Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。 Annexin是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内钙离子依赖的磷酯结合蛋白，参与细胞内的信号转导。但仅Annexin V被报道可以调控一些PKC的活性。 Annexin V选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的磷酯酰丝氨酸结合后可以阻断磷酯酰丝氨酸的促凝血和促炎症反应活性。 用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。 本试剂盒还提供了碘化丙啶染色液，碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC 可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。 综上所述，参考下图，用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(下图左下角);凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈阴性(下图右下角);坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(下图右上角)。下图左上角出现的是许可范围内的检测误差。 保存条件: 4?保存，Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需避光保存，半年有效。为长期保存，可以把碘化丙啶染色液适当分装后-20?保存，Annexin V-FITC结合液可以直接-20?保存。 注意事项: 如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。 需自备PBS。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 Trizol Reagent/总RNA提取试剂 TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。 TRIzol试剂可用于小量样品(50,100mg组织、5×106细胞)，也可用于大量样品(?1g组织或?107个细胞)，对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分析等。 本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。 保存条件2-8?避光保存12个月。 实验前需要准备的试剂 氯仿、异丙醇、75%乙醇(用RNase-free水配制)、RNase-free的水。 操作步骤 1. 匀浆处理(Homogenization) 动物组织:按10-30mg组织加入1ml TRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。 培养细胞中提取总RNA 1) 贴壁细胞:无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1ml TRIzol。 2) 悬浮细胞:可直接离心收集、裂解，每1ml TRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。 血液中提取总RNA 直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。 2(分层(Phase Separation) a. 样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。 注:如不进行下一步操作，样品可放入-70?长期保存。 可选步骤:4? 12,000 rpm 离心10分钟，取上清。 如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。 b. 每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相。 3(RNA沉淀(RNA Precipitation) a. 4? 12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。 注:小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。 b. 在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4? 12,000 rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。 4(RNA漂洗(RNA Wash) a. RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75,乙醇。 b. 4? 5,000-8,000 rpm离心1-2min，弃上清;短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2分钟晾干沉淀。 注:RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 5. 溶解RNA(Redissolving the RNA) 沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70?保存。 注意事项 1. 经常更换手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。 2. RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是RNase-free的。 3. RNase-free水的配制 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :将水加入干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌;RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法:玻璃器皿可在150?烘烤4小时;塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 不同组织或细胞中提取RNA预期得率 植物叶片 100,200 μg/g 叶片 动物组织 200,400 μg/g 肝脏组织 动植物培养细胞 5,10 μg/106细胞 革兰氏阴性细菌 2,10 μg/ml DH5α过夜菌 血液 3,5 μg/ml 人全血 RNA纯度及浓度检测 完整性 RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:1.2%胶(琼脂糖浓度);0.5×TBE电泳缓冲液;150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA;植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA;细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。 纯度 OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值(10mM Tris, pH7.5)在2.0左右。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。 浓度 取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算: 终浓度(ng/μl)=OD260×n (稀释倍数)×40