两种海洋生物多糖结构性质和1，6二磷酸果糖BZ振荡反应研究

两种海洋生物多糖结构性质和1，6二磷酸果糖BZ振荡反应研究 两种海洋生物多糖结构性质和1，6二磷酸果糖BZ振荡 反应研究 中山大学 博士学位论文 两种海洋生物多糖结构性质和1,6二磷酸果糖BZ振荡反应的研 究 姓名:胡谷平 申请学位级别:博士 专业:有机化学 指导教师:林永成 20060610中“大学博士论文 摘 要 本论文共分两部分,讨论了多糖的化学结构分析和一种单糖的振荡反应 机理研究。 论文的第一部分是关于两种海洋生物多糖的结构分析。在这一部分的前言中 对多糖的生物学意义及结构研究方法作了综述。糖类的研究是生命大分子科 学最 后一个重大前沿领域。多糖在生物体内重要的生物功能和良好的生物活性, 及其 在生命科学和医药中的巨大作用,使多糖的研究成为具有吸引力的研究领 域。海 洋生物的生活环境与陆地生物迥异,研究海洋生物多糖有其特殊意义。 在第章我们报道了在海洋软体动物翡翠贻贝中提取得到的一种新的多糖 ,并对其结构、性质和药理活性进行了详细深入的讨论。在治疗苯中毒的研 究中,翡翠贻贝多糖表现出较好的药理活性,主要有:可以明显的增加苯 中毒大鼠白细胞.数量,并且其升白作用存在剂量一效应关系。显著 的增加脾重量,提高脾指数, 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 可增强苯中毒大鼠的免疫功能。显著降 低丙氨酸氨基转移酶值,提示具有一定的肝功能保护作用。对苯 中毒大鼠异常升高的有显著的降低作用,提示其对苯中毒大鼠肾功能有一 定的保护作用。 经过酶解、脱蛋白、离子色谱和凝胶色谱等现代分离手段,从翡翠贻 贝的内脏中分离纯化出多糖。为白色吸潮粉末,易溶于水。比旋光度 【】.。. 分子量是.,总糖含量.%。经完全酸 水解,糖氰乙酸酯衍生化,气相色谱分析确定单糖组成为:鼠李糖.%岩藻 糖.%甘露糖.%葡萄糖.%半乳糖.%。元素分析和离子色谱 的结果证实中含有硫酸根,但含量很低。的甲基化结果表明:中有 ~和?两种连接方式。从高分辨核磁共振谱的研究,在 和”谱的异头氢碳区中,都有比例约为:的吸收峰。从而确定 的重复单元含有三种单糖。又根据这些峰的化学位移推断出单糖的构型均为 构型。根据这些结果,可以推断出的结构为一个含有少量硫酸取代的以 ?连接为主链的带有~连接侧链的葡聚糖,重复单元结构为:中山大学博士论 文 一???一。?一 下 ?? 在第章中我们研究了一种新的鲍鱼多糖,粘度法测定分子量为.。 元素分析结果,的硫酸根含量是的倍。完全酸水解后,糖氰乙酸酯衍 生化分析得出的单糖组成为:半乳糖.%葡萄糖.%甘露 糖.%。长期以来,多糖的研究方法进展缓慢。对多糖的结构缺少有效的破解 途径,尤其结构复杂的多糖更是如此。我们用乙酰解的方法对鲍鱼多糖进行 了研究。乙酰解后硅胶柱层析分离得到两部分,和,用核磁共振谱分析 得是一个。一构型的五乙酰化半乳糖。的核磁共振谱与的非常相似, 但各个峰都很宽。用串联质谱分析,得到是一个全乙酰化寡糖的混合物。 通过分析可以找到各个质谱峰对应的寡糖。从我们的研究可以看出乙酰解不仅可 以得到全乙酰化的单糖还可以得到一定的全乙酰化寡糖。这对多糖的结构研究具 有启发意义。 为了进一步研究糖类化合物与生物体的关系,本论文的第二部分讨论了, 二磷酸果糖的振荡反应。在这一部分的前言中,介绍了两种主要的生物化 学振荡:糖酵解振荡和过氧化物酶振荡。全面的综述了半个多世纪以来人们对这 两个振荡反应的实验现象和反应机理的研究和探索。此外,还详细的综述了研究 得最透彻的化学振荡反应振荡反应。总结了反应研究过程中提出的几 个主要反应机理。详细探讨了有机自由基控制机理的作用过程。 ,二磷酸果糖在生物体内是糖酵解过程的重要中间产物。糖酵解 中存在的振荡现象,是迄今为止研究得最透彻的生物振荡反应。而同时振荡 反应是现在研究得最透彻的化学振荡反应。我们首次将作为有机底物应用 在反应中。研究了各种影响因素对反应的影响的数量关系,并且推导了 基本的反应机理。比较这两种振荡反应我们可以看出,尽管反应体系有很大 不同, 但在周期上他们是有相近之处的,反应的周期为、糖酵解中为。 这或许蕴含着非生命过程和生命过程的一些共通之处。虽然在糖酵解中比 反应中要经历更复杂的变化,但结果是一样的,最终都被氧化分解放出能量。 在反应中,扮演着酶的角色,但显然效率不高,因此需要高的硫酸 中山大学博士论文 浓度帮助分解。在本论文中对两种振荡反应的关系的探讨还是很初步的,但 我信这是一个好的开始,对糖酵解振荡和振荡反应的研究会有一定的启 发作用。 为了给的反应积累数据,同时也为研究对有机物的氧化 作用,在第章里我们研究了氧化的反应。关于这个反应的研究还 未见报道。我们用经典的滴定的方法,测定了反应中速率常数的变化规律, 并且 推导出反应机理和动力学方程: 反应机理: ?』:? . ??&兰?‘ ‘??? 动力学方程: ?::【】 ?:。。:】】 : 嵩【】畔 是生物体内较常见的金属离子,对它的氧化研究一直较多。但还没有关 于氧化的报道。在第章中我们用停流反应器联用紫外光谱仪的 方法,详细研究了氧化的反应。得出了各种反应物对反应速度的 影响。推导出反应机理和动力学方程如下: 反应机理: ?』?十 “?鸟【?】 山【? 【?】十当。 【?】上。 中山大学博士论文 ’ ???? 动力学方程: /。【】 在第章中还同时研究了氧化果糖的反应。反应机理和是相同 的,但因为不同的反应特点得到了如下动力学方程式: 一/// 关键词:翡翠贻贝,鲍鱼,多糖,乙酰解,振荡,,二磷酸果糖,, ,氧化,反应动力学中山大学博士论文. .? . . . . . . . . , . . .×., ,?, ” . :??。??? ??, .×. .% .% .%。 ? . . ,。?. 中山大学博士论文. ?. .., , ,, .. , ,,,. , . . ? : “.旦? “里叫?】十 ?』王?【? 【?】?????‘ 【?】乌’ ’、??? : 一/。】 ??竖? ?,’中山大学博士论文 ‘?? : ?:【】 “。: 。 一 。志卿【聊】 】‘ :, ,自 . ,,,,,, 中山大学博士论文 缩略语表 葡萄糖 半乳糖 甘露糖 木糖 阿拉伯糖 岩藻糖 吡哺半乳糖 吡喃葡萄糖 吡喃甘露糖 吡喃木糖 吡喃岩藻糖 呋喃半乳糖 葡萄糖醛酸 呋喃半乳糖醛酸糖醛酸 氨基一脱氧.吡喃葡萄糖 一一? 三甲基硅醚基 甲基 乙酰基 ?别蒙诺索夫一扎博廷斯基,二磷酸果糖 ,一第章多糖研究进展 第章 多糖研究进展 .多糖的生物学意义 多糖作为天然大分子同核酸、蛋白质一样广泛存在于生物体中,根据其来源 可分为动物多糖,植物多糖,微生物多糖。一般来讲,由少于个单糖基组成的 糖为低聚糖也称寡聚糖。由多于种单糖基组成的糖为多糖。由于组成多糖的单 糖有更多的活性基团和手性原子,单糖之间可形成直链也能形成支链,并且有 和伊异构体,使多糖表现出复杂结构,种单糖则可以组成种不同的连接 方式的四糖,但种不同的氨基酸仅结合成种不同的四肽。多糖的复杂性还表现 在可以形成衍生化,如甲基化、乙酰化、硫酸酯化和磷酸酯化等。另一方面,在 生物体内,多糖还与其它物质如蛋白质、脂肪等形成糖复合物一一糖蛋白、糖肽 和糖脂。此外多糖链还具有较高的柔韧性,易受环境的影响发生构象变化,从而 实现分子之间的相互作用。上述这些分子特征和基础决定了游离多糖复合物 中寡 糖链能够编码大量的生物信息,使多糖成为最有魅力的信息载体。与蛋白质和核 酸相比,糖应是生命过程中最理想的信息载体,因为它能以最小的结构单元承载 最大的生物信息量】。多糖这种结构的复杂性也决定了多糖复杂多样的生物功 能和良好的生物活性。 .丰富的海洋多糖资源 海洋生物的生活环境与陆地生物迥异。海洋就像一个大“立体水球”,使海 洋生物处于高盐、高压、低温、低营养和无光照的环境中。在海洋特殊的生态环 境下,各种海洋生物依靠特殊的结构和功能维持其生命活动。海洋生物具有很强 的再生能力、防御能力和识别能力,以防范天敌的进攻及海洋共生菌的附着,并 维持物种之间的信息传递,这些独特的功能是与它们体内的生物成分分不开的。 海洋生物的多样性、复杂性和特殊性使源于其中的海洋天然产物也具有多样性、 复杂性和特殊性,这正为寻找海洋生物活性物质提供了丰富的物质来源【一。截 止目前,全世界范围内已从海洋动植物及微生物中分离得到新型化合物有 余种,其中申请专利的化合物余种【 。已发现的海洋生物活性物质种类繁多,第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 包括萜类、皂甙类、有机酸、多糖、蛋白质等等。从海洋生物中分离的多糖在组 成、结构和生理活性方面有其独特性能,为多糖的化学和生物学研究提供了丰富 的资源,为新药开发提供了宝贵的源泉。 硫酸软骨素 是结缔组织的基本成分,分布在脊椎动物、 棘皮动物、甲壳动物和软体动物中,海洋动物鲨鱼软骨中含量较多。是一种硫酸 酯化的酸性多糖,根据硫酸与.乙酰一半乳糖胺的结合位置的不同分为.硫酸 软骨素和.硫酸软骨素。硫酸软骨素具有降低血脂、抗动脉样硬化和抗凝血作用, 对心肌细胞有抗炎、修复作用,可用于因链霉素引起的听觉障碍,对冠心病、心 绞痛有一定的疗效。 ,是不合硫酸基的胞外多糖。可从海洋动物 透明质酸 的鲨鱼皮、鲸鱼软骨、心脏中提取。有保护、润滑作用,防止细菌及外力的 伤害。临床用于眼科手术、外伤性关节炎、骨关节和滑囊炎。又是理想的保湿剂, 常用于各种化妆品。 硫酸皮质素 是硫酸酯化粘多糖,除了.乙酰半乳糖胺. 硫酸与上.艾杜糖醛酸组成二糖链外,还含有.葡萄醛酸二糖链,.乙酰半乳糖 胺 .硫酸与一葡萄醛酸组成二糖链。主要分布在哺乳动物的结缔组织、皮等中, 从 鲨鱼皮中也可分出。它是一种通过肝素辅因子催化抑制凝血酶活性的糖胺聚 糖。 ... 从海鞘中分离出一种独特的海鞘硫酸皮质素的糖胺聚糖。用 软骨素裂解酶降解,用软骨素.硫酸酶和软骨素一硫酸酶分析结合和” 谱数据确定该糖的一级结构为: 【越一一?卢.?? 一般认为肝素辅因子?的结构是【一? 一一一?./. 】。通过比较哺乳动物硫酸皮质素和海鞘硫酸皮质素及化学多 硫酸化皮质素的抗凝血活性,发现尽管海鞘硫酸皮质素有高含量的 一?.. 残基,但没有明显的抗凝血活性和低的增强肝素辅 因子的能力,这个结果显示.?一肛.残基是硫酸皮质素抗凝 血活性关健基团。 刺参粘多糖 是从刺参体 壁细胞中提取的一种粘多糖,化学成分为氨基半乳糖、已糖醛酸、岩藻糖和 硫酸 第章多糖研究进展 酯基。实验表明有类似肝素的抗凝血作用,并能引起循环血液中血小板下降,增 强诱导的血小板的聚集作用。曾制成刺参酸性粘多糖钾注射液,对肿瘤生 长有明显的抑制作用,且有防肿瘤细胞转移作用【。对心脑血管等栓塞性疾病 的疗效不亚于肝素。从南海中分离的刺参酸性粘多糖也具有海参体壁酸性粘多糖 的共同特点和相似的功用。 玉足海参 粘多糖是用玉足海参的干燥的体壁为原 料,经碱消化,用钾盐和季铵盐分级沉淀和离解,分离提纯获得的一种酸性粘多 糖。是由氨基半乳糖、已糖醛酸、岩藻糖和硫酸酯基按一定比例组成的聚合物。 生物活性表明,该多糖对凝血酶有较强的抑制作用,也可以抑制多种小鼠移植瘤 的生长。 陶氏太阳海星酸性粘多糖是从棘皮动物陶氏太阳海星海星体内 分离提取的一种粘多糖。动物实验表明有明显的降低血清胆固醇作用。并有缓和 的抗凝血作用。因此被认为是有潜在的治疗微循环障碍和高血脂、冠心病、脑血 管病的药物。该多糖还有增强免疫功能作用【。 甲壳质是肛,一乙酰胺基葡萄糖聚合物。广泛存在于植物、 菌类细胞壁、甲壳纲动物及昆虫类中,如虾和蟹的外壳、乌贼的骨架等,是一类 非常丰富的天然再生资源。经过脱乙酰基后为脱乙酰甲壳质,又名甲 壳胺、壳聚糖、粘性甲壳素,有增强机体免疫力和调节人体生理功能,有明显的 降压、降脂、降糖、抗凝等作用。如降低胆固醇作用的有效率达%。能促进血 液循环、破瘀消肿,对跌打损伤,腰体酸痛等均有疗效。并且有抗菌、抗辐射、 抗炎及抗衰老作用。还用于人工器官如肾、血管、皮肤和隐形眼镜的制作。也广 泛应用于保健食品中。 海洋脊索动物海鞘的被囊含有硫酸酯多糖。不同海鞘含硫酸根 和单糖的组成和比例有差别,结构也大相同。 ..等【】从海鞘动物 中分离一种硫酸酯化一半乳 聚糖。利用甲基化分析和谱数据 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 该糖主要由一硫酸化一。一,一半乳 中提取的硫酸酯化 .半乳聚糖表 糖组成。而从另一种海鞘动物 现为不均一性,且硫酸根含量较低。这说明不同种类的海鞘中得到硫酸酯化一半 乳聚糖表现出结构多样性。第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 研究了从海鞘 ,等用一种金属指示剂和 中分离的高度支链化和线性的半乳多糖及其电荷分布。尽管在硫酸盐/总糖量的 摩尔比率有显著的不同,线性和高度支链化的半乳多糖的带电基团的距离不是不 同。这些结果表明硫酸半乳糖单元集中在中心核上,而不是插入在非硫酸单元之 间。这些半乳多糖的化学性质研究支持了这一推论,更奇怪的是钙近似随分子中 的非硫酸糖支链的增加而增加,因此与这些聚合物的结合并不是简单的阴离子键 合的可亲近性作用,而是一种复杂的钙.多糖的相互作用。 .等【】从太平洋被囊动物 的粘性分泌液中分离出一 种抗活性的硫酸酯化甘露聚糖。通过、谱及、和 数据确其结构为,一二硫酸酯一卢,.甘露聚糖。棘皮动物包括海星、海胆、 海参、海盘车等。从棘皮动物海参中分离的多糖,与哺乳动物中硫酸软骨素有相 同的主链。其支链连有岩藻糖【。。近年来不但研究了不同种类海参的组成和 结构,还研究构效关系。 , ...等【】研究了从棘皮动物组织分离的主要硫酸多糖:硫酸岩 藻糖原和岩藻糖化的硫酸软骨素。并研究它们的结构。海胆岩藻聚糖 结构如下: 【也?一?一础一一一?也一,一一 一印一海参岩藻聚糖结构如下: 【儿一,一一?一?一?一?一??也一 这种有规律的结构在以前还没有发现,这与从褐藻提取硫酸多糖形成对比,有类 似的,连接僻己一吡喃岩藻糖的骨架,但是其取代物是随意排列的。从棘皮动物 提取的硫酸多糖,与从动物糖胺多糖和海洋藻类硫酸多糖有共同的特征。此外, 从棘皮动物提取的硫酸多糖在 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 新的生物活性分子和生物聚合物在工业上的 应用都有重要的价值。 ..等【】从海参 体壁中提取的与岩藻糖化的硫 , 酸软骨素类似的具有抗血栓活性的多糖,该多糖经化学修饰的衍生物评估在兔子 身上作一个郁积血栓形成模型的作用。以静脉注射的方式以 /体重的剂 量在血栓郁积分钟时,可完全抑制血栓的形成。若除掉硫酸岩藻糖的支链,第章多糖研究进展 多糖则完全失去抗血栓活性。在注射具有抗血栓活性剂量放射性标示的这种 多糖 之后,观察到血浆中放射性消失与 值降低的关系。这表明抗血栓 的效果依赖于多糖的循环水平,而不是依赖多糖的间接作用在血管内皮上。把多 糖中的葡萄糖醛酸的羧基还原并不影响其在体内和体外活性,若部分失去岩藻糖 基或硫酸,则多糖会失去其他.抗凝聚活性或抗血栓活性。 早在五六十年代,人们从海洋软体动物鲍、硬壳哈、螺、牡蛎中分离一些抗 病毒、抗细菌及抗肿瘤活性的物质鲍灵、?、,这些组分中都含 有糖、硫酸根及肽等,主要成分是硫酸酯化的糖蛋白或糖肽。从实厚蛤中取得一 种抗凝血作用的“蛤利素.”?,该组分至少由四种硫酸酯多糖组成, 性质和肝素相似,曾把蛤蜊素归类为一种“类肝素”物质?。 .等【”从蛤分离提取到一种新的硫酸酯化半乳糖,是 ,一半乳聚糖,.或.被硫酸酯化。该多糖具有抗活性,在 /时,其融合指数和融合抑制百分率分别为%和%。 中山大学化学院天然有机化学研究室余志刚老师等从杂色鲍 中提取分离的鲍鱼多糖对体外培养的小鼠移植性肿瘤肉 瘤、肝癌肉瘤细胞无细胞毒作用,但能明显延长鼠的生存时 问,抑制小鼠移植性肉瘤的生长;在抑瘤的同时,能明显提高免疫器官胸 腺、脾脏的重量,降低荷瘤小鼠肝脏中过氧化脂质的水平【”;而且鲍鱼多糖对裸 鼠移植人鼻咽癌具有明显得抑制作用【”;对环磷酰胺有明显增效减毒作用】。 .多糖结构的研究方法 ..多糖结构研究的意义 自然界存在千姿万态的多糖,它们表现出复杂多样的生物功能和生物活性。 要阐释多糖的生物学功能,就必须弄清它的结构特征。由于单糖具有多个可连接 位点,以相同数目单体组成的多糖链的异构体数目远远大于多肽和多聚核酸,而 且,糖链还可以形成复杂多样的衍生物。此外,糖链通过非链作用产生多变的构 象。长期以来人们对糖研究缺乏兴趣,只把多糖作为能量来源如淀粉、糖元 和结构物质如纤维素、甲壳素。多糖的研究也落后于蛋白质和核酸。然而近 三十年来,随着分子生物学的发展及寡糖合成技术日渐成熟,糖在生物体内功能第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 不断被揭示,人们对糖的研究越来越重视。近年来,糖链结构测定技术的发展, 使多糖的研究成为最有吸引力的领域之一。 ..海洋动物多糖的分离纯化 和微生物多糖不同,海洋动物的蛋白质含量很高,不能采用水提的方法【”。 去除蛋白是提取海洋动物多糖的重要步骤。一般先用加热的方法,使蛋白变性沉 淀,然后加入蛋白酶分解省下的蛋白。然后加入三倍的乙醇,收集沉淀便得到 多 糖的粗提物。 粗提物仍含较多杂质,主要为多肽和色素。多肽用法、三氟三氯乙烷 法或三氯乙酸法除掉,其中以第一种方法较好条件温和。多糖中的色素多为 酚类化合物,通过在碱性条件下过氧化氢氧化法脱色。一般较少采用活性炭吸附 的方法,因为多糖也会被活性炭吸附。 脱去蛋白和色素的粗多糖是分子量极不均匀的混合物,需要进一步分级和纯 化,纯化的方法很多,常用的方法有有机溶剂沉淀法、季铵盐沉淀法、金属离子 络合法、离子交换层吸法,凝胶过滤法等。 分步沉淀法主要通过向多糖水溶液加入有机溶剂使不同分子量多糖分步沉 淀法下来。常用的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮。乙醇是应用最广泛的分部沉淀 剂,无毒,成本低。沉淀往往在.左右进行,在此条件下多糖较稳定。 季铵盐沉淀法利用季铵盐与酸性多糖生成不溶于水的多糖化合物的特性,分 离酸性多糖与中性多糖。常用的季铵盐有溴代十六烷基三甲铵,十六烷 基盐酸吡啶。多糖季铵盐复合物可溶于盐溶液或有机溶剂中,季铵盐可 用透析法除去。 离子交换柱层析法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。常用的树脂为 ?、一纤维素和.纤维素等。利用不同离子强度的缓 冲剂进行洗脱,使酸性不同多糖依次脱下来,达到分离的目的。 凝胶过滤法又称为体积排阻色谱,此类层析的固相载体或介质是一 些多孔性或网状结构物质,并且具有分子筛效应,当含有不同大小分子的混合物 流经这一介质时,能将混合物中的各组分按分子大小进行分离,从而达到把分子 大小不同的物质分离开。其效果较好的有葡聚糖凝胶,聚丙烯酰胺 凝胶??,琼脂糖凝胶等。凝胶过滤常用不同浓度的盐溶第章多糖研究进展 液洗脱,用硫酸一苯酚比色法或示差折射及紫外检验糖的浓度,最近有人用安培. 检验,收集单一峰部分,为均一组分多糖。 ..多糖的纯度及分子量测定 ....纯度的检定 因为多糖的微观不均一性,经分离纯化后的微生物多糖严格意义上说仍是混 合物。所谓多糖纯品实际上是一定分子量范围的均一组分。常用纯度检验方法有 超离心法、电泳法和凝胶过滤法。 凝胶过滤法【是一种较好的方法,由于凝胶的分子筛作用,不同大小的多糖 分子在凝胶层析柱移动速度亦不同,较大分子移动快,小分子移动慢,流出液经 示差检测或硫酸.苯酚法检验,如为一对称峰,则为均一组分。 超离心法是利用物质微粒在离心力场中沉降的速度与微粒的密度、大小和形 状的关系测定多糖分子纯度。如果某一多糖在离心力场的作用,形成单一区 带, 说明多糖分子有相同的沉度速度,说明多糖是均一组分的。 电泳法是根据多糖在电场作用下,按分子大小、形状、及所带电荷不同而形 动不同的距离的原理进行的,均一组分多糖有相同泳动速度相同,染色后成一个 区带,中性多糖不带电荷,可以与硼砂结合形成带电荷的复合物进行电泳。电泳 法有多种:醋酸纤维薄膜电泳法和聚丙烯酸胺凝胶电泳法。 醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜作支持介质的区带电泳方法,设备简 单,操作方便,重现性好,比纸电泳分辨率高,但分辨率不及凝胶电泳高。 聚丙烯酸胺凝胶电泳法利用人工合成的凝胶作支持介质的区带电泳法,和纸 电泳相比,凝胶支持物不仅起对抗对流作用,而具有分子筛效应。有许多优点, 如样品不易扩散:可随控制凝胶浓度,按照所需制成不同孔径的凝胶;把分子筛 效应和电荷效应结合在同一方法中,提高分辨能力等。因而应用应广泛。聚丙烯 酸胺凝胶电泳的方式有两种:圆盘电泳和平板电泳,这两种方法各有特点和用途。 ..多糖的分子量测定 多糖的性质往往和它的分子量有关。例如,多糖溶液的粘度不但随浓度的增 大而升高,而且与多糖的分子量有关。多糖分子量测定是研究多糖性质一项 重要 工作,但至今仍是一个复杂的问题。常用的多糖分子量测定方法有,凝胶色谱法、 粘度法、渗透压法、蒸气压法、光散射法。超离心法测定分子量由于设备和操作第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 的原因,目前在多糖分子量测定中应用不多。其中以凝胶色谱法最为常用,尤其 是高压凝胶色谱的出现,大大加快了测定的速度。该方法的缺点是,需要标准样 品,作标准曲线。 值得注意的是,现代质谱技术的发展,使多糖分子量的测定变为快捷,方便。 质谱方法快速、灵敏、样品用量少,基质辅肋的激光解吸电离飞行时间质谱 . 【和电喷雾电离质一都是‘‘软电离”方式,产生 分子离子稳定,不易裂解,灵敏度和准确度较高, 适用于测定大分子生物样品。 应该注意的是多糖分子量只代表相似链长的平均分布,往往用不同方法测得分子 量是不同的,即使是同一多糖,其数均分子量和量均分子量池会相 差很大【。 ..多糖结构测定的化学方法 阐明一种多糖或糖复合物中糖类的结构,首要的工作时间测多糖或寡糖的组 份,证实它的结构。其次,要了解这些结构单元排列的顺序,连接的碳位和键 型。 多糖结构多样性引起的复杂性给糖的结构分析工作带来了巨大困难,目前,在糖 化学中包括顺序测定的分析技术、合成方法学和空间结构技术等研究方法,从总 体上讲还只相当于~年代核酸和蛋白质研究的水平。在核酸和蛋白质研究 中起重要作用的高效的序列分析、固相自动合成和依靠衍射方法的空间结构分 析等,对糖化学来讲,还是一个在远处呼唤的期待。经典的化学方法仍然是不可 或缺的手段。 ...单糖组成的确定 .酸水解【】 完全酸水解是分析多糖组分的常用方法之一。 常用的酸有硫酸、盐酸、三 氟乙酸等,较多使用的是三氟乙酸在。封管反应。酸催化多糖水解 的速率,和多糖的组成有关。已经发现连接呋喃糖和脱氧糖残基的往往是弱的糖 苷键,是易于水解的。而连接糖醛酸和一氨基一~脱氧己糖残基连接的糖苷 键较为牢固,难以水解。 测定糖残基组成可以完全酸水解,但必须考虑到单糖残基发生降解的因素。 当多糖含有一定数目对酸不稳定的糖苷键时,应当有控制地酸水解,使其恰好分 裂那些易于水解的糖苷键,水解得到单糖或寡糖或两者都有,可用凝胶过滤,离 第章多糖研究进展 子交换和分配层析等方法分离,其中最常用的硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来 发展起来的高效液相层析五。分级后进行研究,『好能阐明多糖分子这一些片段 的结构样式,由一定的寡糖作为重复单位有序排列组成的多糖,如果测定了寡糖 的结构,就能导致多糖全部结构的描述。然而,对于那些不是有序排列的多糖, 还要搞清楚控制这些排列的因子,这是多糖结构研究中困难最多的工作。例如, 用部分酸水解落叶松和金苹果来的阿拉伯半乳聚糖,分别得到?一一阿 拉伯吡哺糖基一一阿拉伯糖和一??一吡喃木糖基一一阿拉伯糖 。部分酸水解能很好的得到寡糖碎片并测定糖残基排列顺序,近年来多采用部 分酸水解结合高分辩率的谱数据研究多糖的结构【”。 .甲醇解 甲醇解有不少优点,把这种方法应用与多糖的分析,单糖的回收率较高,水 解时释放的还原基团受到保护,生成甲基糖苷。和,仔细研 究了甲醇解的条件。结果表明,在/ 甲醇液中?加热小时,所 有单糖都是稳定的。在?加热小时,己糖醛酸约丢失%,其它单糖仍 不变。如果用/ 加热小时,在?约丢失己糖醛酸%,而其它 单糖不变,但在?时戊糖和己糖醛酸丢失较多,一乙酸神经氨酸也略有丢 失,而己糖、脱氧己糖和乙酰胺脱氧己糖则保持稳定。要是用更高浓度的, 所有的单糖都有不同程度地破坏。在蒸发盐酸甲醇液之前,必须先中和以防 止单 糖在蒸发过程中丢失。 .乙酰解 多糖结构的乙酰解】,是另一种酸水解的典型方法,这种方法通常是在醋酸、 醋酸酐和硫酸混合物处理下进行,可以作为酸水解的补充。因为西种反应中 分裂 糖苷键的相对速率,有时是相反的。例如,对于主链是吡喃甘露糖残基的? 苷键连接含不同长度侧链的 系列多糖,通过温和地乙酰解断裂 ?苷键,得到不同的甘露寡糖侧链,提供了许多有用的结构信息【。 ...连接顺序的测定 .过碘酸及其盐的氧化反应? 过碘酸氧化的特征,在于它优先选择的氧化塘环羟基.理论上酶分裂一个翰 林羟基的碳碳键,会消耗一个过碘酸分子。正由于过碘酸的消耗量与产物的 生成 第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 量,都依赖于键合碳原子的位置。在试验过程中必须仔细控制条件,通常在 值为?的水溶液选择合适的试剂浓度,使生成物能正常的计量而不被氧化或 破坏。 .降解。 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解,由于羰基 之间以不同的位置缩合,用高碘酸氧化后则生成不同的产物。将氧化产物用硼氢 化合物如硼氢化锂或硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物,经酸水解后用纸 层析或气相色谱鉴定水解产物,有降解的产物推断糖苷键的位置。 .甲基化反应 甲基化方法一直是比较有效、直观的研究多糖连接方式的方法。该方法的目 的是将多糖的自由羟基用甲醚化保护起来,然后酸水解得到部分甲基化的单糖, 将它们转变为相应的糖醇乙酸酯,用气相层析、气质联用等方法确定各种单糖残 基的种类和相对含量,进而可以推断糖的连接及分支情况,还可以了解重复单元 中含糖残基的数目及种类。 由于多糖的羟基非常多,要使它们全部甲基化必须采用较强的条件。 年日本东北药学院生物化学系的箱森?峙民道了一个迄今被广泛应 用的方法。他用二甲亚磺酰负碳离子作为强碱,夺去糖羟基上的氢,再用碘甲烷 作甲基化试剂,使糖羟基甲醚化。箱森法主要有两个缺点:多糖难以一次甲基化 完全和制作二甲亚磺酰负碳离子过程过于繁琐。 年 。”等受蛋白质变性的启发,提出了加入变性剂四甲基 脲进行甲基化的改进方法。结果表明,加入四甲基脲后,反应速度和甲基化程度 都明显提高。这一改变证明了氢键确实是阻碍甲基化反应,可能是由于氢键维系 着多糖分子的高级结构,使部分羟基因立体障碍不易解离。 年,,等提出了以作为碱代替二甲亚磺酰负碳离子,取 得成功。该方法的要点是,要磨得很细,以增大接触面,同时因为极 易吸水,所以动作要快。 ..现代仪器分析方法 现代仪器的快速发展给糖的结构分析提供了重要手段。?、、、 等仪器的应用使糖结构分析有了巨大的进步。 第章多糖研究进展 .. 和?。 气相色谱是最早应用在糖结构分析中的仪器。酸水解、甲醇解后的 单糖和甲基化后水解的部分甲基化单糖,都要先经过衍生化。衍生化的方法主要 是三甲硅醚化、糖醇乙酸酯两种。三甲硅醚化过程中,单糖容易异构化,常使一 种糖产生多个峰。糖醇乙酸酯,因为还原了异头碳,同一种糖只会产生一个峰, 分析起来较为方便。近年来,人们还开发了一一些其他的衍生化试剂,取得了 较好 的效果【】。衍生化后,糖的挥发性提高,就可用气相色谱或气相色谱一质谱 联用 ?进行分析。色谱柱采用的填料多为低极『生或中等极性,如一,一, 一,一等。 ...高效液相色谱。” 与气相色谱相比高效液相色谱分离效率较低,但它有一个显著的优点,就 是高效液相色谱分离单糖时,不需要衍生化,从而避免了不必要的损失。自 年代以来,高效离子色谱的出现,使在糖分析中的地位快速上升。糖含有 羟基,在强碱性溶液中糖是以电离状态存在的,因此用强碱性水溶液 在阴离子交换柱上可以将不同的单糖分开。柱后用“脉冲安培检测器”, 这是一种电化学检测器,灵敏度很高。 ...核磁共振 核磁共振技术在糖链的分析中有非常重要作用,利用或 高分辨率的研究糖的结构已经成为多糖结构分析的常用方法。谱 、”、谱、相结合确定多糖中糖残基的组成,异头碳的 构型:谱可以推断糖苷键的位置及连接顺序:结合上述多种图谱可以 推道出寡糖的完整结构。根据和谱得出分子中各原子在空间相对距 离和位置,借助计算机分析可以推算出寡糖在溶液中构象“?。 ...质谱 质谱灵敏度高、结构信息直观,被认为是在糖类结构分析中很有前 途的方法之一。尤其是年代发现起来的快速原子轰击电离质谱?,电 喷雾电离质谱?和基质辅助的激光解吸电离质谱,都是“软 电离”方式,产生分子离子科稳定,不易分解,适用于极性高、难挥发而且热不 稳定性的生物大分子的测定。一般认为电喷雾电离质谱?测定分子量可第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 达万,准确度为.%一.%;基质辅助的激光解吸电离质谱在 测定蛋白质分子量可达万,准确度亦可达.%一.%【。 ...酶学方法 酶学方法是生物学方法,生物酶有很强的专一性,它的优点是只需很少量 的样品,可以显示糖苷键异头碳异构的信息。目前已分离得到糖苷酶有数十种。 糖苷酶分内切糖苷酶和外切糖苷酶,内切糖苷酶可以选择性的切断糖链内某种糖 苷酶,从而使多糖降解为寡糖碎片。外切酶专一释放糖链非还原端单糖,是测定 糖链顺序的重要手段,可以根据外切酶专一性,从切下单糖的种类,可确定糖与 糖链的连接位点和异头碳的构型。糖苷酶现已成为糖结构分析的工具酶,成为分 析糖结构研究的重要手段”。目前,把酶学方法与仪器分析相结合,已生产出商 品化的糖序列仪,可用于结构规律较明确的寡糖链分析【矧。 ..多糖链的构象 众所周知,蛋白质和核酸构象的研究是当代分子生物学的重要课题。多糖作 为一种生物大分子,其构象研究也有重大意义。多糖大分子结构,虽然不像蛋白 质有清晰的分类标准,同样也可分为一级、二级、三级和四级结构?。多糖的构 象可以定义为在一定条件下多糖分子结构的形态。此形态主要由组成多糖链的单 糖构象和连接的糖苷键型,以及各个糖单位的空间排列来决定 ...一级结构 多糖的一级结构包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异 头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。例如直链淀粉是以麦芽糖作 为结构单位的,键合的一吡喃葡萄聚糖。. ...二级结构 多糖的二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体,只关系到第章多糖研究进展 多糖分子中丰链的构象,不涉及侧链的空间排布【”。在多糖链中,糖环的几何形 状几乎是硬性的,各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位,可决定多糖的整体构 象,通常糖苷键有两个可旋转的主链二面角:出一,一一糖配基,.. 糖配基一糖配基,两个单糖若为一连接,则还有等三个可旋转的二面角。 ..?,解决寡糖构象的关键在于确定中、、的取值,但是,它们的 取值受相邻糖环之问的空问阻碍和相邻糖残基间的非共价键相互作用的严格限 制,因此多糖的二级结构形式主要依赖一级结构的排步【?。 三螂黪翰 ...三级和四级结构 多糖链一级结构的重复顺序,由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之 间的非共价相互作用,导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象,即是多糖 链的三级结构删。 多糖的四级结构指多聚链间非共价键结合形成的聚集体、多糖链的聚集作用 可在相同的分子间进行如纤维素链间的氢键相互作用,也可在不同的多糖链 间进行如黄杆菌聚糖的多糖链与半乳甘露聚糖骨架中未取代区域之间的相互作 用‖】。第一部分两种新的海洋生物多糖结构性质的研究 .结束语 现代科学研究表明,一切重要的生命活动过程都有糖的参与。糖链犹如细胞 和大分子表面的触须,捕捉细胞之间、细胞与各种分子之间及分子之间相互作用 的各种信息,同时它们又象是细胞和生物大分子的手脚,联系着细胞与细胞 之间 及细胞与外界的能量和物质传递,决定着大分予与细胞及与其它分子之间的相作 用,这使得糖在预防和治疗包括癌症在内的多种疾病有巨大的应用潜力。可以说, 生命现象中一切最本质的表现形式,包括物质输运、能量转移及分子间的相互作 用,都与糖密不可分。多糖的结构研究对于理解多糖构效关系、复杂的生物功能 有极深刻的意义。而且,糖的结构分析的新方法也成为一个具有吸引力的研究领 域,糖的结构研究方法的突破必将带动分子生物学的另一场革命。因此可以预见, 有关糖的研究将成为未来生命科学的中心研究课题之一第章翡孚贻贝多糖的分离、结构鉴定及活性 第章翡翠贻贝 多糖的分离、 结构鉴定及活性 翡翠贻. 俗称青口,是一种常见贝壳。贻贝生命力强,易于人 工养殖,是我国传统的养殖贝类。山东、浙江、广东等沿海省份都有广阔的养殖 海域,养殖产量极大。在海产食品中,低值的翡翠贻贝并未充分利用,因此研 究 与开发其中的药用成分对提高其附加值有十分重要的意义。翡翠贻贝干制品称淡 菜,有很高的营养价值,还具有很好的药用和保健功效。根据己有的文献报道, 翡翠贻贝具有抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、保健等多种功效【“。动物实验还表明, 一种提取自贻贝的生物多糖具有良好的抗流感病毒活性,可以使致死剂量感染的 小鼠死亡率降低~%,并对流感病毒引起的小鼠肺炎病理改变有明显抑制作 用【。 在此,我们选择翡翠贻贝做为研究对象,从中提取出一个多糖,进行了 结构鉴定和药理活性试验。 .结果与讨论 ..翡翠贻贝多糖的分离及纯化 ...分离 把翡翠贻贝去壳,由于动物多糖集中在内脏,而肉中多糖含量很低,把组织 分开后,壳约占%,肉占%,内脏占%,从内脏中分离多糖,无论是原料 成本,还是提取过程中的损耗都大为降低,为多糖开发为药物提供良好的前提。 去壳后的内脏匀浆处理,提取多糖,由于其中含蛋白质多,先将肉浆加热至?~ ?使蛋白质变性,调值为,用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别酶解,酶解时间为 、时左右。 酶解液用的浓中和至中性。用法除蛋白,将氯仿、正丁醇 按:或~:的比例混合后,加入样品溶液中振摇,样品中蛋白质与混合液 形成凝胶,离心除去。在粗多糖水溶液中/体积的混合液,充分搅拌一小时 后,离心除去絮状物,重复次,蛋白基本除净。脱蛋白后,加倍体积的%乙 醇放置冰箱中过夜,得到粗多糖沉淀。沉淀溶于适量的水中,用%,在第一部分 两种海洋生物多糖结构性质研究 碱性条件下脱色,在脱色过程中,随着酸性化合物的产生,值变小,因此每 隔一段时间要检验溶液酸碱性,可用溶液补充碱性,保持其值在~ .~,分别用自 之间。完全除去颜色,一般放置~天。脱色完后,调 来水和蒸馏水透析,除去低分子化合物杂质。 得到的粗多糖为白色固体。 ...纯化 称取 粗多糖,溶于少量水中,过.凝胶柱,收集主峰部分,浓 .。 缩后经冷冻干燥得到多糖。是白色吸潮粉末易溶于水,【 . 。的凝胶色谱结果如图?所示。 以水为洗脱溶剂,. /的速度洗脱,每管接收时问为。主峰 部分是大体对称的,也说明多糖是分子量均匀分布的多糖。 整个分离纯化过程流程如图.所示。 图? 的凝胶色谱 ..翡翠贻贝多糖糖醛酸测定 用硫酸一咔唑法以淀粉和肝素为对照品进行糖醛酸的检测,结果为阴性。证 明中不含糖醛酸。 第章翡翠贻叭多糖的分离、结构鉴定及活性 翡翠贻贝 匀浆 、. 壳、肉 酶解,、离心 』 上清液 沉淀 上 二::离心 上甚液 裹淀 %乙醇,离心 匹 浣淀 上海液 溶解、脱色 加倍乙醇沉淀 』溶解、脱蛋白 粗产品 ?,纤维素柱、凝胶柱 翡翠贻贝多糖 图?翡翠蛤盯每糖提取分离及纯化流释图 ..翡翠贻贝多糖的元素分析和离子色谱 提取的粗多糖干燥后密封进行元素分车斤,各个元素含量见表?。根据第一部 分两种海洋生物多糖结构性质研究 元素分析结果,含有少量的,推测可能为硫酸酯多糖,为进一步确定其是 否为硫酸酯多糖,进行了离子色谱分析。检测到中含有’,说明多糖 为硫酸酯多糖。离子色谱对硫酸根进行检测确定其中含有一。从离子色谱来 看,其中一个峰可能为。’。 表? 的元素组成 % 元素 . . . ..翡翠贻贝多糖的总糖含量的测定 我们采用硫酸苯酚法测定的总糖含量。多糖首先在浓的强酸作用下水解 成单糖,单糖再经过浓硫酸处理脱水生成糠醛如戊糖,或糠醛衍生物如已 糖或已糖醛酸,生成物可与酚类化合物形成有色物质, 有最大吸收峰。 该颜色反应可作为定性鉴别糖的特征反应。在一定糖浓度范围内,其最大吸收峰 的吸光度与多糖浓度有线性关系,通过测定有色物质的特征吸收峰的吸光度可以 计算出多糖的浓度。 通常使用的酸为浓,常用的酚有苯酚,?萘酚,问苯二酚等。人们使 用苯酚一硫酸法进行测定总糖含量。该方法不仅适用于中性糖,也适合糖醛酸。 该方法简单、快速、灵敏,对每种糖仅需制作一条标准衄线,且颜色持久。由于 这种方法在短时间内,快速将多糖水解成单糖,脱水后,进行显色反应。为了使 水解完全,显色充分,因此硫酸的用量,苯酚的浓度及用量,反应温度,反应时 间,整个过程的操作方法都对吸光度有较大影响。 所得最佳反应条件为:先将多糖溶液与%苯酚混合,快速直接的将硫酸加 入,加完硫酸后,立即摇匀,放置,测定吸光度。 由于没有相应的标准多糖,用葡萄糖作标准物制作标准曲线,以校正系数. 进行校正,可以得到满意的结果。葡萄糖的浓度在~?‖范围内,其浓度 与吸光度有线性关系,如图?。 测得多糖吸光度为.、.、.,平均为.,根据第章翡翠贻贝多糖的分离、结构鉴定及活性 得出上述标准曲线的.,..即 .... 再由总糖含量计算: 总糖%样品测定浓度?样品浓度..为校正系 数,得出多糖的总糖含量为.%。其余.%要是水,还有少量其它杂 质。 表?不同浓度的标准葡萄糖溶液的吸光度的关系 %苯酚溶液 浓硫酸 吸光度 葡萄糖溶液. .‖ . .? . .肛. .肛 . .肛 . .肛 图?葡萄糖总糖含量的标准曲线 多糖在空气中极易吸收水分而增加重量甚至发生降解,而的总糖含量为 .%,说明对翡翠贻贝进行的前期分离纯化步骤是成功的,将其中的大部分杂 质去除而得到较高纯度的多糖。 ..翡翠贻贝多糖的纯度鉴定及分子量测定 纯化后的经醋酸纤维薄膜电泳检验,经显色后为一较圆的斑点,过凝胶 .为一对称单峰,表明为分子量均匀分布的多糖。用粘度法在。定第一部分两 种海洋生物多糖结构性质研究 的分子量为.。 ..翡翠贻贝多糖的糖腈乙酸酯衍生化研究 的糖腈乙酸酯衍生化是先用三氟乙酸把多糖水解成单糖,加入盐酸羟胺、 吡啶,加热反应生成糖肟,然后在乙酸酐作用下乙酰化生成具有挥发性的糖 腈乙 酸酯衍生物。该方法具有制各简单、试剂易得、每一种糖都有单一得色谱峰 等优 点。因而在多糖研究中应用较广。 经过完全酸水解,糖腈乙酸酯衍生化后进行?分析,同时将多种 标准单糖进行糖腈乙酸酯衍生化,标准单糖有半乳糖、木糖、鼠 李糖、甘露糖、葡萄糖、来苏糖、岩藻糖 七种。?结果表明由葡萄糖组成,其中还含有少量的鼠李糖、岩藻糖、 甘露糖和半乳糖。结果如下: 表?多糖糖腈乙酸酯衍生化后的.结果 相对保留时间 相对峰面积% 糖基 . . 鼠李糖 . . 岩藻糖 . . 甘露糖 . . 葡萄糖 . . 半乳糖 初步确定多糖主体结构为葡聚糖。取少量溶于水中,在水溶液中加 入几滴?溶液,过 仍未见溶液变蓝色,可确定不是直链淀粉。要确定 的结构,还需进一步鉴定。 从及标准单糖的糖腈乙酸酯衍生化的.分析结果看如图?, 每一种糖残基经过衍生化后都只得到一种产物,在图上只有一个峰,从而大 大简化了检索误差,有利于用标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物进行比较。与单 糖的 三甲基硅醚化等其它方法比较,单糖的糖腈乙酸酯衍生化的结果更准确、更 直观, 因而可以取代前者。第章翡翠贻贝多糖的分离、结构牲定及活性 .. . :. ? 半乳糖 :.术糖 ? : 岩藻糖标准单糖的图 。。 。。,茹 。。,” 习习 』』 的图 图?标准单糖葡萄糖与多糖的对照图第一部分两种海洋生物多糖结构性质研 究 ..翡翠贻贝多糖的甲基化 测定了多糖的组分后,下一步就是分析它的连接顺序。在这里我们采用 了甲基化分析方法。 第一步,制作无水二甲亚砜。向加入,浸泡三天。 然后减压蒸馏表压为..,前馏分约%弃去,收集~?馏分,倒 入?干燥小时的分子筛,静置过夜。 第二步,制作。该试剂是一个强碱,用和反应。市售 外表包有一层矿物油,反应前用石油醚将其洗掉,吹干。倒入干燥好的中。 超声波浴反应。反应前先向容器中冲氮气保护,瓶口要用血清帽盖紧。血清 帽上 穿过一个注射器针头,以便反应放出的氢气及时逸出。反应温度保持在~。。 反应开始时,加热不能太快,以防大量氢气突然放出,发生危险。加热至?后, 会有明显的气泡产生。观察反应物颜色,当颜色变成草绿色,反应即到终点。 如 果反应时间过长,反应物会泛蓝色,则说明已分解。如果反应温度超过 ?,反应物会变成土黄色,但对结果没有影响。 其反应式如下:的制各,是甲基化的关键步骤,形成草绿色溶液表明的浓度 较高,若为蓝色,则要重新制备。新制备的充氮保护,密封,放入干燥 器中,连同干燥器一起放入冰箱中,可以使用一个月。 第三步,甲基化反应。将溶于无水中,超声波助溶。完全溶解后, 氮气保护,盖紧血清帽,用注射器加入预先制各的,超声波浴促进反应。 多糖中醇羟基变为负氧离子。,反应,室温避光静置过夜,然后与 无水碘甲烷反应。在冰浴中用注射器加入碘甲烷,超声波浴。反应物变为澄 清, 即为反应终点。生成甲基化产物。。加水终止反应。反应过程如下页反应 式。 第四步,后处理。甲基化产物对自来水透析过夜,再用蒸馏水透析两次后用 氯仿萃取。第章翡翠贻贝多糖的分离、结构鉴定及活性 。砜 叫,。 一』。 .‘ .‘ 一。 。 一般来讲一次甲基化很难完全,需要经过重复步骤才能完全甲基化。多糖难 以完全甲基化,其主要原因是多糖分子中羟基易形成氢键,相互缠绕,往往是表 面甲基化,而分子“内部”不能甲基化,因此在中的良好的溶解性,对多 糖完全甲基化是至关重要的。糖环上不同位置的羟基活泼性是不同的,以位羟 基最易甲基化,一旦糖的某个羟基被甲基化,其邻位羟基的反应活性将降低,这 也是甲基化不易完全的一个原因。 甲基化的产物用红外光谱跟踪测定,直丑 ’左右的一峰消失为 止。甲基化反应的关键是所有试剂和仪器必须干燥,操作过程尽可能做到无水无 氧,常用干燥的高纯氮气或氩气来保护。易吸水,反应时要特别注意, 尽量使反应物少接触空气。碘甲烷用干燥,使用前重蒸,放在冰箱中,避 光保存。市售外有矿物油包裹,使用时要用石油醚将油性物质洗去,重复 三次,最后一次用干噪氮气吹干,得到灰白色的粉末,立即使用。 经过两次甲基化,羟基已甲基化完全。水解还原后进行乙酰化反应得到 一系列的糖醇乙酸酯,.分析结果见附图。甲基化检测结果标明由, 和,连接的葡萄糖组成表?。 表? 甲基化的?分析结果 保留时间 相对比例 甲基化的糖醇乙酸酯 连接方式 % . 端基 ,,.四甲基.,一二乙酰基葡萄糖醇 . . ,一连接 ,.三甲基.,,.三乙酰基葡萄糖醇 . . ,一三甲基葡萄糖 ,一连接 ..连接 . . .二二甲基.,,,一四乙酰基葡萄糖醇 ,一连接第一部分两种海洋生物多糖结构性质研究 ..翡翠贻贝多糖的红外、核磁共振研究 红外光谱:的红外吸收峰及其归属::,一, ,?,,一一,,?,,, ~,?一。 及 : 称取翡翠贻贝多糖,加入.重水,装于的核磁样品管中, 以丙酮为内标,进行测定,测定温度为。。 :一般地说,多糖一维氢谱峰的位置一般都集中在两个区域,一个 . 区域在 ~. 之间,这是糖环异头碳上氢的位移区,而另一个区域 集中在幽. ~. 之间,这是糖环上与羟基相连的碳上的氢的位移区。 . 根据前人的经验,一般情况下,异头碳上的氢位移位于 ~. 之间 的异头碳的构型为构型,而位移为幽. 的为序构型,但甘露糖