticembedding; Calcification，physiologic; Implantation; Plasticembedding; Bonemineralappositionrate; Fluorescence 骨整合是种植义齿获得成功的关键，也是保证其长期稳定性的基础。随着种植体表面处理方式的改进，种植体更容易获得良好的初期稳定性，有利于新骨的生成。不同的种植体表面处理方式可导致种植体的粗糙程度发生变化，表面形貌发生改变，从而影响骨整合的形成。目前可以通过物理或化学的方包括表面加成法，如钛浆法对种植体表面进行处理， TPS)和羟基磷灰石涂层(titaniumplasmasprayed， (hydroxyapatite，HA)涂层;表面减去法，如利用可吸 RBM)和喷收性研磨介质(resorbableblastingmedia， large-grit，acid-砂,大颗粒,酸蚀(sandblasted， SLA);另外还有表面轰击法(电子束热处理etched， 和激光处理)和表面氧化法(阳极氧化法和微弧氧化法) 等。处理过的表面有利于细胞的生长及附着，与骨组织具有更强的亲和力和适宜的电势能。种植体新骨形成的速率主要通过骨矿化沉积率衡量 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ ,2, ,1, ， 骨矿化沉积率可以反映成骨细胞及类骨质在一定时 期的矿化活跃程度，也可以反映改建阶段成骨速度的快慢。本研究采用塑料包埋技术制作组织磨片，打磨抛光后进行荧光观察，通过测量荧光带间的距离比较骨矿化沉积的快慢，比较4种不同表面处理方式种植体骨矿化沉积率的差异性，为临床种植技术提供理论依据。11(1 材料和方法种植体 MM组种植体表面采用机械处理方式形成光滑表面，表面粗糙度Ra为0(1,0(5μm。 RBM组种植体表面处理是在机械加工好的钛表面，利用生物相容性良好的HA粉末高压喷射形成粗糙表面。嵌入到表面内的HA粉末可通过喷砂后洗涤工序完全去除。处理后的种植体表面粗糙度Ra为1(2,1(8μm。 SA组种植体表面处理是以250,500μm粒径的氧化铝(alumina)颗粒高压喷射在机械加工钛表面，形成表面粗糙度Ra为2(4,2(8μm的表面后，浸泡在高温的硫酸、盐酸混合溶液内形成数微米大pit)。小均匀的微孔(micro-Bio-SA组种植体是在SA组种植体表面处理的基础上形成小于10nm的超薄HA膜，可提高初期骨结合性能，表面膜参与生物可吸收性改建。该组种植体表面粗糙度Ra为2(5,—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 3(0μm。 所有的种植体均由韩国奥齿泰公司惠赠，采用OsstemSS?种植系统，种植体直径4(1mm，长度10(0mm，根据表面处理方式不同分为4组，其中机 MM)组4颗，械形态表面(machinedmorphology，喷砂加酸蚀(sandblastedwithaluminaandacidetched， SA)组、可吸收性研磨介质(resorbableblastingRBM)组和生物化学喷砂酸蚀(biochemistrymedia， sandblastedwithaluminaandacidetched，Bio-SA)组各12颗。颈部高度1(8mm，螺纹间距离0(8mm，螺纹高度0(35mm(图1) 。 ?304?广东牙病防治2012年6月第20卷第6期 1(2实验动物1(7包埋切片 4只健康成年Beagle犬，动物质量合格证号SCXK(粤)2009-0009，由高要市康达实验动物科技犬龄12,14个月，体重14,18kg，有限公司提供， 体检各项指标正常。口腔无龋齿、无急性炎症反应、无牙周炎等，咀嚼关系良好，独立圈养，饮食定时定量。1(3 实验材料 微创拔牙刀(Direta公司，瑞典)，直径4(1mm、长度10(0mm的4种不同表面处理方式奥齿泰SS?种植体(奥齿泰公司，韩国)(表1)，盐酸四环Leica1600切片素和钙黄绿素(Sigma公司，美国)，机—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ (Leica公司，德国)，荧光显微镜(Olympus公司，日本)。 表1 组别MM组RBM组SA组Bio-SA组 将固定好的标本流水冲洗12h，酒精梯度脱 ,7,8, 。再以氯仿溶液浸泡3d，水调配浸泡液?、?、?液，将标本转移至10mL小烧杯内各浸泡2d，每 间断进行。浸泡后的标本更换包埋天抽真空4h， 液，置入4?冰箱过夜，封口胶盖紧烧杯口，并预留 出数个直径3mm的微孔以利于气泡排溢。次日转至水浴箱恒温28?静置1d，逐级升温至32?、37?、42?、48?、50?，大约5d完成最终聚合。敲碎烧杯，修整标本，调整标本的方向，通过Leica1600切片机切片，使刀片水平通过种植体的中央，切片厚约200μm，手工磨片，以砂纸逐级打磨光滑，以石蜡油降温，打磨至50,70μm。无水乙醇清洗磨片条带。 ,9, ，超声荡洗以备荧光下观察骨矿化沉积的 4组种植体表面粗糙度及数量 表面粗糙度Ra(μm) 0(19?0(021(36?0(142(55?0(332(63?0(43 4121212 x?s珋 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 数量(颗) 1(8测量指标 将标本转移至荧光显微镜观察，盐酸四环素呈 钙黄绿素呈现亮绿色荧光条带。橙黄色荧光条带， ProPlus6(0软件测量2条荧光条带之间应用Image-的距离。选择种植体螺纹间和螺纹外各10个荧光区域测量(图2,5)，每个荧光区域取10个数值，测 量3次取平均值。 骨矿化沉积率=2条荧光条带之间的距离/给药 ,10, 间隔时间，即为新骨矿化沉积的速率。1(9 统计学分析 应用SPSS16(0软件对螺纹间及远离螺纹区域骨矿化沉积率测量结果进行分析，采用单向方差分 1(4 种植体表面形貌观察 RBM组、SA组、Bio-SA扫描电镜下观察MM组、 组种植体表面形貌。 拔牙、植入种植体 4只Beagle犬先用速眠新0(08mL/kg作后腿肌 1(5 待麻醉起效后，用3%戊巴比妥钠按肉麻醉， —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 0(8mL/kg作腹腔注射,3,，口内双侧下颌前磨牙区采用Direta微创拔牙刀切断牙必兰局部浸润麻醉， 拔除牙齿后可吸收线缝合，术后1,3d予以肌周膜， ,4, 肉注射青霉素80万单位/d。 3个月后，自牙槽嵴顶切开翻瓣，每只Beagle犬 RBM组、随机植入10颗种植体，其中MM组1颗，SA组和Bio-SA组各3颗，种植体颈部1(8mm位于 牙槽嵴顶上，扭力矩为35N?cm，接入覆盖螺丝，开放式愈合3个月。所有种植体植入手术由1位资深种植专家完成。1(6 制取标本 4只Beagle犬均于处死前13、14d按30mg/kg 以P,0(05为差异析和t检验。检验水准α=0(05， 有统计学意义。22(1 结 果 种植体表面形貌观察MM组、RBM组、SA组、Bio-SA组种植体表面扫 描电镜观见图6,9。2(2大体观察 4只Beagle犬术后创口愈合良好，种植体无松动，无脱落。制取的40个包含种植体及其周围组织的独立标本，经塑料包埋后组织块致密坚硬，晶莹透亮，能清晰观察到组织的形态。标本经切片、手工—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 磨片后能成功观察骨矿化沉积的条带。2(3 骨矿化沉积率比较 4组种植体螺纹间以及远离螺纹区域均能呈现黄、绿2种颜色的荧光条带(图10、图11)。 种植体螺纹之间、远离螺纹区域的骨矿化沉积 颈部皮下注射10mg/mL四环素，处死前3、4d按 10mg/kg颈部皮下注射10mg/mL钙黄绿素,5,6,，四环素和钙黄绿素的给药间隔时间为10d。予以全麻下心内空气栓塞而死，将下颌骨整段去除，固定于标将每个含有种植体的标本切割成12mm×本夹， 15mm×18mm大小，置于70%酒精固定3d。 广东牙病防治2012年6月第20卷第6期?305? 率在4组间的差异均无统计学意义(P,0(05)。 RBM组和SA组，螺纹间和远离螺纹区域骨矿化沉积率的差异均无统计学意义(P,0(05);而MM SA组，组和Bio-螺纹间和远离螺纹区域骨矿化沉积 率的差异均具有统计学意义(P,0(05)，表明上述2组螺纹间骨矿化沉积快过远离螺纹区域(表2) 。 表24组螺纹间及远离螺纹区域骨矿化沉积率 比较 x?s，珋μm/dt值2(5681(4611(4032(175—— —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ P值0(0150(7640(0600(032—— 速率减慢，板层骨逐渐矿化，密度增高;三是骨成熟及稳定阶段，大约在第18,54周，此阶段种植体周新生骨逐渐减少，骨小梁重新排列，围骨组织成熟，骨密度增大。 荧光标记观察是一种常用的测量骨矿化沉积率的方法。盐酸四环素和钙黄绿素是常用的荧光标记物，常用于骨的生长代谢、新骨生长方向、形成定位及矿化沉积速率检测等研究。二者均能与无定在荧光显微镜下分别显示橙黄色形的磷酸钙螯合，,13, 和亮绿色荧光带。 本实验比较3个月后4组不同表面处理方式种植体周围骨矿化沉积率发现，4组螺纹间及远离螺可能是纹区域骨矿化沉积率差异没有统计学意义， 由于4只Beagle犬个体差异性较小，也可能由于远离种植体螺纹区域骨改建初步完成。Wennerberg,14, 等认为种植体表面的表面粗糙程度Ra,1(0μm为光滑，Ra,1(0μm为粗糙。按粗糙程度 0(5,1(0μm是微粗糙，1(0,2(0μm是中度粗分， 2(0,3(0μm是高度粗糙(多孔种植体表面除糙， ,15, 外)。Schneider等认为粗糙的种植体表面更容易增加种植体骨接触，适宜粗糙程度的沟嵴形态能引导骨生长，粗糙的表面能影响纤维粘接蛋白的表达， —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ ,12, 组别MM组RBM组SA组Bio-SA组F值P值 螺纹间2(901?0(2062(928?0(3032(920?0(3203(076?0(311 0(7340(533 远离螺纹区域2(555?0(7032(766?0(2332(743?0(2952(780?0(355 0(6470(590 3讨 论 目前，种植体表面材料改性已经成为研究的热 其目的点之一。改变种植体表面有多种处理方式，是为了增加种植体表面接触面积及粗糙程度，改变种植体表面成分及形貌，提高种植体骨组织结合及软组织结合。本实验改变种植体表面的粗糙程度，于3个月后检测种植体表面的成骨效能。种植体植入后愈合过程通常分为3个阶段 ,11, :一是创口的愈 合和编织骨的形成，大约在第2,6周，此阶段有新 并随着时间的延长骨密度逐渐增高;二是层骨形成， 板骨的致密与改建阶段，大约在第6,18周，这个阶 段形成稳定的种植体,骨结合界面，新生骨的生成 —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ ?306?广东牙病防治2012年6月第20卷第6期 使种植体表面碱性磷酸酶活性和骨钙素增高，形成快速稳定的骨结合。通常认为种植体周围新骨的形成在前3个月矿化沉积速度较快。本实验发现，种 单独比较每组远离螺纹区域及植体植入后3个月， MM组、Bio-SA组差异具螺纹间的骨矿化沉积率时， 有统计学意义，显示种植体周围仍然存在活跃的骨改建。Grizon等 通过动物实验比较光滑表面和粗糙表面的种植体发现，3个月和6个月时骨量形成 ,16, 而12个月和18个月时粗糙表面的种植没有差异， 体仍然存在强烈的骨反应和改建活动。本实验结果显示RBM组和SA组骨改建活动可能暂时处于稳定 SA组螺纹间存在活跃的骨改状态;而MM组和Bio-尚不能确定其原因是光滑表面骨改建缓慢，还是建， 粗糙表面具有骨引导作用。可以通过测量种植体-implantcontact，BIC)及显微CT骨参骨结合率(bone-数分析进行更加深入的研究 。 采用四环素和钙黄绿素双色荧光标记法，能成 功测量新骨矿化沉积的速率和观察骨的生长状况。本实验证明，种植体植入3个月后，4种不同粗糙程度的种植体螺纹间及远离螺纹—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 区域骨矿化沉积率差异性不明显。今后的研究可选择不同时间点来进行动态观察，同时也应对种植体周围组织成骨效应组 织学测量及显微CT骨分析进行长期的观察研究。 参考文献 ,1,唐霞，王少安(种植体的表面改性与促进成骨(国际口腔医学杂 2008，35(S1):225-228(志， ,2,FoleyCH，KernsDG，HallmonWW，etal(Effectofphosphate treatmentofacid-etchedimplantsonmineralappositionratesnearim- 广东牙病防治2012年6月第20卷第6期?307? 2007，13(7):486-矿化沉积速度的研究(中国骨质疏松杂志，489( ,11,宿玉成(现代口腔种植学(北京:人民卫生出版社，2004:53-56(,12,TanakaM，EjiriS，ToyookaE， etal(Effectsofovariectomyontra-2002， 37becularstructuresofratalveolarbone(JPeriodontalRes，(2):161-165( ,13,李青南(骨质疏松实验动物研究,骨组织形态学计量学(成都: 2001:24(四川大学出版社， ,14,WennerbergA，HallgrenC，JohanssonC， etal(Ahistomorplomet-ricevaluationofscrew-shapedimplantseachprepa redwithtwosur-1998，9(1):11-19(faceroughnesses(ClinOralImplantsRes， —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ ,15,SchneiderGB，PerinpanayagamH，CleggM， etal(Implantsurface 82roughnessaffectsosteoblastgeneexpression(JDentRes，2003，(5):372-376( ,16,GrizonF，AguadoE，HuréG，etal(Enhancedboneintegrationof implantswithincreasedsurfaceroughness: alongtermstudyinthesheep(JDent，2002，30(5/6):195-203( (收稿日期:2012-03-28) plantsinadogmodel(IntJOralMaxillofacImplants，2010，25(2):278-286( ,3,罗亚桐，刘铭，刘勇，等(戊巴比妥钠与速眠新和戊巴比妥钠对家 2006，4(1):78-犬麻醉效果的比较(湖南师范大学学报:医学版，79( ,4,黄元瑾，章锦才，刘曙光，等(种植体周围骨缺损的Beagle犬动物 2010，31(18):2340-2342(模型的建立(广东医学， ,5,HembreeM，BuschangPH，CarrilloR，etal(Effectsofintentional damagetotherootsandsurroundingstructureswithminiscrewim-plants(AmJOrthodDentofacialOrthop，2009，135(3):280(e1-9(,6,BriscenoCE，RossouwPE，CarrilloR，etal(Healingoftheroots —————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ andsurroundingstructuresafterintentionaldamagewithminiscrew2009，135(3):292-301(implants(AmJOrthodDentofacialOrthop， ,7,王东胜，刘洪臣(带种植体骨磨片技术(中华老年口腔医学杂志， 2009，7(6):360-362( ,8,王东胜，刘洪臣，吕燕，等(手工制作带种植体骨磨片的常见问题 2008，9(4):244-246(及处理(口腔颌面修复学杂志， ,9,吴哲，马冬丽，洪丽华，等(不脱钙的牙齿骨骼塑料包埋制片技术 2006，24(6):564-565(及方法探讨(华西口腔医学杂志， ,10,李晓红，朱晓姝，赵献银，等(荧光标记拔牙创口骨愈合过程中 (编辑孟波) ?硕博专栏? Dicer蛋白在口腔癌中的表达及其临床意义* ,,, ，曾曙光,，黄泽明，柳磊，杨静，栾修文，周会喜，刘曙光，艾伟健魏柳琼, 南方医科大学附属口腔医院?广东省口腔医院，广东广州(510280) 【摘要】目的OSCC)临床病理通过研究Dicer蛋白表达水平与口—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 腔鳞状细胞癌(oralsquamouscellcarcinoma， 20例白斑、10例癌旁非利用免疫组化法对76例OSCC、 特征的关系探讨其在OSCC发展过程中的作用。方法 NAT)样本的Dicer酶表达进行评估研究。利用Image-ProPlus6(0肿瘤性口腔上皮(normaladjacenttothetumor， MOD)，SPSS14(0软件系统分析Dicer蛋白MOD、图像分析系统计算平均光密度值(meanopticaldensity，阳性细PP)与临床病理参数的关系。结果胞百分比(percentageofpositivecells， OSCC、NAT的Dicer蛋白白斑组织、 Dicer蛋白表达上调可能 MOD、PP依次递减，三者间差异有统计学意义(P,0(05)。Dicer过度表达与肿瘤分期呈正相关关系(P,0(01)，与淋巴结转移存在正相关关系(P,0(05)，与年龄、性别、分化程度无相关关系。结论通过影响OSCC的生长以及淋巴转移而参与OSCC的发生发展。【关键词】口腔鳞状细胞癌;【主题词】癌，鳞状细胞;【中图分类号】R739(820(6):307-312( Dicer; 免疫组化免疫组织化学 【文章编号】1006,5245(2012)06,307,06 白斑，口腔; 【文献标识码】A 【引用著录格式】魏柳琼，2012，曾曙光，黄泽明，等(Dicer—————————————————————————————————————— ------------------------------------------------------------------------------------------------ 蛋白在口腔癌中的表达及其临床意义(广东牙病防治， *基金项目:广东省国际合作项目(1211422700001) E-mail:sunrisez@live(cn ,,魏柳琼:南方医科大学在读硕士研究生,,,通讯作者:曾 曙光 ——————————————————————————————————————