哺乳动物卵母细胞孤雌激活的研究进展

哺乳动物卵母细胞孤雌激活的研究进展 耦联受体, GnRH 和 GnRHR 在促性腺细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面结合, AA、AB 基因型频率分别为 0.83 和 0.17, 道 小尾寒羊 促进垂体前叶合成和释放 FSH 和 LH。哺乳动物的排 赛特羊 AA、AB 基因型频率分别为 0.60 和 0.40。引物 卵依赖于 LH 高峰, GnRH 分泌的增加和 GnRHR 数量 2 的多态片段测序分析表明, 位于 GnRHR 基因 cDNA 的增加都会引起 LH 高峰。因此, GnRH 基因和 GnRHR 第 230 处发生了碱基的改变(G?C), 该突变导致了氨 基 因 在 哺 乳 动 物 的 繁 殖 调 控 中 起 着 重 要 作 用 。 基酸的改变(甘氨酸?半胱氨酸)。 Montgomery 等通过研究把绵羊的 GnRHR 基因定位到 3 问题与展望6 号染色体上。Campion 等获得了绵羊 GnRHR 基因完 小尾寒羊本身就是多胎品种, 多胎基因存在的可 全的编码序列, 绵羊 GnRHR 基因由 3 个外显子和 2 能性很大, 但位于哪一条染色体上、与什么位点连锁、 个内含子组成。[16] 基因效应如何等一系列问题还有待于进一步研究。随刘忠慧等采用 PCR- SSCP 技术, 用两对引物分 着高密度基因图谱的构建以及功能基因组学研究的深 析了 GnRHR 基因外显子 2 和外显子 1 部分序列在小 入, 对与小尾寒羊高繁殖力有关的遗传标记的认识也 尾寒羊和道赛特羊中的多态性。结果对于引物 1 扩增 会更加深入。深入探讨小尾寒羊多胎性能的分子机制, 对于选育和推广小尾寒羊高繁殖力品系具有重要的理 片段,2 个绵羊品种均只 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到 AA 基因型; 对于引物 2 扩增片段, 2 个绵羊品种均检测到了 AA、AB 基因型; 论意义和应用价值。( 下转第 10 页) 哺乳动物卵母细胞孤雌激活的研究进展 , 122邓守龙 , 王安江 ( 1.新疆农业大学动物科学学院, 新疆 乌鲁木齐 830052; 2.新疆金牛生物有限公司, 新疆 乌鲁木齐 830026) 摘 要: 本文主要从卵母细胞孤雌激活机制、方法及影响因素, 对孤雌激活的研究意义和发展前景等方 面作一综述。 关键词: 哺乳动物; 卵母细胞; 孤雌激活 中图分类号: S814.6 文献标识码: B 文章编号: 1005- 2739(2008)03- 0007- 04 孤雌生 殖( Parthenogenesis) 是 指 无 雄 性 配 子 的 任 自然条件下, 多数哺乳动物排出的卵母细胞是次何作用, 由雌性配子产生个体的繁殖, 并进行胚胎发育 2 次减数分裂中期。目前人 级卵母细胞, 并停留在第 的无性生殖过程。后又重新定义为在没有任何雄性配 们 所 接 受 的 观 点 是 卵 母 细 胞 中 存 在 细 胞 静 止 因 子 子的作用下, 由雌性配子单独产生胚胎, 不论其是否发 ( CSF) , 即高活性的 CSF 维持 MPF 处于高活性状态, [1][2]生成个体, 都称为孤雌生殖。研究哺乳动物卵母细胞 从而使卵母细胞保持在中期。卵母细胞 MII 期的维 激活及孤雌胚发育, 对了解哺乳动物早期胚胎的发育, 持与高水平的成熟促进因子(MPF) 活性有关。MPF 的 深入细致地研究核移植技术和动物克隆技术, 建立生 2+ 产孤雌哺乳动物品系及加速家畜育种进程等均具有重 活性是由对 Ca非常敏感的 CSF 来维持。抑制卵内游 2+ 要意义。 离 Ca浓度的升高则抑制了卵母细胞激活的一系列 20 世纪 90 年代以来, 随着哺乳动物细胞核移植 2+ Ca浓度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信 反应,研究的开展, 卵母细胞孤雌激活得以较为深入的研究, 2+ 号, 但并非诱导卵母细胞激活一定要 Ca浓度的脉冲 在实验动物、家畜及人卵母细胞激活方面取得了较大 [3]2+ 升高。CHX 引起卵母细胞活化不是通过 Ca波动起 进展。目前已有关于孤雌激活人卵母细胞正常分裂及 作用, 而是通过抑制有关蛋白质新的合成起作用。当 孤雌生殖嵌合体形成的报道。这是继 1997 年体细胞核 移植无性生殖多莉羊问世以来生殖生物学领域的又一 受精时,卵子的激活与 MPF 的失活是与一系列的细 重大事件。至此, 哺乳动物也有了有性生殖、无性生殖 2+ 胞内 Ca多次持续波动引起的。精子激活卵母细胞的 和孤雌生殖的 3 种生殖模式。 机制有两个主要假说: 一是精子与卵母细胞外膜上的 受体结合, 作用于 G 蛋白, 刺激磷酸肌醇途径而激活 卵; 二是精子内的因子通过精子与卵母细胞接触而释 黑龙江动物繁殖 第 16 卷 第 3 期 2008 年 2+ 的物质主要有 3 种: Ca; 1, 4, 5- IP3) 和 三磷酸肌醇 (胞。目前, 人卵母细胞孤雌激活研究多以化学性激活为 主。 1, 2- 二酰基甘油( DAG) 。细胞膜上的 4, 5- 二磷酸脂 酞醇 ( PIP2) 被磷酸二酯酶 ( PDE) 水解产生 IP3 和 2.2.1 乙醇 ( EH) 目前用于孤雌激活较重要的试剂DAG, 使细胞外信号转变为细胞内 信 号 , 这 两 个 第 二 是乙醇, Cuthberston 和 Nagai 等分别于 1981 年和 1987 2+ 信 使 分 别 调 节 两 条 不 同 通 路 , IP3 动 员 细 胞 内 源 Ca年用乙醇来诱导鼠和牛卵母细胞的激活。Yang 1994 年 2+ 释放到细胞质, 提高了胞内的 Ca浓度, DAG 刺激蛋 报 道 用 7% 的 乙 醇 加 环 乙 酰 亚 胺(cycloheximide, CHX) 白激酶 C( PKC) 活性, PKC 可以磷酸化底物蛋白, 引起 共同激活牛卵母细胞 10 min, 其激活率比以往有较大 与激活和减数分裂有关蛋白质和酶的磷酸化, 导致卵 [12]程度的提高。谭景和等发现, 用酒精活化卵母细胞 母细胞激活和减数分裂恢复, 排出第 2 极体, 促进原 时, 于培养液中添加 50 IU 青霉素, 可使排卵 6 h 小鼠 [6]核形成、卵裂和早期胚胎发育。 卵母细胞激活率达 97.0% 。乙醇是发现较早的一种化 2 卵母细胞孤雌激活方法 学激活剂, 对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜 卵母细胞的孤雌激活可通过许多途径来直接或间 上 PIP2 产生 IP3, 从而诱发细胞内源钙释放到细胞质, 2+ 2+ 接影响 Ca浓度的变化。有研究证实, 卵母细胞的激活 提高了胞内的 Ca浓度。哺乳动物 MII 期卵母细胞在 在某些方面必须依赖于精子内的顶体、特殊受体等成 含有 7% ,8% 乙醇的培养液中, 5,7 min 可激活卵母 2+ 分, 故孤雌激活与正常受精激活形成的 Ca波动不完 细胞使其形成原核。 [7]全一致 。激活方法可分为物理激活和化学激活两大 类。电激活、乙醇激活、蛋白质抑制剂激活、二价阳离子 激活及酶激活等许多理化方法在研究中都得到广泛应 2+ 2.2.2 离子霉素(Ionomycin, Ion) Ion 是一种高效 Ca 用, 联合两种或多种激活方法可以获得较好的激活效 2+ 载体, Ion 与 Ca载体 A23187 不同的是, Ion 并不直接 [8] 果。2+ 2+引起 Ca的跨膜转运, 而是动员细胞中的 Ca, 依次触 2.1 物理激活 2+ 2+ 发 Ca内流, 引起细胞内 Ca升高, 从而使卵母细胞激 物理激活方法中的电脉冲激活因其方便、高效、稳 活。尽管 Ion 能激活卵母细胞, 但激活的卵母细胞无原 定性及重复性好, 不但可以使卵母细胞激活, 同时还有 核的形成, Ion 只有与蛋白质磷酸化抑制剂 6- DMAP 或 重组胚融合的作用, 因而被广泛应用。电激活的原理是 蛋白质合成抑制剂 CHX 协同作用, 才可以有效激活卵 卵母细胞在短暂高压电击下, 细胞膜上形成很多可恢 母细胞。 2+ 复的微小孔, Ca可通过微小孔进入卵胞质中, 使细胞 2.2.3 蛋白质合成抑制剂或蛋白激酶抑制剂 6- DMAP 2+ 内 Ca脉冲式升高。控制电刺激参数, 模拟正常受精过 是丝 - 苏氨基酸蛋白磷酸化抑制剂, 它能阻止蛋白质 2+ 程 Ca的节律性脉冲升高, 可有效地刺激卵母细胞完 磷酸化, 抑制 MPF 和 CSF 的活性, 阻止纺锤体旋转而 [9]成第 2 次减数分裂。Ozil 等于 1990 年最早报道用电 导致卵母细胞不能排出第 2 极体。CHX 是蛋白质合成 脉冲刺激兔卵母细胞可得到孤雌胚胎, 得到的激活率 抑制剂, 它主要抑制卵母细胞维持在 M?期所需要的 [10] 达 100% , 并且胚胎移植存活率达到 66% 。邹贤刚等MPF 和 CSF 的合成, 进而使卵母细胞内 MPF 活性迅速 用电脉冲活化兔卵, 使 89.5% 的卵发育到 8~16 细胞 下降, 卵母细胞脱离 M?期, 完成第 2 次减数分裂导致 期, 26.6% 达到囊胚阶段。通过控制电刺激参数, 模拟 卵母细胞激活, 但 CHX 不抑制蛋白质磷酸化, 故不影 2+ 正常受精过程 Ca的节律性脉冲升高, 可复制出正常 响构成纺锤体的微管蛋白的活性, 也就不影响第 2 极 受精过程的一系列生理学和形态学变化, 启动 M?期 体的排出。研究表明, 卵母细胞用 CHX 处理后, 8 h 才 卵继续成熟分裂, 进入正常发育轨道。一次电刺激可诱 观察到原核的形成, 且 CHX 只有与细胞松弛素( CCB) 2+ 2+ 导一次 Ca升高, 多次电刺激可出现多次 Ca升高。研 协同作用才能抑制第 2 极体的排放。就孤雌激活胚胎 究表明, 随着电刺激活次数的增加, 卵母细胞活化率亦 的 囊 胚 发 育 率 而 言 , 6- DMAP 的 激 活 效 果 比 CHX 要 [11]增加, 但激活次数过多, 囊胚率反而下降。 好, 且一般与钙离子载体联合使用效果较佳。联合使用 2.2 化学激活 EH 和 CHX 可有效激活牛的幼龄卵母细胞, 激活率明 在胚胎细胞核移植的早期研究中, 普遍采用电脉 显高于单独使用 EH 或 CHX。 冲激活核移植胚胎。但电脉冲激活率会受卵母细胞卵 龄、激活条件以及融合仪的影响, 在不同的仪器上重复 性差, 严重影响了电激活的应用。近年来, 人们开始用 重复性好、结果较稳定的化学激活方法来激活卵母细 2+ 2+ 2+2.2.4 锶离子 Sr与 Ca是同族的二价阳离子, Sr 2+2+2+ 可进入钙库置换 Ca, 释出 Ca, 使胞质内 Ca浓度升 2+ 高, 进而介导依赖 Ca的皮质反应, 使卵母细胞激活。 2+ 2+ Sr可引发一个较长时间的 Ca波动过程, SrCl处理 2 2+ 引起的 Ca脉冲较受精引起的脉冲频率低、幅度小、持 2+ 续时间长。可能是在细胞内 Sr不被消耗但同时又可 2+ 2+ 2+ , 其化学物质浓度高低、处理时间长短、电刺 模拟 Ca而诱发内源性 Ca的释放, 其诱发的 Ca波 同激活方法2+ 2+ 激强度大小、有无联合其他激活方法等都会影响激活效 动与正常受精过程中 Ca的波动极为相似, 尽管 Sr2+ 果。对于兔, 电激活的效果最好, 小鼠用乙醇和麻醉剂激 可诱导卵母细胞的激活, 但对 Sr作用的研究目前仅 [18]SrCl处理激活的效率较高。在对人卵母细胞的 活以及 限于此。李光鹏等用 SrCl对小鼠卵母细胞进行化学 2 2 [14]2+ 激活, 激活率为 82.0% 。李雪峰等用 10 mmol/L Sr激 孤雌激活作用的研究中, 表明用 A23187、6- DMAP 处理 2+ 活牛卵母细胞 10 h 激活率仅为 51% 。因此, 关于 Sr可得到较理想的效果。目前, EH 和 CHX 经常用来联合 的最佳激活浓度、激活时间还有待研究。对于小鼠, 激活各种动物的卵母细胞, EH 配合 CCB 处理也是激活 SrCl是一种较有效的激活方式, 优于乙醇激活和电激 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 的 主 要 方 式 , 钙 离 子 载 体 联 合 2 [14]活。目前未见有关研究人卵母细胞 SrCl激活的相关报 2 6- DMAP 对卵母细胞的激活效果也很理想。李雪峰等 [19] 道。采 用 Ion 加 6- DMAP 处 理 牛 卵 母 细 胞 , 卵 裂 率 达 72.0% , 用 Ion 加 6- DMAP 加 CCB 激活牛卵母细胞, 卵 裂率达 75.5% , 并证实 Ion 比 EH 对牛卵母细胞的激活 2.2.5 细胞松弛素 B( CCB) CCB 广泛应用于哺乳动 作用强, 6- DMAP 比 CHX 的激活效果好, 激活液 CCB 的存在对牛孤雌胚胎的发育有利。复合激活法以其稳 物细胞核移植研究中, 其作用主要是抑制细胞内微管 的微丝形成使得卵母细胞内的细胞骨架松弛, 增加了 定、高效的优势在卵母细胞的孤雌激活领域发挥了重要 细胞的柔软性, 利于显微操作, 同时 CCB 可破坏纺锤 的作用, 但要找到一种或几种更高效、简便、经济的激活 体的形成, 抑制极体的形成和染色体的排出, 保证核移 方法还有待进一步研究。 植胚胎的染色体倍数, 一般与其他激活剂配合使用以 2.5 其他 提高孤雌激活的卵母细胞囊胚发育率。 Thimerosal (THI) 是 一 种 氧 化 剂 , 并 不 刺 激 产 生 2.2.6 透明质酸酶 大部分理化激活方法, 都是在透 明 质酸酶对卵丘 - 卵母细胞复合物脱颗粒细胞后进行 的。对未脱颗粒的卵丘 - 卵母细胞复合物, 透明质酸酶IP3, 而 是 对 IP3 进 行 修 饰 , 从 而 引 发 激 活 。 联 合可作用于卵丘 - 卵母细胞复合物颗粒细胞间质, 并刺 Dithiothretol(DDT)后, 则可修正纺锤体的损伤。在猪卵 激卵母细胞, 破坏、溶解透明带, 从而加速卵母细胞内 母 细 胞 上 , THI 处 理 后 大 部 分 可 以 排 出 Pb ?; 联 合 外物质的交换, 促进卵母细胞的活化。但单纯的透明质 DDT 后, 可刺激猪卵母细胞体细胞核移植胚发育至囊 酸酶对牛卵母细胞的激活效率低于 37% , 明显比电脉 [22]胚。Azuma 报道, 螯合剂 Na- EDTA(乙 二 胺 四 乙 酸 冲、乙醇、CHX、Ion 的激活率低, 孤雌胚的囊胚发育率 钠)可在猪卵母细胞 IVM 中诱导细胞形成原核, 虽不 也较低, 这说明透明质酶酸是一种较温和的激活剂。 2+ 排出 Pb?和 Pb?, 但可以发育至正常的囊胚, 认为 2.2.7 IP3 IP3 是启动和传播 Ca激活卵母细胞信息 2+ 传递中的第 2 信使, IP3 在细胞质中与钙库上的受体作 Na- EDTA 是 通 过 螯 合 细 胞 外 Zn而 诱 导 孤 雌 激 活 2+ 用而动员 Ca释放。有研究者将 IP3 直接注入卵母细 的。胞中可以将卵激活。也有研究显示, 在卵母细胞中的电 3 发展前景与应用 [20]激活液中加入 IP3 可以提高激活效果。 进行卵母细胞孤雌激活是家畜显微受精和细胞核 2.3 生物激活 移植的关键技术环节, 在胚胎干细胞系、孤雌胚胎干细 精子因子(sperm factor, SF) 对卵母细胞的激活, 利 胞与胚胎干细胞一样具有分化潜能, 若成功建立人类 用精子的提取物 SF 来激活卵母细胞, SF 在注入卵母 孤雌胚胎多能干细胞系, 则可在自体细胞、器官移植治 2+ 细胞质后可以触发类似于受精时的连续性 Ca波动。 2+ 在小鼠、猪、人上都可以取得激活效果。精子引发 Ca疗领域开辟一条新的途径, 为 Parkinson 症、脊髓损伤、 波动是由于多种物质作用产生的结果, 而 SF 的激活效 [23] 肌肉萎缩、糖尿病等疾病的治疗带来新的希望; 孤雌果是与精子发育时间、品种和 SF 的提取过程有关。SF 2+ 激活技术可以作为一种辅助生育技术 (ART), 通过对 注射到卵母细胞后所引发的 Ca波动与 受 精 极 为 相 ICSI 授精失败的卵母细胞进行人工激活可以获得受精 似, 且激活率高。但也有囊胚发育率不高的缺点, 可能 卵, 以此来补救 ICSI 授精失败。Zhang 等认为孤雌激活 是由于注入时细胞的损伤、SF 的污染以及失活造成。 技术可以提高 ICSI 的受精率和促进早期胚胎的发育, 甚至提议在 ICSI 后立即进行人工激活以确保 ICSI 授 精成功。孤雌激活技术是研究哺乳动物孤雌生殖及受 黑龙江动物繁殖 第 16 卷 第 3 期 2008 年 综述 中的作用等。对阐明这些重要的生命现象及技术应用胚与正常胚胎的蛋白质合成, 观察孤雌胚与受精胚的 嵌合和发育能力, 分析雄性和雌性基因组在个体发育 具有重要意义。 参考文献: [ 10] 邹贤刚, 肖英达, 黄国屏, 等.电刺激兔卵母细胞孤雌激活的 研究[J].动物学报, 1993, (39); 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