小鼠糖尿病模型建立的实验设计

北方民族大学 小鼠糖尿病模型实验设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载     发育生物学课程设计     姓名：徐飞 学号：20103465 生物技术102班 小鼠糖尿病模型实验设计方案 徐飞 （北方民族大学生物科学与技术学院，生物技术，20103465） 【摘要】糖尿病是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢和内分泌障碍,是由于绝对性或相对性胰岛素分泌不足引起的,近半个世纪来,糖尿病患病率和死亡率有明显上升趋势,在我国已成为继心血管疾病、肿瘤之后列第三位的常见病、多发病和慢性非传染性疾病。 【关键词】糖尿病；动物模型；实验设计 【Abstract】Diabetes mellitus is a common genetic glucose metabolic and endocrinal disturbance caused by insulindeficiency absolutely or relatively. In the last half century, diabetes has the increasing rates of morbidity and mortality, and has become the third common, frequently occurring and chronic noninfectious disease after cardiovascular disease and cancer. 【key words】Diabetes; Models, animal; Experimental design 引言 糖尿病(diabetesmellitus,DM)属中医学“消渴”范畴,是以多饮、多食、多尿、身体消瘦,或尿浊、尿有甜味为特征的疾病。现代医学认为,糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病,是由于体内胰岛素缺乏,或拮抗胰岛素的激素增高,或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合征。为探清糖尿病病因,建立理想的DM动物模型是十分必要的,动物模型也可以筛选降糖药物,可以为中医药治疗糖尿病提供实验依据。 动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便，更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。 糖尿病模型的建立方法很多,如手术法、药物法、自发性DM、转基因动物法等。国外多采用自发倾向的糖尿病近交系纯种动物制作糖尿病模型,如BB(BioBreeding)鼠,DB(Dia-betes)鼠和NOD(Non--ObesityDiabetes)鼠。国内多用传统的药物法诱导急性糖尿病模型,诱导的化学药物主要为链脲佐菌素(Streptozotoein,STZ)和四氧嘧啶(AUoxan,ALX)[1]。链脉佐菌素用药量小,建模方法简便,药物毒性小,但价格昂贵,限制了其使用;[2]四氧嘧啶比较经济实惠,但建立的模型不稳定,药物毒性大,试验动物死亡率高,其剂量与给药次数及给药途径可能对动物模型的诱导有一定影响[3],另外动物体重、个体差异及外界环境条件对建模亦有较大影响。 一·实验目的 本试验通过比较四氧嘧啶与链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型的效果,探讨了建模的影响因素,以便诱导出稳定的、理想的及价廉的糖尿病动物模型。 二· 实验原理 目前,大多数学者认为, STZ/四氧嘧啶加膳食诱导造成的模型相对较为可靠、稳定,造模成本比遗传性动物模型低廉,[4]四氧嘧啶(alloxan):四氧嘧啶产生超氧自由基而破坏B细胞,导致胰岛素合成减少,胰岛素缺乏。其作用可能与干扰锌的代谢有关。[5]不同种属动物对四氧嘧啶的敏感性差异很大, 给药剂量依动物及给药途径不同而异,大鼠 150-200 mg/kg( 腹腔注射) , 40-60 mg/kg( 静脉注射) ; 小鼠 200 mg/kg( 腹腔注射) , 85-100 mg/kg( 静脉注射) 。四氧嘧啶药物价廉, 血糖反应敏感, 模型稳定, 可用于人类 T1DM的有关研究, 使用时需知四氧嘧啶对动物肝肾有一定毒性作用。[6] 链脲佐菌素(STZ)是一种抗菌及抗肿瘤药物,可以对某些种属的动物(狗、兔、猴、大鼠、小鼠等)胰岛B细胞选择性破坏,而产生糖尿病。STZ导致糖尿病是由于B细胞通过葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)摄入后减少NAD+的细胞水平。从而导致B细胞坏死。外源性胰岛素抑制 GLUT2和B细胞内胰岛素的表达,可以阻止STZ的致糖尿病效果[7]。其对内脏毒性相对较小,成活率较高,是目前国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法。一般认为,大剂量[11](40-90 mg/kg)的STZ腹腔或静脉可直接破坏胰岛B细胞,多次小剂量[12](15 mg/kg)注射STZ可能是通过免疫机制使B细胞不断破坏而致糖尿病,与T淋巴细胞介导的B细胞不断破坏有关[9]。STZ糖尿病与人Ⅰ型糖尿病有许多相似之处,且模型稳定,因此,是研究Ⅰ型糖尿病较好模型。谢明智等[8]以小剂量STZ(25~30 mg/kg)给雌性大鼠静脉注射,造成胰岛细胞轻度损伤产生糖耐量异常后加喂高热量食物可引起动物肥胖而制得Ⅱ型糖尿病动物模型。 三·材料与方法 3.1供试动物及饲养条件 雄性昆明小白鼠,试验用清洁级、60日龄、体重22-28g,购于医科大学试验动物中心。试验动物喂养于试验动物的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化饲养房。饲喂自配的小鼠料,室内通风良好,相对湿度为40%-70%,室温18-22℃,保持充足的光照。试验前适应性预饲养1周。 3.2试剂与仪器 四氧嘧啶,Sigma公司生产,259/瓶;链脲佐菌素,Sigma公司生产,500mg/瓶;日本京都I血糖仪,日本ARKRAYInc公司生产;电子分析天平,美国METTLERTOLEDO公司生产。 3.3药物的配制 3.3.1  ALX溶液的配制 试验组1:称取ALX150mg,加人质量分数0.9%生理盐水(Physiologi-calSaltSolution,PSS)18mL充分溶解,过滤消毒; 试验组2:分次称取ALX90,60mg,各加人质量分数0.9%生理盐水18ml充分溶解,过滤消毒。 3.3.2  sTZ溶液的配制 链脲佐菌素120mg,加人0.1mol/L柠檬酸及柠檬酸钠缓冲液18mL,在冰浴的条件下充分溶解,过滤消毒,调节酸碱度使pH值为4.2。ALX溶液及STZ溶液必须现用现配。 3.4动物的分组 白鼠购回后,置于18-20℃,明暗交替环境, 适应性预饲养1周;建模前将小白鼠禁食(不禁水) 12h,称量空腹体重、断尾取血测定血糖浓度。选取血糖浓度为3.5~5.5 mmol/L的小白鼠140只,按照建模条件的不同,随机分为4组:1组为ALX 1次给药组;2组为ALX 2次给药组;3组为STZ 1次给药组;4组为对照组(表1)。 3.5糖尿病动物模型的建立 每组按照表1中的剂量腹腔注射(ip)给药,1组、3组和4组分别1次性腹腔注射给药ALX200mg/kg,STZ80mg/kg和生理盐水173mg/kg。2组ALX 2次给药,第1次腹腔注射给药120Mg/kg,间隔24h后再次腹腔注射给药80mg/kg。 由于药物在成模前引起的动物低血糖时相,有可能对小白鼠造成应激性损害,为了观察小白鼠在低血糖时相,补充葡萄糖对小白鼠应激性损害的缓解作用.在腹腔注射给药后4-5h,分别给1,2,3组中50%的小白鼠用质量分数50%葡萄糖灌胃,其余50%的小白鼠用质量分数0.9%生理盐水灌胃,剂量为0.5ml/只;4组用质量分数0.9%生理盐水灌胃,剂量为0.5ML/只。 3.6指标及其检测 注射药物72h后在小白鼠尾端断尾取血,用血糖仪检测小白鼠的禁食12h的血糖浓度,当血糖浓度≥11.1mmol/L时判为建模成功,并称量体重。 3.7数据处理 数据结果用均数加减标准差(x±s)表示,统计处理采用SPSS11.5软件分析。 四·结果与分析 实验预期结果分析： 不同给药处理对建模小白最的影晌对小白鼠进行不同给药处理后可观察到,与4组相比,多数小白鼠在24~48h后出现多饮、多食、 多尿,血糖浓度升高,皮毛松散,体重下降,且随血糖浓度高低而波动部分小白鼠因高渗性脱水或低血糖昏迷而死亡,其中1组于给药后第2、3天死亡6只;2组于给药后第4天死亡3只;3组给药后第4天死亡2只;4组均存活。小白鼠的血糖浓度及体重在给药前后的变化见表2。 由表2可以看出,建模后小白鼠的血糖浓度均较建模前及对照组明显升高,体重均较建模前及对照组降低。两种药物对糖尿病小白鼠的血糖浓度均有显著影响(p<0.05);四氧嘧啶的诱导作用(血糖浓度为19.87和20.19mmol/L)明显大于链脲佐菌素(血糖值为14.79mmol/L)(P<0.05)。 四氧嘧啶建模组小白鼠的死亡率为15%(1组20%,2组10%)及体重下降率为18.1%(1组19.2%,2组17.0%),均高于链脲佐菌素建模组(死亡率3.3%,体重下降率12.0%)(p<0.05), 这说明四氧嘧啶对动物造成的损害较链脲佐菌素大。四氧嘧啶连续2次小剂量给药的建模效果优于1次性高剂量给药,2次给药不仅提高了建模率而且降低了对动物的损害,动物死亡率亦明显降低。 五·讨论 四氧嘧啶(ALX)能选择性地破坏胰岛p细胞,使胰岛素分泌功能丧失,造成内分泌功能紊乱,使糖、脂肪、蛋白质等代谢失调,从而使血糖升高。而代谢失调又进一步会导致负氮平衡,使机体消瘦而体重下降,甚至引起动物死亡。在建模过程中,由于四氧嘧啶不可逆地破坏胰岛细胞,作用迅速而强烈,建模的同时也致肝、肾组织中毒性损害,从而使建模动物死亡率较高[9]。 链脲佐菌素(STZ)为一种广谱抗菌素、具有抗菌、抗肿瘤的性能和致糖尿病的副作用,对试验动物胰岛p细胞具有高度选择的毒性作用,但其作用较为缓和,其对组织的毒性相对较小,动物存活率较高。链脲佐菌素诱导的糖尿病因给药方式不同,其成模效果也有所差别。如采用小剂量分次给药的方法,则建立了与人类I型糖尿病表现相似的动物模型;如采用较大剂量一次性注射给药的方法,则建立了与人类I型糖尿病表现相似的速发性糖尿病模型,其原理可能与胰岛的损伤程度有关[13]。 本试验结果表明,四氧嘧啶(ALX)诱导糖尿病模型的建模率高于链脲佐菌素(STZ),四氧嘧啶组的小白鼠药物注射12h后,血糖浓度即开始上升,但血糖浓度波动很大,进而加快了糖、脂肪、蛋白质等物质的代谢失调,这就造成了建模小白鼠的体重快速下降和死亡率增加。而链脲佐菌素组的小白鼠血糖上升的比较慢,血糖浓度的波动也不是很大,对小白鼠的代谢影响相对较小。故糖尿病症状和动物死亡率较四氧嘧啶低,这可能与胰岛的损伤程度轻于前者有关。由本试验结果可知,四氧嘧啶(ALX)连续2次小剂量给药,可能会比1次性大剂量给药(200mg/kg)降低其对动物胰岛日细胞的毒性损伤作用,从而减轻肝、肾组织中毒性损害,降低动物的死亡率,提高建模率。药物致糖尿病模型动物血糖浓度的改变可划分为3个不同时相:①早期高血糖相,开始血糖浓度升高持续约1-2h,此乃该药抑制胰岛素释放所致;②低血糖相,持续约6-10h,可能是由于胰岛p细胞被破坏,大量胰岛素释放,使血糖浓度显著降低;③12h后出现稳定的高血糖阶段[10]。在本研究中,为了避免药物在低血糖相引起动物低血糖应激性死亡,在注射药物后4-5h,给小白鼠灌胃质量分数50%的葡萄糖,以缓解低血糖时相的应激性损害,较好地控制了成模前(72h)的死亡率,而且提高了建模率。 继续阅读