噬菌蛭弧菌及其生态制剂的研究在水产养殖上的应用

噬菌蛭弧菌及其生态制剂的研究在水产养殖上的应用 噬菌蛭弧菌及其生态制剂的研究在水产 养殖上的应用 噬菌蛭弧菌及其生态制剂的研究在水产养殖上的应用2011-02-15 14:51噬菌蛭弧菌(下简称蛭弧菌)是Stolp和Petzold1962年[1]首次在德国的土壤中于一种植物假单胞菌上发现的一类细菌的寄生菌。它比通常的细菌要小，有似细菌病毒(噬菌体)的作用，但不是病毒，具有细菌的特性。"寄生"和"裂解(溶菌)"宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。1982年[2]作者等在我国首次发现并及时报道了蛭弧菌的研究。近半个世纪来，国内外许多研究人员对蛭弧菌的分类学、细胞学、免疫学、生理学、生物化学、分子生物学、生态学以及蛭弧菌与宿主菌的相互作用等进行了系统的研究。至今已发表论文800余篇。 蛭弧菌的基本特性 蛭弧菌的基本特性可概括为如下几点:(1)一般呈弧、杆状，有时呈螺旋状;(2)菌体狭小，宽约0.3-0.45μm;?端生鞭毛，很少多于1根，鞭毛带鞘，并着生于一端;?革兰染色呈阴性;?严格好气;?化能有机型;?含有DNA，并具有高度同源性，G+C含量为42%-51%;?明显而稳定地分解蛋白质;?通过TCA循环进行代谢;?一般不能分解利用碳水化合物，而利用肽、氨基酸作为碳源和能源。不能利用环境提供的营养而生长，必须在宿主菌细胞内或其抽提物中才能生长、发育、繁殖，最后使宿主菌裂解;?具有双形性的发育史，有鞭毛交替，捕食性的类弧菌游动子(能用鞭毛尖端附着寄生细胞)，无鞭毛螺旋状营养阶段(通常在寄生细胞内);?能够进入到宿主细菌内，并在那里发育、繁殖或具有某种遗传力。其中寄生性和溶菌性是蛭弧菌一个重要的标志。 蛭弧菌的生态学及在自然界中的作用 蛭弧菌广泛存在于自然界，土壤、河水、近岸海水以及下水道的污水中都有它们的分布，可是干净的井水、矿泉水、自来水中都很难找到蛭弧菌的存在。一般污水中含量为105PFU/ml，土壤中含菌数为103-105PFU/g，淡水、海水中含菌量仅为50PFU/ml。据日本报道下水道污水中含蛭弧菌含量可高达每毫升数万个。然而它们在自然界究竟起什么作用呢?有人归纳为两个方面:?由于蛭弧 菌具有寄生和溶菌能力，所以有可能利用这种拮抗作为同致病菌作为斗争的有力武器。有实验指出，将浮游球衣菌和水稻白叶枯病菌加入灌溉水中，便成为蛭弧菌的"食料"，结果致病菌大大减少了。另外，蛭弧菌还对大豆疫病假单胞菌有较强的侵染力。?由于这类菌广泛存于污水中，它对污水中常见的大肠菌具有寄生性，同时对污水中的弧菌属、志贺菌属、沙门菌属等细菌消除亦起重要作用，因此有人把蛭弧菌作为河流水域污染程度的一项最好指标。另一方面，它在水源自净方面无疑也起着十分重要的作用。苏联Pushchino污水处理厂用蛭弧菌净化污水的研究已取得成果。 近年来，许多实验室对蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然环境河水中的某些肠道致病菌方面，做了许多卓有成效的探索工作。目前已证实，蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属、球菌属等均有很高的裂解活性，特别是对弧菌属、沙门菌属和志贺菌属。进一步研究发现，蛭弧菌对自然河水中的副溶血弧菌，溶藻弧菌，海弧菌，河弧菌，鳗弧菌，拟态弧菌，嗜水气单胞菌，恶臭假单胞菌，屈挠杆菌，发光杆菌，伤寒沙门菌，大肠杆菌，等均有显著的净化作用。 》蛭弧菌在水产养殖上如何应用? 1蛭弧菌的研究 1.1蛭弧菌生物学特性的研究 蛭弧菌的噬斑透明，无菌落形成。蛭弧菌的菌株不同，其噬菌斑的形态、大小也不同，大的直径可超过15mm，小的直径只约0.5mm(48h)，而且可随培养时间的延长而扩展。蛭弧菌培养于4?环境中，大多数蛭弧菌可出现噬菌斑。 在液体中培养、增殖蛭弧菌，蛭弧菌能侵染、裂解宿主菌，3-5天使浓厚的宿主菌悬液裂解、澄清，蛭弧菌的数目增加。但是用这种方法增殖蛭弧菌，很难得到高效价的蛭弧菌培养物，即使在澄清的蛭弧菌培养液中反复的补充宿主菌，也不能达到高效价的增殖蛭弧菌的目的，原因尚不清楚，有待进一步研究。 蛭弧菌噬菌斑革兰染色高倍镜观察，可见典型的、多量的革兰阴性、小的弧或杆状细胞。蛭弧菌噬菌斑悬滴相差显微镜下可见到运动极其活泼，呈跳跃式积极追捕宿主的蛭弧菌细胞，在相差显微镜下，可以连续观察到蛭弧菌吸附、侵染、进入、增殖、生长、裂解宿主细胞的全过程。 电子显微镜负染透射镜观察，可见到弧状或杆状蛭弧菌细胞，细胞一端有一长的单鞭毛。还可见到蛭弧菌吸附在宿主菌细胞上的典型形态。超薄切片电镜观察,可见到蛭弧菌在细胞内生长、繁殖的结构。 pH对蛭弧菌生长及噬菌斑形成有明显的影响，虽然pH在3.0-9.8的自来水宿主菌双层琼脂平板上均可形成噬菌斑，而pH7.6最为适宜。 呼兰等从人粪便分离获得的蛭弧菌最适pH为7.0，pH9.0不能形成噬菌斑，其原因有待进一步检查。 蛭弧菌在4-37?环境中形成噬菌斑，20-30?时对大多数菌株的噬菌斑形成更为适宜。少数菌株(Bd59)37?更为适宜。人粪便中分离的蛭弧菌也是以37?最为适宜。在4?冰箱中也能形成噬菌斑，但需较长时间(如12天以上)。近来研究发现，极少数菌株可诱导至43?中生长。 从自来水宿主双层琼脂平板中蛭弧菌形成噬菌斑数目来看，蛭弧菌生长繁殖的最为适宜温度为25?。温度较高，如37?时蛭弧菌数目反而逐渐减少，并失去活力。但于4?冰箱中可继续生存，培养至第4天增殖数量为最高，此后反而减少。 蛭弧菌培养物不耐热，如蛭弧菌Bd81、Bd98，15-25?以上时乃呈渐渐失活的现象，如以25?2小时，蛭弧菌的活存数目为100%计，则15-20?时呈较为稳定状态，存活数分别为94.9%-100%(Bd81);30，35，40，45及50?是时存活率依次为78.0%，62.7%，40.7%，30.5%和0%。 蛭弧菌在污水自净过程中参与作用的研究结果证明，蛭弧菌裂解作用可降低污水中异养性革兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量。这种裂解活性明显地受温度影响，因为温度可影响寄生菌与宿主菌之间相互作用的速度，在水温为26?时寄生物/宿主(P/H)的指数最大，而在19?时最小。当污水在26?时，沉淀池污 水中含大肠杆菌为800CFU/ml，而在19?时，含大肠杆菌为4000CFU/ml，污水中相互作用的微生物数量发生变化，这是典型的P/H的关系。这些研究结果证明，在污水自净过程中，蛭弧菌在26?环境河水中可以有效地参与清除肠道微 ?时清除率低。 生物群，而在23.5 蛭弧菌于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上可比在未经处理的活的宿主菌双层琼脂平板上更迅速的形成噬菌斑，后者一般需40-48h才可出现噬菌斑。在加热及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h，形成噬菌斑的数目也大大增多。例如在100?加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍，Bd98增加约72倍，在80?加热致死的宿主菌中Bd81增加151倍，Bd98增加73。氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍，Bd98增加67倍。在这些宿主菌的琼脂平板中形成的噬菌斑也明显的小于在活菌平板上，形成噬菌斑的时间也较快(Bd81为28h，Bd98为36h)，数量也有增加(Bd98)或没有增加。在抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄青霉素及多粘菌素B)处理失活的宿主菌双层琼脂平板上，形成噬菌斑的时间差别不大，噬斑的数量与在活菌宿主菌双层琼脂上也不增加(Bd81)或差别不大(Bd98)。 实验结果证明，在加热致死的宿主菌上生长增殖的蛭弧菌，再接种在活的宿主菌琼脂平板上仍然恢复其生长特性和裂解的活力。 1.2蛭弧菌对不同科属细菌的宿主范围 从8株蛭弧菌在不同科属24株菌的琼脂平板上形成噬菌斑的能力试验中，发现蛭弧菌的宿主范围均较广，都可在自来水宿主双层平板中裂解较多不同科属的革兰阴性菌株及部分阳性菌株，于48h产生噬菌斑，从宿主范围看，不同的蛭弧菌株对宿主的选择并不相同。 司穉东等报道，蛭弧菌不但对人类病原菌有裂解作用，而且对许多植物病原菌也有较强的噬菌能力。如从上海近郊河水中分离的蛭弧菌对大豆疫病假单胞菌，白菜软腐菌和水稻白叶枯病黄单胞菌等均有较突出的裂解功能。 实验亦已证实，以10亿个菌的剂量对小鼠、豚鼠、家兔等不存在毒力和毒性作用。就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。有人指出，蛭弧菌外用有预防部分动物角膜炎的效果。呼兰、刘秉阳用福氏志贺菌感染豚 鼠角结膜，并同时滴加蛭弧菌107PFU。结果发现15只感染的豚鼠眼中有6只未发病，得到保护，其保护率为40%。另外部分未获得保护的豚鼠眼是否由于福氏志贺菌感染用量较大或其他原因，有待进一步探索。 1.3蛭弧菌培养物保藏方法的研究 蛭弧菌于灭菌自来水中，4?环境中保存，大部分蛭弧菌存活8个月以上，极少数菌株仅存活2个月。在自来水保存液中定时添加宿主菌，保持一定浓度，并不能使蛭弧菌不断增殖而延长时间。 蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中，于4?环境中存活时间。发现91天蛭弧菌的存活菌株占100%，157天或188天占91.7%，240天占67.7%，31天占58.3%，372天占50.0%，411天占25.0%，548天占16.7%，600天时全部检不出蛭弧菌。 用脱脂牛奶作保护剂冷冻干燥于4?冰箱保存蛭弧菌培养物，两年的存活率为100%，3年的存活率为81.8%。