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大鼠心肌细胞原代培养.doc

大鼠心肌细胞原代培养

始终还是一个人流浪
2019-01-11 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《大鼠心肌细胞原代培养doc》,可适用于医药卫生领域

实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定、材料与方法材料实验动物新生天清洁级Wistar大鼠乳鼠(中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心,动物许可证号:scxk)。主要仪器与试剂CO恒温培养箱(modelTCCOincubator)倒置相差显微镜(XD)PH计(mettlertoledos)立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZXBI),上海申安医疗器械厂SWCJFD型单人双面净化工作台微量移液枪(法国Gilson)血球记数板(上海市沪江医疗器材经营部)HH数显恒温水浴锅离心机(LDZ)cm培养瓶、ml离心管(美国corning公司)无菌手术器械磁力搅拌器电子天平板(BSS德国)一次性滤器(μm,GILSON)DMEMF培养基(美国GIBCO)特级胎牛血清(FBS,Hyclone)青、链霉素(Hyclone)DHank’s液(NaCl、KCl、NaHPO、KHPO、NaOH、NaHCO,苯酚红,南京化学试剂厂)心肌肌钙蛋白T(Santacruz)FITC连接的兔抗山羊IgG(Santacruz)Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)TritonX(AMRESCO)BrdU(solarbio)。方法于无菌操作下开胸取出心脏,仔细去除心脏相连大血管和心房组织(留心尖部),于℃的DHank’S液中漂洗~次,以去除残存血液,眼科剪将心尖部组织剪成mm碎块后,加入ml的胰蛋白酶液,于℃恒温水浴箱中消化min,然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液ml(胰蛋白酶Ⅱ型胶原酶),置℃水浴消化~min,其间振荡~次,静置后将上清液移入离心管中,加含胎牛血清预冷的DMEMF培养液终止消化。随后用上述方法反复消化~次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后,目的尼龙网筛过滤去除残留组织块,以rmin速度离心min,将所得的细胞与培养液混悬后,采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次h,将未贴壁的心肌细胞悬液吸出,调整细胞密度接种于培养板中。培养前d加入mmolLBrdU抑制成纤维细胞生长。h首次换液,以后根据情况~d换液。CM的鉴定弃除培养基,PBs平衡盐缓冲液漂洗次,以℃预冷的多聚甲醛固定min,PBs平衡盐缓冲液漂洗次后,Otritonx穿孔min。lO正常兔血清(以PBS平衡盐缓冲液稀释)封闭min后,分别加入抗肌钙蛋白抗体T(cTnT)(分别以PBS平衡盐缓冲液:稀释)℃过夜,再兔抗羊FITCIgG室温孵育小时,每个步骤间均以PBs平衡盐缓冲液漂洗次,每min,甘油封片,荧光显微镜激发照相。结果心肌细胞的形态在倒置相差显微镜下观察,刚分离的心肌细胞呈圆形,培养h后成纤维细胞基本完全贴壁,而少数心肌细胞h左右开始贴壁,少数贴壁的单个心肌细胞出现了自发性搏动,搏动的频率、节律各不同。h后搏动的心肌细胞百分率大约为,搏动频率较分散,约~次min。至h视野下细胞呈梭形,板形,三角形或扁平不规则形,折光度较高,细胞中隐约可见细胞核,搏动的心肌细胞百分率大于,搏动频率多集中在~次min,h后细胞充分铺展,贴壁牢固,少数局部呈均一搏动频率,可达~次min(附图)。CM的鉴定在免疫荧光染色时一抗选用羊抗大鼠心肌特异性肌钙蛋白T的单克隆抗体,二抗选用FITC标记的山羊抗小鼠IgG,心肌细胞中胞浆呈绿色荧光则显示心肌肌钙蛋白T在胞浆中的表达(附图)。小结本研究通过用改良的新生小鼠心肌细胞培养方法,心肌细胞存活率高,心肌细胞和非心肌细胞分离较彻底,细胞贴壁快、搏动早、纯度高,且操作简便,重复性好,是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法,可以满足心血管疾病发生、发展机理及心血管药物和心脏组织工程学的研究及多种生理生化实验的要求

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