水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定

水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定 水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定 6中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期ChineseJournalofVeterinaryMedicine 水环境中噬菌蛭弧菌的分离鉴定 于雪芝,章丽娇,康冬柳.,何伟勇,韩博,苏敬良 (1.中国农业大学动物医学院农业部人畜共患病重点开放实验室,北京海淀100193; 2.汀西省吉安市畜牧兽医局,江西吉安343000) 摘要:噬菌蛭弧菌为一类杆形,弧形或螺旋形的革兰阴性菌,可以寄生并裂解其他细菌.本试验以禽源大肠杆菌,沙门菌 以及环境水体中分离的1株大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂培养法成功地从环境水体中分离到3株噬菌蛭弧菌,分别命名 为BDD,BDE,BDH.电镜观察证明菌体大小约0.33/am×0.78/am,单个弧形,一端有一根长鞭毛.基因序列分析表明,分离 株与已发表的噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源范围分别为96.0,99.9.通过对不同细菌的裂解试验 证明,3个分离株对大肠杆菌,沙门菌,摩根摩根氏菌,变形杆菌和阴沟肠杆菌等均具有裂解作用,但对铜绿假单胞菌,鸭疫里 默氏菌和金黄色葡萄球菌不敏感. 关键词:噬菌蛭弧菌;分离;鉴定 中图分类号:$852.61文献标识码:A文章编号:0529—6005(2010)11—0006—03 Isolationandidentificati0nofBdellovibrio6ncfrfo1,orllfromriverwater YUXue—zhi,ZHANGLi—jiao,KANGDong—liu,HEWei—yong,HANBo,SUJing—liang (1.KeyIaboratoryofZoonosisofMinistryofAgriculture,CollegeofVeterinaryMedicine,C hina AgriculturalUniversity,Beijing100193,China;2.AnimalHusbandryandVeterinaryBurea uof JianinJiangxiProvince,Jian343000,China) Abstract:BdellovibriobacteriovorusareGramnegative,small,arc— shaped,motilebacteria.Theyin— vadetheperiplasmofotherlargergram— negativebacteria,killinganddigestingthem.Thiscapability makesBdellovibrioapotentialtherapeuticagentforsomebacteriainfections.Inthisstudy,threeBdellov— ibriostrainsdesignatedasBDD,BDEandBDHwereisolatedfromriverwatersamplesusingSalmonella andEscherichiacoliaspreycells.A1lisolatesshowedtypicalmorphologyunderelectronmicroscopewith thesizeof0.33m× 0.78/*mandapolarflagellum.Genesequenceanalysisshowedthatthe16SrRNA genesoftheseisolatesshared96.0to99.9homologywithotherBdellovibriostrainspublishedin GenBank.BacterialysistestdemonstratedthattheseisolatescouldlyseE.coli,Salmonellaentgritidis, Morganellamorganii,Proteusspp.andEnterobactercloacae,butnotsensitiveforPseudomonasaerugi— nosa,RiemerellaanatipestiferandS,aph,OcOccusaureus. Keywords:Bdellovibriobacteriovorus;isolation;identification Correspondingauthor:SUJing—liang 噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio(teriovorus,Bd) 是一类体形较小,广泛分布于土壤,海水,污水等环 境中,运动极活泼的革兰阴性菌.该菌具有"寄生" 和"裂解(溶菌)"宿主菌的生物学特性,最早是由 Stopl等在菜豆枯萎病假单胞菌体中发现.在显 收稿日期:20100520 基金项目:中国农业大学2009URP 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助 作者简介:于雪芝(1986一),女,本科牛,从事动物医学专业学习, Email:yu51422396@126.corn;章丽娇(1987),女,本科生,从事动 物医学专业学习,Email:zhang62810003@126.CO1TI 通讯作者:苏敬良,Email:jinglsu@yahoo.COlll 注:第1作者与第2作者对本文同等贡献 微镜下观察表明,噬菌蛭弧菌呈弧形,杆状或逗点 状,大小为0.3,0.6/am×0.8m,1.2m.单极 端生一根长而粗的鞭毛通常呈波状,由鞭毛鞘和轴 心组成,与菌体运动和侵袭功能直接相关,被认为是 噬菌蛭弧菌的重要特征之一.在环境中一般不利用 周围的营养物质,必须依赖宿主细胞进行生长,发育 和繁殖,最后使宿主菌细胞裂解_2]. 蛭弧菌在河口,海洋,河水,生活污水,鱼塘和灌 溉用水等环境系统中分布广泛.在螃蟹腮上,江河 湖泊的沉积物,土壤,水稻田和植物根围均可分离到 蛭弧菌,同时在动物肠道中也能分离得到蛭弧菌l_3]. 因为噬菌蛭弧菌对革兰阴性细菌具有很强的裂解能 中国兽医杂志2010年(第46卷)第1】期7 力,而且试验证明,其对致病菌肠道病原菌的裂解能 力明显大于非致病菌,越来越多的科研人员试图开 发利用噬菌蛭弧菌作为微生态制剂用于水体及环境 病原菌净化,病原菌感染的预防和治疗等一.随着 养殖业的发展,养殖水体污染许多革兰阴性病原菌, 如嗜水气单胞菌等,对水产动物造成了越来越严重 的危害,以噬菌蛭弧菌为基础的微生态制剂在该病 的预防控制中显示了良好的应用前景.本研究通过 对环境水体中噬菌蛭弧菌进行分离和鉴定,旨在获 得对常见肠道病原菌具有广谱裂解作用的分离株, 以期为后续高效优质噬菌蛭弧菌的筛选和相应生物 制剂的开发奠定基础. 1材料与方法 1.1菌株大肠杆菌YZ株(分自河水),大肠杆菌 lxq050,沙门菌lxq033,摩根摩根氏菌,鸭疫里默氏 菌为本实验室分离鉴定.大肠杆菌CVCC1450,沙 门菌肠炎亚种CMCC50094,铜绿假单胞菌CM— CC10104,变形杆菌CMCC49027,阴沟肠杆菌阴沟 亚种CMCC45301,金黄色葡萄球菌金黄亚种CM— CC26003购自中国兽医药品监察所. 1.2噬菌蛭弧菌的分离和纯化 1.2.1宿主菌悬液的制备分别将大肠杆菌 lxq050,大肠杆菌YZ株和肠炎沙门菌lxq033接种 于IB培养基中,37?振荡培养约10h,取培养物经 5000r/min,(4?)离心10min,取沉淀,用25mL 的HM缓冲液悬浮沉淀,重复离心1次,用1mI HM缓冲液悬浮沉淀:. 1.2.2样品的处理以及稀释液制备取河水样品 约250mL低速离心(500r/min离心5min),除弃 大颗粒杂质后,上清液高速(27000r/rain,4?)离 心20rain,再用3mIHM缓冲液悬浮沉淀,经过 1.2m孔径无菌滤膜过滤收集滤液,并用HM缓冲 液作10倍系列稀释. 1.2.3噬菌蛭弧菌的分离和纯化取1mL宿主 菌悬液加入到含有6mI融化的HM上层琼脂试管 中快速摇晃混匀,迅速加入200I稀释的样品滤 液,摇匀后迅速倒人HM下层培养基上,待上层琼 脂在室温下凝固后将平板倒置,28?培养,待噬斑形 成后,挑取单个噬斑至1.5mL无菌离心管中,加入 1mLHM缓冲液,然后在振荡器上振动3min,使蛭 弧菌充分释放,经稀释后采用上述方法经过连续4 代噬斑筛选获得纯的噬斑培养物. 1.3噬菌蛭弧菌的鉴定 1.3.1革兰染色挑取培养基上的噬斑置于载玻 片上,滴一滴无菌水覆盖,涂布后弃去噬斑残存琼 脂,进行革兰染色. 1.3.2透射电镜观察挑取培养基上的3个噬斑置于1.5mL离心管中,加60LHM缓冲液于 28?浸泡约17h,取菌液,醋酸铀负染后在透射电 子显微镜(JEM1230)下观察细菌的形态. 1.3.3PCR鉴定参照文献E73合成噬菌蛭弧菌 16SrRNA基因的特异性引物842R:5r_CGW CACTGAAGGGGTCAA一3和63F:5一CAGGC— CTAACACATGCAAGTC一3.挑取培养基上的分 离菌株噬斑置于1.5mL离心管中,加入1mI无菌 水后振荡3min使其充分释放.经过0.45m滤膜 过滤后,取滤液于98?水浴加热10rain,冰浴3min 制备基因组DNA模板.PCR扩增热循环条件为: 94?热变性4rain;之后94?1min,54?退火 1rain,72?延伸90S,35个循环,最后72?延伸 10rain.PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 结果并进行序列测定(北京三博远志科技有限 公司). 1.4噬菌蛭弧菌宿主范围的测定分别以1.1所 列出的菌株为宿主菌,加入所分离噬菌蛭弧菌,采用 HM双层琼脂平板培养法28?培养观察2周以上, 监测和记录蛭弧菌菌株对选定宿主菌的裂解情况, 以形成肉眼可见的噬斑作为裂解阳性判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 . 1.5噬菌蛭弧菌的简单保存将分离菌株在4? HM双层琼脂平板中保存,分别放置1周,1个月,2 个月,3个月检测活性.此外,刮取双层培养基中含 有噬菌蛭弧菌使其充分释放到HM缓冲液分装到 1.5mL冻存管中,于液氮中迅速冷冻,保藏于 一 8O?,1个月和3个月分别检测其活性. 2结果与分析 2.1噬菌蛭弧菌的分离与纯化以大肠杆菌或沙 门菌作为宿主菌,采用双层琼脂平板培养,28?培养 3d出现肉眼可见透明噬斑,7d后噬斑直径约2, 4mm.经过噬斑纯化传代后各分离株形成比较均 一 的噬斑. 2.2噬菌蛭弧菌的鉴定 2.2.1形态学观察样品经革兰染色后,在光学显 微镜下可见两种大小的革兰阴性菌,其中大杆菌为 宿主菌,小杆菌为噬菌蛭弧菌.样品经过醋酸铀负 染后,在电镜下可见有大量噬菌蛭弧菌(见图1),菌体 有单个弯曲,大小约为0.33mX0.78m,菌体一端 有一根长鞭毛,少量噬菌蛭弧菌附着于宿主菌体上. 2.2.2PCR鉴定以及基因测序分析采用噬菌蛭 弧菌16SrRNA基因特异性引物,以3个分离株的 基因组DNA为模板成功地扩增出预期的基因片 段,而宿主菌基因组DNA对照结果为阴性.基因 序列分析结果证明BDD(GenBankAccessionNo.: HM219227),BDE(GenBankAccessionNo.:HM219228), BDH(Gent~nkAccessionNo.:HM219229).分离株与 8中国兽医杂志2010年(第46卷)第1I期 图1噬菌蛭弧菌BDE负染透射电镜照片 1:大肠杆菌宿主菌;2:噬菌蛭弧菌BDE分离株 m C m . 凸 噬菌蛭弧菌属其他菌株16SrRNA基因序列的同源 范围分别为96.5,99.9Yo,96.0,99.3, 96.3,99.4,同源性比较见表1.其中,与噬菌 蛭弧菌DSM50705株和ARL一12株同源性最高,为 99.2,99.9;与标准菌株HD100的同源性达 97.9,98.6;与BEP2和BEP4同源性差异 最大. 2.2.3噬菌蛭弧菌宿主范围的测定在28?的环 境下培养2周后观察噬斑的生长情况见表2,结果 发现噬菌蛭弧菌分离株对不同宿主菌的敏感性有一 定的差异.BDD和BDH对各宿主菌的裂解能力相 似,但BDD对沙门菌肠炎亚种CMCC50094裂解力 表1BDD,BDE,BDH分离株与噬菌蛭弧菌属部分菌株16SrRNA序列的同源性比 较 PercentIdentity 12345678910"1213 1啊_l9929999g6986g9.496596598698.798.6987986'BDD.seq 20.9艚l{993992g7998796096097998.097.99809e02BDEseq 3010.7粗一;99498499:396396398.498698.488688.43BDHseq 404080.8}I{986996g71971g8698698.69869884BDARL_1216Sseq 514211614啊?{99096896.8100.099.8100O99898.95BDHD'00(AJ292759".seq 6061307041.0{??{9729729g099098.999.088.86BDDSMSOT05(AJ278145.1).seq 7364.2382.93.32.8糖?IIoo096896g97.298796.37BDBEP2(^FI48938.1).seq 8364238293329nnIi9RR96997.29679638BDBRP4(AF1489391)seq 9142116140O10333.3}9980009g89999BDHDI27(AJ292760.1).seq 10132014140210323202溷—雕99.8g989g710BDSRE7(AF2638321).seq "1421161400112.9290.0一一ll|簟l99899911BDTu?113(AY0941221).seq 12132014140210343402020.299712BDJeF1(EU884925.1)seq 13142.01613011238380103010.3龋量{13BDVletnam(AY094123.1)seq 12345678910"1213 要弱于BDH.BDE对大肠杆菌lxq050,肠炎沙门 菌lxq033的裂解力稍弱于其他两株.3株分离菌 株均不能裂解铜绿假单胞菌,鸭疫里默氏菌,金黄色 葡萄球菌金黄亚种.BDE不能裂解变形杆菌. 表2分离菌株BDD,BDE,BDH的宿主范围 "+":噬菌蛭弧菌对宿主菌有裂解作用;"+"数量:噬菌斑大小;" 2.2.4噬菌蛭弧菌的简单保存经检测,噬菌蛭弧 菌在HM双层琼脂平板中,4?保存2个月后仍能 存活,3个月后活性明显降低,部分菌株失活.在 一 80?冻存至少可保藏3个月以上,但保存的噬菌 蛭弧菌在初代复苏过程中,噬斑增长速度减缓. " :蛭弧菌对该宿主菌不裂解,无噬斑 3讨论 本试验采用双层琼脂平板法从水体环境中成功 地分离到3株噬菌蛭弧菌.试验过程参照Varon 和Shilo等的方法引,使用低速离心去较大颗粒 中国兽医杂志2010年(第46卷)第11期9 J]l一甘露聚糖酶对鸡血浆中 1一酸性糖蛋白的影响 梁增成,刘盼琦,诸葛增玉,高浩嵩,马金磊,颜晓冬,孙艳争 (中国农业大学动物医学院,北京海淀100193) 摘要:本论文研究了在正常养殖状况下于饲料中添加药物和p一甘露聚糖酶后对肉鸡血浆酸性糖蛋白(AGP)水平,生产性 能的影响.试验选择健康肉鸡1500只,随机分为3组:一个对照组和两个试验组,每组500只.各个组都添加盐霉素(60g/t 饲料)防球虫感染.第1组为对照组(CONTR),不添加杆菌肽锌和口一甘露聚糖酶,第2组添加杆菌肽锌(5Og/t饲料,ZINEB) 而不添加B一甘露聚糖酶,第3组添加p一甘露聚糖酶(100g/t饲料,MANNS)而不加杆菌肽锌.整个试验期为42d.试验过程 中肉鸡自由采食,自由饮水.结果表明,与对照组相比,两个试验组鸡只血浆中的AGP均明显降低,且p一甘露聚糖酶对成鸡 比杆菌肽锌更有效.在肉鸡生产性能水平方面,添加杆菌肽锌和添加pI甘露聚糖酶对降低料肉比,提高饲料效率均具有明显 的作用,且甘露聚糖酶更有效. 关键词:甘露聚糖酶;el一酸性糖蛋白;肉鸡 中图分类号:$852.2文献标识码:A文章编号:05296005(2010)11—0009,03 Effectof~-mannanaseonplasmaAGPlevelofbroilers LIANGZeng—cheng,LIUPan—qi,ZHUGEZeng—yu,GAOHao—song, MAJin—lei,YANXiao—dong.SUNYan—zheng (CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China) Abstract:ThisstudyW3StOinvestigatetheeffectof—mannanasesupplementationtodietonbroiler plasma1-acidglyeoprotein(AGP)levelandperformance.Onethousandandfivehundredbr oilerswere 收稿日期:200909—07 作者简介:梁增成(1965一),男.兽医师,博士,主要从事兽医微生 物与肠道营养研究,Email:liangzch@263.eom 通讯作者:孙艳争,Email:sunyanzheng258O@163.com 的杂质,然后用高速离心法收集浓缩菌体并尽可能[2]秦巨生.噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂在水生动物养殖上 除去较小的噬菌体,用孔径为1.2m的滤膜过滤[ .]竿需:菌的抑制作 除去宿主菌,取得了较好的效果,大大提高了目标菌用lD]. 扬州:扬州大学硕士学位论文,2()(]7. 的分离率.[4]李戈强,章勇趣,徐伯亥.不同条件下蛭弧菌裂解河弧菌的研 ,, 等.电镜观竺毫噬菌弧菌5,等..噬菌蛭弧菌的分离及初步鉴定?.单 弧状,端生单鞭毛,这与郑英珍等运用扫佃44b吧,4~镜水生生物学抿29, , 33 19 (6 8 ) , : 22(3) . :2 . 65-271. oolO83lO87 …., 观察到的形态相似.基因序列分析证明,所分离的[6]李楠,倪学勤,潘康成.鸡源蛭弧菌的分离及其对鼠伤寒沙 菌株与所报道的噬菌蛭弧菌具有高度同源性,裂解门氏菌病的治疗作用[J]_中国兽医杂志,2..,3(1): 宿主范围与Pineiro等报道基本相似,只是对铜绿E7]JkevitchE.I.1ti.d.1iti..fBzz.拍.d 假单胞菌的裂解性有差异,这可能与噬菌蛭弧菌菌 likeorganismsEJ].cu"ProtocMicrobio1,2005,7B1—17. 株及宿主菌种的不同有关.初步保存试验结果表 E8]Var0l1M,shiloM?Meth.dforseparati.n.fBd.ribri. 明,4~CHM双层琼脂平板法操作简便,蛭弧菌的活i三i.o.nbyffiltrai.tionrtIh]ro. g R h . m 性好,适用于短期保存.O..1970,18—19:145151. 参考文献:Pineiro d SA h , l S . ah . aniu i. kGE l , i Ro . m f b B ergE 1 ,e b tal.Preda fr0 tionpa h t EliStoplH,StarrMP.Bdellovibriobacterioworusgen.etsp.n.,GreatSaltLake,Utah[J].Curr Microbio1,2004,48(2): apredatory,ectoparasiticandbacteriolyticmicroorganism[J].1I3-I17.