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噬菌体展示技术服务 篇一:噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 关键词: 噬菌体展示 组装 融合蛋白 2008-07-21 00:00 来源:互联网 点击次数:3662 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体展示系统研究以及技术特点等，并跟踪了目前该领域的最新研究进展和发展前景。 关键词:噬菌体展示;组装;融和蛋白 1985年，Smith G P[1]第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因?，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。 另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。近年来，随着噬菌 体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。 一、 噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮,5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集 [2]。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 二、 噬菌体展示系统 2.1 单链丝状噬菌体展示系统 (1)P?展示系统。 丝状噬菌体是单链DNA病毒，P?是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个,5个拷贝P?蛋白[3]，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域[4-5]，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的 连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关[6]，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个P?蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端[7]。P?有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于P?蛋白的信号肽(Sg?)和N1之间时，该系统保留了完整的P?蛋白，噬菌体仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接 与P?蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整P?蛋白来提供。P?蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。 (2)P?及其他展示系统。 P?是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有2 700个左右P?拷贝[8-9]。P?的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配[2，10-11]，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型P?蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。 此外，尚有丝状噬菌体P?展示系统的研究报道[12]。P?蛋白的C端暴露于噬菌体表面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所掌握的文献来看，该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建，并取得了不错的筛选效果。 2.2 λ噬菌体展示系统 (1)PV展示系统。 λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成，每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。目前，用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶(465 ku)和植物外源凝血素BPA(120 ku)等[13]。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。 (2)D蛋白展示系统。 D蛋白的分子质量为11 ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面[13]。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。 2.3 T4噬菌体展示系统 T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。吴健敏等成功地 将大小约215 aa SOC/m E2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面[14]。令人值得关注的是，SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此，在用重组T4做疫苗时，它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景[14]。 三、 噬菌体展示技术的局限性 (1)在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。 (2)不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为 有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故 [15]。 (3)噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。 (4)由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。 四、结语 噬菌体展示技术经过近20年的发展和完善，已成为生命科学领域的一项重要技术，广泛应用于抗原抗体库的建立、药物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、疫苗研究、病原 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等[16] 生成过程，构建高亲和力抗体库。由于噬菌体展示技术实现了基因型和表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。另外，噬菌体展示技术已成为不经过免 疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类和动物疾病有诊断和治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段 篇二:噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 王浩11307110047 摘要:噬菌体展示技术可以将目标蛋白与噬菌体衣壳蛋白结合在一起形成融合蛋白，进而展示于噬菌体表面。该技术可以较好地保持被展示蛋白质的活性，因而在蛋白质研究中发挥着重要的作用。目前用于构建噬菌体展示系统的载体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体。这些系统不仅对构建cDNA文库很有帮助，还可在随机短肽文库的协助下研究蛋白质之间的相互作用。 关键词:噬菌体展示技术;蛋白质;文库;类型;原理;应用 1985年，美国Missouri大学的Smith G P首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程手段改造，他把EcoR?内切酶的部分基因片段与丝状噬菌体的次要衣壳蛋白p ?(protein ?)基因融合，获得的重组噬菌体能被抗EcoR?内切酶的 1抗体所识别，由此建立了噬菌体展示技术(phage displaytechnology)。通过近几十 年的发展，噬菌体展示技术已经有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体等展示系统，这些系统在在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相 互作用的研究等领域得到了广泛的应用，并显示了良好的应用前景。 1. 噬菌体展示系统类型 1.1. 单链丝状噬菌体展示系统 单链丝状噬菌体展示系统是利用了M13噬菌体独特的生命周期及其所表达的几个噬菌体蛋白质。它的单键DNA基因组由6407个核苷酸残基组成，编码10种不同的蛋白质，并被包装于约有2700~3000个拷贝数的基因编码的蛋白质p?的蛋白衣壳内。而且M13的尾部有一种3~5个拷贝的基因编码的蛋白质p?。2 1.1.1. p?展示系统(3~5个拷贝) p?基因主要编码病毒的次要衣壳尾丝蛋白。p?的可插入位点很多，所以其为多价展示系统，但这样就会造成蛋白质的异促效应，不易筛选到高亲和力的噬菌体。为了构建单价展示系统，人们将目的基因转入到噬菌粒(噬菌粒是由质粒与单丝噬菌体结合而构成的载体系列。它既具有质粒的特性和复制起点，又有噬菌体的特性和复制起点。3)中。由于噬菌粒没有噬菌体蛋白而难以形成真正的噬菌体，其需要辅助噬菌体。辅助噬菌体能提供将该DNA复制并包装成完整噬菌体所需的蛋白质。而由于该辅助噬菌体的复制起始点很低效，不足以和噬菌粒DNA抗衡，所以转录出的DNA大多数仍为噬菌粒DNA。通过在噬菌粒DNA和辅助噬菌体DNA上加上筛选标记，人们就可以很方便地筛选出被感染的大肠杆菌。而且不像其他大多数的噬菌体，M13在感染大肠杆菌后， 并不引起宿主细胞的裂解，而是使宿主细胞稳定地分泌出噬菌体颗粒。通过不断地进行免疫富集筛选，人们就能得到高亲和力克隆。4 1.1.2. p?展示系统(2700~3000个拷贝) p?基因编码主要的衣壳蛋白。由于其拷贝数多，可用于筛选亲和力较低的配体。相应的，如果用该系统展示较长肽链而形成空间阻碍的话，就有可能影响相关衣壳蛋白的合成，使得噬菌体失去感染力。 1.2. λ噬菌体展示系统 噬菌体λ是温和噬菌体，在其颗粒中，DNA是线状双链分子带有单链互补末端。末端12个可互补的核苷酸，称为粘性末端。当噬菌体λ浸入宿主细胞后，线状双链DNA分子借助粘性末端连结成环状分子。在感染早期，环状DNA分子进行转录。在此期间，噬菌体有两条复制途径可供选择:一是裂解生长。环状DNA分子在宿主细胞里复制若干次，合成了大量的噬菌体基因产物，形成子代噬菌体颗粒，成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体DNA整合进宿主菌的基因组，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。5成熟的噬菌体λ由头、尾两部分组成。 1.2.1 D蛋白展示系统 D蛋白为噬菌体λ头部必需蛋白，其可作为外源序列融合的载体，这种展示一般为N端展示。由于其在噬菌体颗粒表面呈突出 状分布，有利于配体在空间上接近，便于之后的筛选。D蛋白展示的体外组装途径是将D融合蛋白结合到噬菌体表面。体内组装途径是将含D融合基因的质粒转化入D蛋白缺乏放入菌株中，从而弥补溶源菌所缺的D蛋白;或将其整合到到噬菌体的基因组中。 1.2.2 展示系统 蛋白PV为噬菌体λ主要尾部蛋白，其C端折叠区为非必需的，所以可供外源序列插入而不会影响其正常的生理功能。 1.3. T4噬菌体展示系统 T4噬菌体与噬菌体λ较为相似，其DNA为双链线形，呈环状排列。但其表面包被着2种非必需外壳蛋白:SOC(主要为C端末)和HOC(主要为N端末)。SOC位点展示是通过一个重组载体，将融合有外源序列的SOC融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因组中，选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体，即可将外源肽或蛋白质展示于噬菌体表面。HOC位点展示则通过体外包装实现，将目的基因连接于hoc基因的C端，构建hoc 融合基因表达载体，并在IPTG 的诱导下表达HOC 融合蛋白。再将其与HOC缺失的T4噬菌体结合，就将其转移到该噬菌体上从而得到展示。由于这两者的缺失方式不同，就可以在同一噬菌体上通过不同的方式(DNA缺失及蛋白缺失)得到表达，即可实现SOC、HOC双位点的同时展示。此外，T4噬菌体的扁长型二十面体衣壳，使其系统容量大，可以体外组装，拷贝数高。6 1.4. T7噬菌体展示系统 T7噬菌体基因组为线性双链DNA，其主要有2种衣壳蛋白，10A和10B。由于10B的蛋白区在噬菌体表面，所以将其作为展示位点。T7噬菌体的功能性衣壳由10A与10B按不同比例构成，说明其有一定的容错性，可容纳变异体。展示的蛋白会通过C端融合，这样，即使插入的片段含有终止密码子也不会影响该蛋白的表达。另外，T7噬菌体展示系统可以以高拷贝量展示50个氨基酸的多肽，以低拷贝量(0.1~1/噬菌体)或以中拷贝量(5~15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质。这些多肽或蛋白质分别与相应亲和力区域结合，其实用性较强。 2. 噬菌体展示的原理 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬 菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱，经过3 轮,5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。7外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌 体DNA序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。 2.1 筛选步骤8:略。 3. 噬菌体展示的应用(与蛋白结构与功能相关的方面) 3.1 展示功能蛋白结构域 噬菌体随机展示技术被广泛应用于研究蛋白质与其他配基的相互作用。完整的蛋白质或结构域与噬菌体蛋白形成融合噬菌体，为研究结构与功能的相互关系提供了一个非常有效的工具。当蛋白质或功能亚基被表达于噬菌体表面，插入蛋白质的天然的四级结构就提供了一个具有广泛突变位点的用来限制折叠的框架(如:锌指结构)。即使用蛋白质上带有的锌指结构，让其与某些DNA作用，就可筛选出一些与其相互作用的噬菌体。 3.2 确定核酸结合蛋白及其相互作用 噬菌体随机展示技术可以筛选出一种有某些结构域的蛋白质，这些结构域可与DNA 结合而调控基因的表达。通过这种方法，可以发现更多的与DNA结合的结构域。此外，利用噬菌体展示技术还可以筛选出DNA 的模拟肽(模拟肽是一个具有广泛意义的术语，它指任意一个被设计并执行肽功能的化合物。一个生物活性模拟肽，具有与激素、细胞因子、酶底物、病毒或其他生物分子拈抗、刺激或是调节天然配体的生理活性的功能。9)。 3.3 研究蛋白质相互作用 噬菌体展示的多肽文库是由特定长度的随机短肽序列组成。用 靶蛋白质(如受体、抗体等)对该随机文库进行亲和淘筛，就可以获得与之结合的短肽序列。对所得序列测定分析，并合成相应的短肽，就可用来研究两个蛋白质之间的相互作用。 3.4 抗原表位分析 抗原表位分析技术是以单克隆抗体作为固相筛选分子，加入噬菌体随机多肽库，使其与单抗充分反应，经数轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，且每次增加筛选强度，用最后一次淘洗的噬菌体感染宿主菌。再随机挑选克隆，经噬菌体ELISA 鉴定并进行交叉反应实验和竞争抑制性实验，对所选的阳性克隆通过DNA 序列分析，就可以知道该噬菌体所携带的外源肽序列，从而得知该单抗针对的特异性抗原表位。 4 噬菌体展示技术的展望 噬菌体展示技术凭借着自己独有的优势及特点，在生物科学研究和应用中的前景已经逐渐地显示出来。以噬菌体展示抗原表位的优点有:(1)生产成本低廉。(2)有可能利用一种噬菌体展示两种抗原表位，这样便可开发出能同时诊断一种以上疾病的诊断抗原。(3)噬菌体颗粒可在相当长的时间内保持稳定，这一点对研究和应用非常适用。(4)可模拟天然多肽表位结构或功能。(5)噬菌体作为表位载体具有较好的免疫原性。10 但现在这项技术的某些方面并不完善，目前其主要的局限有:(1)受大肠杆菌 转化效率的限制，高效转化大肠杆菌的转化效率为107~108，故 一般肽库的容量只有109，高于此限制的基因难以表达，受到库容量的限制;(2)由于噬菌体展示技术依赖于宿主细胞内基因的表达，因此难以对毒性分子进行有效表达和展示;(3)编码肽的基因带有一定的偏爱性，决定了肽库的多样性受到局限;(4)氨基酸的修饰受宿主细胞的限制。 不过，随着噬菌体肽库的不断完善，对噬菌体展示技术认识地不断加深。这项技术必定会日臻完美，其应用的范围肯定会越来越广。 1刘相叶,邓洪宽,吴秀萍等.噬菌体展示技术及其应用[J].动物医学进展,2008,29(1):60~63. 2戴和平,高宏,赵新颜.噬菌体展示技术的原理和方法[J].水生生物学报,2002,26(4):400~409. 3杨安钢,刘新平,药立波主编.生物化学与分子生物学实验技术[M].北京市:高等教育出版社,2008:97. 4郭莉,汤永民.噬菌体展示系统的研究进展[J].医学分子生物学杂志.2005,2(3):205~209. 5冯志华,王全楚主编.新概念疫苗[M].北京市:人民卫生出版社,2004:45. 6李珣,任珍珍,钟国华.噬菌体展示技术在蛋白质研究中的应用[J].生命的化 学,2009,29((原文来自:wWW.hnboxu.Com 博旭 范文网:噬菌体展示技术服务)4):588~594. 7贾球锋,李丽芳,张映.噬菌体展示技术[J].动物医学进展,2006 ,27(2):101~103. 8吴雄文,梁智辉主编.实用免疫学实验技术.武汉市:湖北科学技 术出版社,2002:267~271. 9郭葆玉主编,生物技术药物[M],北京市:人民卫生出版社,2009:144. 10孙美艳,张磊,李艳.噬菌体展示技术的研究进展[J].吉林医学院学报,2009,30(2):97~99. 篇三:噬菌体展示肽库说明说 中文版 应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使 用 手 册 含tet选择性F因子的新大肠杆菌宿主菌: 不再需要minimal平板 贮存于:-20? 目 录: 简介 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2 培养基和溶液 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 常规M13方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..6 淘选程序(固定靶分 子)„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..8 结合克隆的特 征„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ „„„„..12 其他淘选方法(液相结合 法)„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..15 其他抗原表位作图方法(Protein A/G捕获法)„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..16 附录:优化肽结合相互作 用„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..19 文库的氨基酸分 布„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„..21 试剂盒组成: (如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20?保存): ? 随机十二肽噬菌体展示文库 100 μl, 1.5×1013 pfu/ml。贮存于含50%甘油的TBS溶液中。复杂度 ~2.7×109个转化子。 ? -28 gIII测序引物 5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/μl ? -96 gIII测序引物 5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/μl, 1 pmol/μl ? E.coli ER2738宿主菌 F’ lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk – m k– McrBC–)。该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70?。 ? 链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉 1.5 mg ? 生物素，10 mM 100 μl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。 该产品仅售为研究用，不得以任何形式进行商业再销售。用该类产品发现的序列的商业化可能需要来自Dyax公司的美国专利5,223,409、5,403,484和/或5,571,698及其相关专利权的授权。有关授权信息请与Dyax Corp. 的企业发展部主管联系: Director of Corporate Development, Dyax Corp., Bldg. 600, Cambridge, MA 02139, fax 617-225-2501。 概述: 噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板(或磁珠)共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体(见图1)。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用(7)和鉴定非肽配体的肽模拟型(8-11。)生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选(12)也可以在完整细胞上进行 淘选(13-15)。蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体(16)。另外，大的蛋白质分子[如:抗体(17)、激素(18)、蛋白酶抑制剂(19)、酶 (20)和结合蛋白(21)]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即:成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser组成，然后是 野生型pIII蛋白。该文库含有~2.7×10个电转化序列，用10 μl本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55个拷贝，对原始文库进行大量测序(见附录)表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。 NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列(见图2)。大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。 9 培养基和溶液: LB培养基: 每升含:10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压 灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal平板: LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70?时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平 板。平板4?避光贮存。 顶层琼脂: 每升含:10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2?6H2O, 7 g琼脂粉。高压灭菌，分成50 ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液:以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。-20?避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet平板:LB培养基 + 15 g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70?时，加入1 ml四环素贮 液，混匀倒平板。平板4?避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液:0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4?贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液: 将1.5 mg链霉亲和素冻干粉(本试剂盒提供)溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、 0.02% NaN3溶液中。4?或-20?贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal配方:将1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside) 和1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20?避光贮存 常规M13方法: M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。 菌株保存 1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。尽管 ER2738是一个recA菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。其他F的商品菌株如:DH5αF’和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。 2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F因子 正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予 该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。 3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37?培养过夜。用封口膜+++ 封闭平板后4?避光保存，最长可达一个月。 4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。只要不对培养 物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。 避免噬菌体污染 M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。 1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大 降低。 2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZα基因，当铺在含IPTG和Xgal的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些 噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。 测定噬菌体滴度 只有当噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远低于1时(即细胞过量时)，噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。 1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600 ~0.5)。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。 保存于45?备用。 3. 37?预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围:扩增的噬菌体培养物上清:10-10;未扩增的淘选洗脱物:10-10。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体， 快速震荡混匀，室温温育1-5 min。 将感染细胞加入4537?预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 待平板冷却5 min后，倒置于37?培养过夜。 2811145. 6. 7. 8. 9. 检查平板，计数有~10个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl 噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。 淘选程序 最简单直接的淘选方法有:直接将靶分子包被于塑材表面(通过非特异的疏水作用或静电相互作用)，洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面(见15页)或其他亲和介质上(见16页)。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。 第一天 根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板(或一个孔)。下述方法中给出的量是60×15 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量， 其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬 菌体数量都是相同的:1.5×1011个病毒子。 1. 准备100 μg/ml的靶分子溶液(溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3)。 如果需要稳定靶分子， 也可使用其他相似离子强度的缓冲液(含金属离子等)。 2. 每板(孔)加入1.5 ml(微孔板每孔150 μl)上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润(小 心不要使溶液溅出)。 3. 在增湿容器(如:排列有湿纸巾的可封口塑料盒)中4?轻微震荡，孵育过夜。平板可在 此容器中4?贮存备用。 第二天 4. 挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩 增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶(不要用50 ml锥形管)。37?剧烈震荡培养。 5. 倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板(或孔)加 满封阻液，4?作用至少1 hr。 6. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。 每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液， 倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)。此操作要快以避免板干燥。 7. 用1 ml(微孔板则用100 μl)的TBST缓冲液稀释4×1010的噬菌体(即10 μl的原始文库)， 然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。 8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。 9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。 10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml(微孔板则用100 μl)适当的洗脱缓冲液洗脱结 合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液(~100 μg/ml溶于TBS中)从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。 10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子:温和摇动>10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μ(微量孔则用l15 μl)1M HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。 11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量(~1 μl)洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第 二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。(必 要时可将剩余洗脱物4?贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中(用250 ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物。37?剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步)。 12. 剩余洗脱物应当被扩增:将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前 期)，37?剧烈摇动培养4.5 hr。 13. 将培养物转入一离心管中，然后，4? 10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管 中，再离心。 14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4?沉淀至少60 min，最好过夜。 第三天 15. 4?10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。 16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4?离心5 min使残余细胞沉淀。 17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。 4?离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。 18. 沉淀物重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转 入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。 19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4?贮存。 20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第四和第五天 21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-2×1011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。 22. 进行第二轮淘选:用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。 23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。 24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。 第六天 25. 进行第三轮淘选:用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-11，清洗步骤中同样用0.5% (v/v)的Tween。 26. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。第三轮洗脱物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选(可 选步骤，见附录)。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用:只要注意平板培养时间不要超过18小时，培养时间过长容易出现缺失。其余洗脱物4?贮存。 27. 挑一ER2738单克隆于LB-Tet培养基中培养过夜(不要接种稀释后的铺板培养物)。 对照淘选试验 按照上述程序，以链霉亲和素作为靶分子，在封阻液中加入0.1 μg/ml的链霉亲和素以结合BSA中混有的少量生物素。用0.1 mM的生物素(溶于TBS中)洗脱结合噬菌体，至少作用30 min。经三轮富集/扩增后，得到的链霉亲和素结合肽的共有序列应当含有如下基序: His-Pro-Gln (HPQ) (8)。 结合克隆的特征鉴定 噬菌斑的扩增 1. 将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1 ml到培养管中。每个要鉴定的克 隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取10个克隆便足以检测结合肽中的共有序列。 2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述1 ml培养管中。注意:要从总量不到100个噬 菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。 3. 37?摇床培养4.5-5 hrs(不要过长)。 4. 备选步骤。除测序单个克隆外，也可以对整个被选噬菌体集合进行测序。这样只通过一个 步骤就可以得到共有结合序列，但这种情况只是当公有序列元件出现在每个克隆的12残基“框架”内相同位置的时候。加10 μl未扩增的洗脱物到1 ml稀释的过夜培养物中，37?摇床培养4.5-5 hrs。 5. 培养物转入微量离心管中，离心30 sec。上清转入以新鲜管中，再离心。用移液器将80% 的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4?贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20?贮存。 测序模板的快速纯化(22) 本方法非常快速，无需酚或层析，可以产生足够纯的模板进行手工或自动双脱氧测序。 1. 按上述方法进行噬菌斑扩增，在第一步离心后，将500 μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。 2. 加200 μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10 min。 3.离心10 min，弃上清液。 4. 短暂离心，小心吸去残余上清。 5. 沉淀物彻底重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入250 μl乙醇。室温温育10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉 淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。