SRAP和ISSR分子标记研究进展

SRAP和ISSR分子标记研究进展 SRAP与ISSR分子标记的研究进展 摘要:SRAP与ISSR等分子标记技术已广泛应用到科研工作中。本文简单的介绍SRAP与ISSR的原理、功能、应用以及对使用分子标记技术揭示生物菌的作用机理进行了展望。 DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它能直接反映基因组DNA间的差异，是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后，近年来广泛应用的一种新的遗传标记。近年来,随着DNA 标记技术的研究日渐成熟,其应用也日益广泛。目前,各种分子遗传标记技术在科研中的应用已深入开展，为种质资源的鉴定、基因的定位与克隆、数量性状位点的遗传分析、遗传多样性评估、物种起源和分子标记辅助育种等遗传研究提供了有价值的工具。目前常用的分子标记有RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR 、SRAP等。 1 SRAP分子标记的发展与应用 1.1 SRAP分子标记的发展 SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)即相关序列扩增多态性是一种基于PCR 的新型标记，由美国加州大学作物系Li和Quiros博士提出的序列相关扩增多态性(sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP)。SRAP 技术是与RAPD 技术相似的一种标记技术，即SRAP 可用一对引物，但所用的引物是在SSR 的基础上设计的。SRAP 标记原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。SRAP 技术是一种无需任何序列信息即可直接PCR 扩增的新型分子标记技术。 SRAP分子标记技术具有重复性强、简便、易于分离条带和测序、中等产量高、高共显性、便于克隆测序目标片段等特点,目前SRAP 标记已在植物遗传多样性检测、遗传图谱构建、重要基因定位、品种鉴定和种子纯度检测上得到了广泛应用，而在真菌界的应用相对较少。 2.2 SRAP 分子标记的应用 国内学者利用该技术对疫霉菌Phytophthora infestans、炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、锈菌Puccinia striiformis、紫杉内生真菌等进行了遗传多样性分析，获得了理想的结果。Sun 等和Fernando 等认为SRAP 标记比RAPD 标记稳定，且其多态性可与AFLP 标记相媲美。 Fu 等认为在研究香菇多样性时SRAP 比ISSR 获得的信息更全面。郭大龙、 [1]冯志红等分别建立和优化了部分柿属植物与西葫芦SRAP-PCR反应体系。刘丽娟将该技术应用于黄瓜、甘蓝、辣椒等蔬菜作物的遗传多样性分析;张俊伟、张宇、周春娥、李江华等分别对梅、苜宿、糯玉米、大豆、野生狗牙根等进行了SRAP的遗传多样性分析,结果表明,该技术适合于植物的遗传分化研究,聚类结果几乎与传统分类结果一致。目前该技术在真菌中的研究还主要集中于食用菌,有关植物病原菌，生防菌的SRAP分析还非常有限,王守现、付立忠、张静、 [2]LIZHONGFU等分别就鸡腿燕、香链、双孢磨燕与杏鲍燕的SRAP遗传多样性进行了分析研究,结果表明,SRAP分子标记技术多态性明显,能够客观反映出全部供试材料的遗传关系。蒋冬花、陈碧云酵母菌与核盘菌进行了SRAP遗传多样性分 [3]析。贾定洪(2011年)利用SRAP分子标记对23个金针燕菌株进行分析,试验筛 遗传相似系数为0.143-1.000,遗传差异较大,选出7对SRAP引物,经过聚类分析, 与形态学的分类相符。袁微微(2013年)利用SRAP分子标记对镰刀菌的遗传多样性进行分析， 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了镰刀菌种间分化明显,种内存在较高的同源性。周永进、 [13]马鸿翔、余桂红等利用SRAP分子标记技术对两种赤霉病菌Fusarium asiaticum 与Fusarium graminearum 特异性分子标记，从而快速准确的区分两 [14]种赤霉病菌。羊杏平、刘 广、侯喜林等对35 份西瓜核心种质进行了抗枯萎病鉴定，再采用SRAP 分子标记技术对35 份核心种质进行多态性分析，检测到1 个与抗病性显著关联的SRAP位点，为西瓜抗病新品种选育和分子标记辅助育种奠定了分子基础。赵艳琴、吴元华等建立了烟草靶斑病菌 SRAP-PCR 反应体系，并对引物进行了筛选，明确烟草靶斑病菌的遗传本质，为该病害的防治提供理论依据。另外，SRAP 标记引物通用性强，不需要预知物种的序列信息就可应用。但不同研究对象的SRAP 标记对引物具有选择性，如炭疽菌SRAP 筛选出的适宜引物不适用于水稻茄丝核菌的SRAP 标记。刘立军、刘志恒等在试验中发现，优化SRAP 反应的退火温度是决定试验成败的关键因素之一。降低SRAP 第1次退 火温度，提高第2 次退火温度，有利于获得较好的SRAP 扩增效果。由于真菌基因组比植物的小，扩增出来的条带相对少些，减少了统计工作量，并降低了SRAP 标记的统计难度。因此，SRAP 分子标记技术在真菌的遗传研究中有着广阔的应用前景。 2 ISSR分子标记发展与应用 2.1 ISSR分子标记的发展 ISSR(inter-simple sequence repeat)即简单重复序列间区扩增,是一种建立在PCR反应基础上的DNA分子标记,属微卫星标记类。它由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994 年在SSR(简单重复序列标记技术)基础上提出，用锚定的微卫星DNA为引物,即在SSR序列的3'端或5'端加上2~4个随机核苷酸,在PCR反应中,锚定引物可以引起特定位点退火,导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增,然后通过电泳技术分析其多样性结果。 在基因组的许由于SSR一般是以短的(1~6bp)基元组成的较低程度的串联重复,多位点都有分布,占据基因组的绝大部分,并且进化变异速度快, 因而ISSR可检测到基因组中许多位点的变异，较其它标记方法多态性更好。 ISSR 分子标记具有 PCR产物可提供比 RAPD、SSR 和 RFLP 更为丰富的多态性，试验重复性好等优点。因此以成功应用于动植物、微生物的遗传多样性分析、亲缘关系研究、品种和种质资源的快速鉴、遗传图谱的构、基因定位和辅助选择育种。2 2.2 ISSR 技术的应用 近年来ISSR 开始应用于植物遗传分析的各个方面, 如品种定、遗传关系及遗传多样性、基因标签、植物基因作图、指纹图谱的建立等方面的研究。 2.2.1 品种鉴定及分类 作物的性状大多属数量性状, 由多基因控制, 易受环境条件影响。利用传统形态学鉴定方法区分品种时间长, 费用高, 难度较大。现有的鉴定方法中, 同工酶和蛋白质电泳可检测的位点少, 蛋白质类型不多, 多态性水平低, 对同一作物不同品种不能进行有效的区分。RFLP 技术繁琐, 对操作人员、设备要求高; RAPD 可靠性较差, 难以在品种鉴定中广泛应用。ISSR 多态性水平高, 易于分析, 不受环境影响, 在品种鉴定中显示出巨大的应用潜力。ISSR 引物为重复序列, 由于重复序列在基因组中是变异最快的成分, 不受或很少受到自然选择的影响, 故其变异保留下来, 所以重复序列区域的多态性远高于基因区域的多态性, 这是ISSR 标记多态性较高的原因所在。利用ISSR 绘制品种(系)的指纹图谱, 作为品种(系)的特征性状建立种质资源档案库, 可用于鉴别品种(系)。由于ISSR 容易检测出DNA 多态性, 所以ISSR 分析已广泛应用于各类作物的品种(系)间的鉴别和分类。余爱丽等(2002)利用ISSR 标记技术对甘蔗及其近缘属进行了分类。Potter 等仅用1 个ISSR 引物 即可区分15 个核桃品种。用2 个ISSR 引物组合可鉴定31 个品种, 只有2 个品种需要3 个引物才能区分。Arnau 等用1 个ISSR 引物即可区分30 个草莓变异植株。Luisa 使用的ISSR 引物的任何1 个均可区分24 个梨品种。因此, ISSR 技术是一种可靠、快捷的分子标记技术, 可用于大规模DNA 指纹分析。Fang 等用ISSR 标记区分亲缘关系很近的柑橘品种。Prevost 等仅用了4 个ISSR 引物就将30 多个马铃薯品种区分开来。 2.2.2 亲缘关系 [6] ISSR 技术也可用于种群内、种群间和物种间的研究。邱英雄等利用ISSR- PCR 方法对杨梅的7 个品种和2 个无性系后代进行了基因组多态性分析, 选用11 个引物扩增出116 个DNA 片段, 其中48个片段呈现多态性, 占总扩增片段的41.4%, 并通过聚类分析将杨梅7 个品种和2 个无性系后代分为3 类, 引物ISSR16 和ISSR20 相结合能够区分杨梅的全部品种和无性系后代, 依据扩增结 [8]果进行遗传距离分析, 构建了分子树状图。Gulsen 等的研究表明, 枸橼对于 [9]柠檬基因组形成有相当大的贡献。Fang等用10 个ISSR 引物分析了柑橘35 个种之间的亲缘关系, 将这35 个种分为5 个类群, 由ISSR 标记所得到的分类结 [10]果和前人研究结果一致。何予卿等(2000)利用ISSR 分子标记对37 份栽培稻和野生稻的亲缘关系进行了分析, 结果栽培稻与野生稻的亲缘关系体现出栽培稻是由普通野生稻分化而来, 而普通野生稻是从南向北逐渐分化的。Luis 等通过对28 个李品种的AFLP 和ISSR 分析表明, 这两种标记所得到的李品种亲缘关系的聚类图很相似。Huang 等用ISSR 和4 个叶绿体DNA 非编码区的性位点变异来研究40 个甘薯属样品的遗传多样性和种内关系, 测试的15 个ISSR 引物在所有的样品中共产生了2 071 个片段, 平均每个样品扩增出了52 条带。这 些ISSR 扩增片段在所研究的40 个样品中具有较高的多态性(62.2%)。ISSR 技术可检测到甘薯属样本中较多的遗传变异, 同时对比ISSR 技术与核基因DNA 限制性分析对甘薯属样品的检测结果表明, ISSR 技术分析种间和种内的遗传关系。 2.2.3 遗传多样性分析 Terzopoulos P J 等从 11 条 ISSR 引物中筛选出 4 条引物对20 个地中海型蚕豆品种进行 ISSR 分析，扩增出的 192 条谱带中 190 条为多态性条带，表明其有高水平的遗传变异，且建议将地中海型蚕豆分为至少 2 个不同类型的种质资源库。Behera T K 等利用 15 个 ISSR 标记和 29 个 RAPD 标记对 38 个印度苦瓜品种进行遗传多样性分析，结果表明 ISSR 引物扩增的条带多态性(74.7%)多于 RAPD(36.5%)，但对种质的多样性评估基本一致。沈金雄等利用 ISSR、SSR 分子标记技术对 25 个甘蓝型油菜品种进行研究，基于遗传距离的 UPGMA 法将其分为 6 组，分组结果与材料来源及系谱关系相一致，且各组间亲本在产量性状、种子品质性状及物候期性状上存在明显差别。杜黎明等对白菜种质资源的亲缘关系进行研究，用 11 条 ISSR引物将 65 份材料分为四类，聚类分析结果表明大多种质间的亲缘关系与其来源地的相关性较大，但也有些地理差别很大的品种遗传关系较近，ISSR 分子标记可用于在分子水平上研究其亲缘关系。Lei LIU 等对紫花苜蓿、黄花苜蓿和胡卢巴属植物的亲缘关系进行ISSR 标记分析，结果表明相比于紫花苜蓿种质材料而言，胡卢巴种质与黄花苜蓿的亲缘关系更近，为一些有争议的中间过渡类的分类提供指导。黄歆贤应用 ISSR 和 SSR 标记方法对大豆、油菜和西瓜品种进行鉴定，结果表明 15 个大豆品种可由 5 对 SSR 引物或 4 条 ISSR引物相互鉴别，15 个油菜品种可由 6 对 SSR 引物或 2 条 ISSR 引物鉴别出来，18 个西瓜品种可用 5 对 SSR 引物或 2 条 ISSR 引物鉴别出来。吴兴恩等利用 14 个 ISSR 引物对 22份柑橘材料进行分析，将材料分为 6 个类群，其中甜橙和枳可通过多个引物区分开，类群间多态性百分率差异较大又有相似性，推测其可能与柑橘各属、种间广泛存在的自然杂交、受精能育性及多胚性有关。沈紫微等将 ISSR 分子标记应用于红豆草航天诱变种质的鉴定研究，说明航天诱变法可引起植株分子水平上的遗传变异，可作为种质资源创新的方法。孟芳等利用 ISSR 标记技术获得 1 个与苜蓿褐斑病感病 基因紧密连锁的标记 866-S800，以及 4 个与苜蓿褐斑病抗病基因紧密连锁的标 记9-R920、20-R750、21-R430、818-R680，有关 ISSR 标记与目的基因间的遗 传距离还应进一步建立 F2分离群体进行验证。