医学蛭类与水蛭素

医学蛭类与水蛭素 医学蛭类与水蛭素 蛭类动物在我国俗称蚂蟥、水蛭、马鳖等，全世界有六百余种，我国也有近百种。它们生活在淡水、潮湿的陆地以及海水里，作为暂时性体外寄生虫有的取食鱼、龟、鳖、蛙、水鸟以及像牛、马和人这样一些哺乳动物的血液，也有的取食蚯蚓、昆虫幼虫、虾、蟹和螺、蚌之类的无脊椎动物的体液、组织以致整个身体。我国对蛭类动物的记载早在公元前‎‎2世纪汉朝初期的《尔雅》中已经出现，对水蛭的应用在《神农本草经》中记述较为详细，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚????”。医圣张仲景(168-188)的《金匮玉幽经》里所谓“下血”即是抗凝血的“破血”作用，由此可见我国早在公元‎‎2世纪便已发现水蛭的抗凝血功能了，这比西方国家利用水蛭‎‎的历史要早千年以上。到15世纪我国明朝李时珍著的《本草纲目》中则对水蛭在内科方面的药效作了详细的说明，并列举出不少的民间处‎‎方，主要用来治疗女子月闭、跌打损伤、漏血不止以及产后血晕等症。古籍中还记载有把饥饿的蚂蟥装入‎‎竹筒扣在洗净的皮肤上，令其吸食脓血以治疗赤白丹肿以及将蚂蟥研成‎‎干粉末与其它中药配伍治疗跌打损伤等症。自梁代陶弘景《本草经集注》以后历代的《本草》中都认为中药用的蚂蟥是指吸哺乳动物血液的种类。不管是水蛭、草蛭、山蛭、泥蛭，在吸牛、马和人血这一点上是共同的，而且强调“用之当以小者为佳”。但是我国早期的文献不可能说清楚使用吸食哺乳动物血液‎‎的蚂蟥治病的道理，以致在现今的《中国药典》中仍然将不吸哺乳动物血液的宽体‎‎金线蛭(Whitmania pigra )和尖细金线蛭(Whitmania acranulata )列为规定的种类，用作传统中药材, 谓其功能是破血通经，消积散瘀，消肿解毒和堕胎。在第二届全国活血化瘀学术会议上，还笼统地将主要是宽体‎‎金线蛭的水蛭确定为35味活血化瘀中药之一，归属于“作用峻裂的破血药范畴‎‎”，这些都是缺乏科学依据的，也给水蛭的医药应用造成了很大的混乱。笔者曾对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市‎‎场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查，发现这些全都是一种不‎‎吸哺乳动物血液，终身取食螺类，主要生活在我国山东、江苏、安徽和湖北广大湖区以‎‎及长江流域及其以北各地河滩与池塘里的宽体金线蛭，全国每年消耗数以十吨计的干品，不断地捕捉大大破坏了这个物种在自然界的资源分布，同时也是与我国古代《本草》中的记载以及现代生物医药研究成果不相符的。造成这种现状的原因在于我国中医药管理、研制和临床应用部门缺乏对蛭类动‎‎物生物学与生物化学的深入认识，不知道在动物分类学上是环节动物门一个纲的‎‎蛭类动物在我国就有近百个种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都‎‎是十分不相同的。几个世纪以前西欧国家也开始使用水蛭治疗心血管病、神经系统病、炭疽、青光眼和乳突炎等病。18-19世纪医蛭吸血法在欧洲曾风行一时，随着科学的进步，这 种带有迷信色彩的治疗方法才逐渐被放弃了‎‎。 近百余年来，随着西方国家首先对吸食哺乳动物血液的水蛭‎‎唾液腺分泌物的深入研究，人们又发现了它们在医疗临床上的许多新用途‎‎。1884年威尔士国家医学院海克‎‎拉夫特(J. B. Haycraft)首先发现吸血水蛭咽部具有的水溶性抗凝血物质。1904年雅各比(C. Jacoby )将这种物质命名为“水蛭素”(Hirudin)。1955年德国马克沃‎‎德特(F. Markwardt)首次从吸血水蛭体内分离提取出较纯的水蛭素，此后对水蛭素的纯化和标准化技术日臻完善。迄今已有十多个国家公布了水蛭素研究的专利并有英国水蛭生物药物‎‎公司(Biopharm UK Ltd )、美国水蛭公司(Leeches U.S.A. Ltd )以及 美国Sigma 生化试剂公司等多家公司在销售不同纯度的天然水蛭素以及其它水蛭产品。研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明水蛭素是已知最有效的天然凝血酶抑制剂，在治疗某些血液性疾病方面优于肝‎‎素，能够更有效地抑制凝血酶诱发的弥散性血管内凝血和静脉血栓形成，在处理诸如败血休克、动脉粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、眼科以及遗传性疾病等缺少抗凝血酶?的病例方面显示出巨大的优越性，从而引起各国医药和生‎‎物学工作者的广泛重视。除此以外，各国科学家还在吸血水蛭唾液腺分泌物中发现‎‎了许多与吸食哺乳动物血液相关联的生物活性‎‎物质，如麻醉剂(Anaestheti‎‎c)、血管扩张剂(Vasodilator)、水蛭透明质酸酶(Hyaluronidase, HAse)、裂纤酶(Hementin)、前列腺素(Prostaglandins)、抗生素(Antibiotic‎‎)、安替斯塔辛(Antistasin)以及博待啉(Bdellins)和伊格啉(Eglins)等其它蛋白酶抑制剂。目前国际上是将吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有‎‎水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情‎‎景的蛭类动物统称为医‎‎学蛭类。1986年至1990年先后在英国威尔士的斯旺西市、加拿大的多伦多市以及耶路撒冷召开了国际水蛭科学家学术讨论会，笔者应邀出席了其中两‎‎次会议并在会上发言介绍了我国蛭‎‎类动物研究概况。1990年至2003年先后六次在欧洲各地召开了包括医学蛭类在内的国际生物治疗学术讨论会。然而至今我国没有任何‎‎人报道过宽体金线蛭和尖细金线蛭体内含有以上任何生物‎‎活性物质，它们也不吸食哺乳动物的血液，所以在本书中笔者未将其归入医学‎‎蛭类的范围加以介绍。我国有着丰富的吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有‎‎水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情景的医学蛭‎‎类有待我们去开发和利‎‎用，现将这些医学蛭类的种类特征和生态分布列述‎‎如下。 9.2 我国医学蛭类的种类特征和生态分‎‎布 蛭类动物(Hirudinea)在动物分类系统中与寡‎‎毛类动物(Oligochaeta)作为两个纲划归环节动‎‎物门(Annelida)的有环带亚门(Clitellata)。它们都具有环带，又都是雌雄同体动物并通过分泌容‎‎纳受精卵的卵茧(cocoon)繁殖后 代，胚胎发生也相同，都缺少外骨骼和功能性的叶足。在蛭纲中较高等的类群‎‎都有恒定的体节数而且又都具有用作运动器官的尾吸盘，其中真蛭亚纲(Euhirudinea)是主要的类群。它们都有32个口后节，尾吸盘又都由7节组成，根据有无可伸缩的吻可以分成为吻‎‎蛭目(Rhynchobdellida)和无吻蛭目(Arhynchobdella)。在无吻蛭目中医蛭形亚‎‎目(Hirudiniformes)较低等，多数有发达的颚，每个完全体节通常5环或更少。笔者在本书中讨论的我国医学蛭类就属于医蛭形亚目医蛭‎‎科(Hirudinidae)中的医蛭属(Hirudo)和牛蛭属(Poecilobdella)以及山蛭科(Haemadipsidae)中的山蛭属(Haemadipsa)。根据笔者统计，目前我国已发现医蛭属‎‎2种、牛蛭属6种、山蛭属10种，它们在医药上都具有广阔应用情景‎‎，现将这3属医学蛭类主要种类的形态特征及其生态分布列‎‎述如下。 (一) 医蛭属Hirudo Linnaeus, 1758 体中型至大型，长度30-150 毫米。背面通常有纵行的条纹。头部背面有5对眼，甚明显。体表感觉乳突通常背面‎‎8列，腹面6列。节IX至XXIII 或XXIV为完全体节‎‎，每节5环相等。环带占据15环，位于X 至XIII 。体内嗉囊在节X 至XIX之间，每节各有一对大的初生‎‎侧盲囊和一对小的次生侧盲囊，末对最大并向后伸至节‎‎XXV。水生种类，已知全世界有17种，我国仅有2种，其区分见以下检索表。 医蛭属分种检索表 1(2) 背面黄白色纵纹宽阔，灰绿色的纵纹狭窄，腹侧各有一条很细的灰绿色的纵纹， 阴道囊狭长???????????????日本医蛭Hirudo nia nippo 2 (1) 背面冬青绿色纵带宽阔，淡绿色的纵纹狭窄，腹侧没有细长的纵纹，阴道囊卵 圆形??????????????????丽医蛭Hirudo pulchra 日本医蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 (图9-1) 身体狭长，略呈圆柱形，背腹稍扁平。体长30-60毫米;最大体宽4.0-8.5毫米;尾吸盘直径40-5.5毫米。头部背面有5对眼，大而明显，在节II-VI背侧排列成弧形。前3对各占一环;第3，4对相隔一环;第4，5对相隔2环。背面有5条黄白色的纵纹，以中间一条最宽和最长。黄白色的纵纹又将灰绿的 底色隔成6道纵纹，以背中两条最宽阔，背侧的两对较细。腹 面两侧缘，各有一条很细的灰绿色纵纹。雄性生殖孔位于第31 /32环沟上，雌性生殖孔位于第36/37环沟上，两孔相隔5环。 咽部有6条内纵褶，背中及腹侧各一对。阴道囊狭长。本种在我 国分布很广，北起东北各省和内蒙古，西至四川和甘肃，南达 台湾和广东，但以长江流域各地数量较多。广泛栖息于水田及 其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，特别是常年积水或排水‎‎不 良的沤田和坂心田中数量最多。在水田里多集中在四角或田 边，也有钻进田埂泥土中的。每年11月底开始潜入深土中越冬‎‎， 第二年3月下旬到4月上旬，当气温达到10-13?时开始出土活 动。在长江中、下游地区，当气温升至13-15?时开始交配，约 经一个月后开始产茧‎‎，再经过16-25天孵化，幼蛭即可以从茧中 钻出。通常每茧孵出3-22条幼蛭，多数10条左右。日本医蛭是 被中国药典列入的唯一吸食哺乳动物血液的种类，也是具有很好医疗效果的种类，可以用于显微外科手术后的吸血治疗以及水蛭‎‎素、水蛭透明质酸酶等生物活性物质的‎‎分离和提取。 图9-1 日本医蛭Hirudo nipponia Whitman, 1886 背面观全形图 an. 肛门;cs. 尾吸盘;eyes 眼;ggs. 灰绿色的纵纹; sen. 体表感觉乳突;yws. 黄白色纵纹. (笔者图，1996) (二) 牛蛭属Poecilobdella Blanchard, 1893 身体中等大小至大型，长度40-210毫米，体形粗壮。皮肤粗糙，前后端成网状或有许多疣状突起。体色艳丽，有线形色斑或条纹，具有绿色、褐色或淡红颜色。头部背面5对眼，排列如医蛭属。共有15个完全体节，各有5环，在节IX至XXIII之间。体节感觉器大而明显，是区分体节的标记。两生殖孔被5-9环隔开，分别位于节IX – XIII上。具齿的颚两侧表面有排‎‎列成3或4纵列的唾液腺乳突。雌性生殖器官很特殊，有一个很大的盲囊，阴道长短不一。总输卵管与阴道一起开口向外，或开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上。水生种类，已知全世界有8种，我国已发现6种，主要分布在广东、广西、云南、海南以及福建等地，其区分见以下检索表。 牛蛭属分种检索表 1(5) 阴道短，总输卵管与其一起开口‎‎向外??????????????????2 2(3) 两生殖孔被7环隔开，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上，尾吸盘直径等于体宽 ????????????????????棒纹`牛蛭Poecilobdella javanica 3(4) 两生殖孔被5环隔开，雌生殖孔在节XII的b5/b6上，尾吸盘直径小于体宽 ????????????????????菲牛蛭Poecilobdella lensis manil 4(3) 两生殖孔被9环隔开，雌生殖孔在节XIII的b2/a2上，尾吸盘直径接近体宽 ?????????????????????远孔牛蛭Poecilobdella similis 5(1) 阴道有长柄，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管‎‎端，或直接开口到盲囊上 ?6 6(7) 阴道柄几乎与盲囊及阴道管的长度相等，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端 ???????????????????颗粒牛蛭Poecilobdella granulosa 7(8) 阴道盲囊呈卵圆形，总输卵管直接开口到靠近阴道管的‎‎盲囊部位 ???? ???????????????????湖北牛蛭Poecilobdella ensis hubei 8(7) 阴道盲囊呈棒槌形，总输卵管直接开口到远离阴道管的‎‎盲囊部位 ???? ???????????????????南京牛蛭Poecilobdel‎‎la ngensis nanji 菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842) (图9-2) 个体较大，体长40-113毫米或更长;最大体宽‎‎3..5 – 20毫米;尾吸盘直径3 – 14 毫米，明显小于体宽。身体狭长且扁平。活着时背面黄褐色或橄榄绿色，背中有一条不显著的兰灰色纵纹，体表皮肤体节感觉器大而明显。两生殖孔通常被5环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XII的b5/b6上。尾吸盘直径明显小于体宽。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有150个锐利的齿。射精管粗大，呈纺锤形。精管膨腔短，呈圆球形并被一层疏松的腺体覆盖着。阴道短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国分布很广，北起浙江南部、福建、台湾、广东、广西、海南和香港均有发现，以两广和海南各地数量较多。生活于水田、沟渠或池塘里，主要吸食水牛和人的血液，造成危害。每当插秧或在水田边洗‎‎手造成水的波动时，菲牛蛭随即漂游而来，甚至顺着稻丛爬到人的手上吸血，吸饱血液后有的离去，有的前吸盘松开就像葫芦状悬挂在牛的肚皮下‎‎。吸一次血可以一年多不再吸血，只要有水仍能够活得很好。据中国中医研究院基础‎‎理论所欧兴长等人的研究证明菲牛蛭所含氨基‎‎酸总量为73.11%，在所测十种水蛭中含量最高，其抗凝血酶活性(176抗凝单位/克)，在所测四种水蛭中最高。可见用菲牛蛭来分离和‎‎提取水蛭素等生物活性物质将是十分有前景的‎‎。 图9-2 菲牛蛭 Poecilobdella manillensis (Lesson, 1842) a. 背面观全形图χ2;b. 雌性和雄性生殖系统?6 an. 肛门;cod. 总输卵管;cs. 尾吸盘;de. 射精管;eb. 射精球;ep. 贮精囊; eyes 眼; ga. 蛋白腺;o. 卵巢;od. 输卵管; pr. 前列腺;sp. 侧中斑点; sen. 体节感觉器;ss. 上缘斑点;vad. 阴道管; vc. 阴道盲囊;vd. 输精管。 (笔者图，1996) 棒纹牛蛭Poecilobdella javanica (Wahlberg，1855)(图9-3) 图9-3 棒纹牛蛭Poecilobdella javanica (Wahlberg， 1855) a. 背面观全形图χ1.5;b. 雌性和雄性生殖系统?4.5 an. 肛门;at. 精管膨腔;bas. 棒纹;cod. 总输卵管;cs. 尾吸盘; de. 射精管;ep. 贮精囊;eyes 眼; ga. 蛋白腺;o. 卵巢;od. 输卵管;ps. 阴茎囊;sp. 侧中斑点;qs. 方形侧缘黑斑;sen. 体节 感觉器;te. 精巢;vad. 阴道管; vc. 阴道盲囊;vd. 输精管。 (a. 笔者图;b. 自宋大祥等，1978) 个体很大，体长60 – 170 毫米或更长，个别的可达225毫米;最大体宽为10 – 19 毫米;尾吸盘直径10 – 19 毫米，常常等于最大体宽。身体狭长且扁平。活着时体表颜色极为艳丽，背面橄榄绿或草绿色，偶尔橄榄棕色。背中自眼间区至肛门前‎‎，有一断裂为22根棒的黑褐色纵纹。两生殖孔通常被7环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上。皮肤感觉器非常地大而明显，伸长并与体轴倾斜或成直角。皮肤成网状，特别是在身体的两端。尾吸盘很大，直径常常等于最大体宽的宽度。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有100 - 140个锐利的齿。精管膨腔很短，具有比较宽的阴茎囊。阴道也短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国云南西南部地区，如西双版纳等地广泛分布，栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，数量众多。这些孽生地杂草丛生，水流缓慢或停滞。平时它们潜伏在草丛中，当人、畜下水产生水波时立即漂游而来并‎‎爬到人、畜身上吸血，直至饱食后离去。雨季本种牛蛭最为繁盛，而在干旱季节里则极少见到，通常潜伏在泥草里越冬‎‎。 (三) 山蛭属 Haemadipsa Tennent, 1859 身体小而细长，呈亚圆柱形，从尾吸盘至头部渐渐变细，大小与形状又随取食程度而改变，通常8 – 50毫米长。棋盘格形的皮肤，特别是在头部及尾吸盘上最明显。头部背面有5对大眼，分别位于第2、3、4、5、8环上或2、3、4、6、9环上，第4、5对眼被2环隔开。身体背面通常有纵纹及斑点。完全体节有5环。两生殖孔通常被5环(节XIb5/b6 和节 XIIb5/b6)隔开，但少数种可能被更多的‎‎环隔开。尾吸盘巨大，在其背侧与体部交界处‎‎有2或3对叶状的耳状突，腹面有许多明显的辐射‎‎肋。口内有3个非常高而明‎‎显的颚，但其上没有唾液腺乳突，具有锐利并弯曲排列的细齿。射精球不发达，呈梨形的精管膨腔小，其表面覆盖有疏松的腺体。阴道分成为狭窄的管部和大而呈圆‎‎柱形的盲囊 。已知全世界有12种和8亚种，我国已发现9种和2亚种，主要分布在华南和西南一些潮湿的山林地区，其区分见以下检索表。 山蛭属分种检索表 1(2)在第3和第4眼之间几乎总被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射‎‎肋74 – 76 条???????????????????????????????? 3 2(1)在第3和第4眼之间可以或不被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射‎‎肋71 – 73条 ?????????????????????????????? 4 3(6)背部有3条黑色或暗褐色条纹，中央一条狭细，有时断裂或完全消失???? ?????????????????????森林山蛭Haemadipsa stris sylve 4(5)身体通常红褐色或橙色，具有黑色斑，背中有一条黄色或黄绿‎‎色条纹???? ???????????斯里兰卡山蛭，模式亚种Haemadipsa nica zeylanica zeyla 5(8)身体颜色通常易变，但褐色斑点图案不变，背中较暗的区域有一条黑色 或褐色条纹???????????斯里兰卡山蛭，敏捷亚种H aemadipsa zeylanica agili‎‎s 6(7)背部有3条深褐色条纹，中央一条完整，贯穿前后 ?????????? ???????????????????? 日本山蛭 Haemadipsa ica japon 7(8)背中及两侧缘上方有3条黑褐色条纹，中央一条粗大 ?????????? ??????????????????? 珠峰山蛭 Haemadipsa qomolangma 8(9)背中黄褐色带状区的边‎‎缘有由17对弧形线联结成的两条黑褐色条纹，中央尚有一 根细条纹??????????????? 盐源山蛭 Haemadipsa anensis yanyu 9(10)背中宽阔的淡黄色带状区的边缘有的地方突向外侧区内，中央及其两侧有3条 较细的棕色条纹???????????? 海南山蛭 Haemadipsa na haina 10(11)背中较宽的浅色带状区‎‎两侧共有6条粗而直的黑色条纹，无中央条纹 ?? ?????????????????? 天目山蛭 Haemadipsa ushana tianm 11(12)背中宽阔的乳白色带状‎‎区共有5个条纹并在各节上有凸向‎‎外的斑块，中央一条 狭细 ????????????? 广川山蛭 Haemadipsa chuanensis guang 12(11)背中乳白色带状区无中央条纹，内背侧一对纵纹粗而直，外背侧一对纵纹细 ???????????????? 盐边山蛭 Haemadipsa anensis yanbi 日本山蛭 Haemadipsa japonica Whitman, 1886 (图9-4) 身体短小，略呈圆柱形，前半部逐渐变得狭细。体长10 – 36毫米;最大体宽2 – 5毫米;尾吸盘直径2.0 – 4.5毫米。体色黄褐，背面有深褐色的纵纹3条，中央一条较粗并贯穿身‎‎体前后，腹侧没有两条纵纹。头部背面有5对排列成弧形的大眼，分别位于第2、3、4、5和8环的背侧，第3、4对眼常在连续的环上。完全体节各有5环，共有14节。雄生殖孔位于节XIb5/b6环沟 上，雌生殖孔位于节XIIb5/b6环沟上，两孔相隔‎‎5环。肛门在最后一环与尾吸盘交界线上。尾吸盘腹面通常有74 – 76条辐射肋。贮精囊甚大，呈U 形来回折叠。阴道囊是一薄壁的葫芦形盲囊。本种在我国主要分布于‎‎云南西部及西南部(如西双版纳等地区)、四川西南部，以及台湾的山地。营陆地生活，栖息温暖、潮湿的山谷和坡地树林中，在高山围成的平坝地带最多，也见于池塘、溪沟的岸边和稻田田埂杂草丛以及竹林中，但决不在平原上活动，不水溪亦不会游泳。一般呈点状或块状分布，每平方米的杂草、石头、泥土范围内可以采集到上百条之多。平时潜伏在草丛根基部分，石缝内，苔藓或落叶与枯枝上。离人、畜1米远以外即能感觉‎‎得到，动作十分敏捷，雨天时更为活跃。在夏秋两季当早晨雾水多时或雨后也极为活跃，靠近中午或下午太阳暴晒时以及干旱季节里则极少出来活‎‎动。在5 – 9月的雨季里山蛭进行‎‎繁殖孳生，7月初可见到幼蛭，特别是8月初最多。每下一场雨即孵化出一‎‎批幼蛭，长约5 – 9 毫米，呈圆柱形，生长迅速。在10 月至次年3月的旱季里极少见到日‎‎本山蛭，通常从11月起在靠近积水的潮湿土里或石缝‎‎里蛰伏，次年4 – 5月才出蛰活动。 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana Song, 1977 (图9-5) 身体中等大小，呈圆锥形，背面隆起，腹面平坦。体长11 – 36毫米;最大体宽2.5 – 6毫米;尾吸盘直径2 – 6毫米。活体时背面棕色或灰褐色，有许多不规则的灰黑色或黑色斑点。背中有一条较宽的浅色‎‎的带状区，其两侧共有6条3对粗而直的黑色纵纹。背侧区色深，多黑褐色斑点。腹面有咖啡色的斑点或由斑点聚集成的斑块，腹侧有两对平行的棕色纵纹，腹中为一条狭窄的银白色区带。贮精囊在远离射精球的地方螺旋盘绕。阴道囊粗而短，前部有一狭窄的颈部。本种仅见于我国，广泛分布在华东、华中、华南以及西南一些潮湿的山地丛林里。先后在浙江天目山、湖北神农架、河南太行山和大别山的南麓、四川峨眉山和盐边县、广东高州县以及海南岛发现。栖息于海拔600 – 2200米山地温暖、潮湿、阴暗的原始森林、灌木丛、冷竹林、溪边草丛和草坡上，尤其以小道旁边和枯枝落叶中较多‎‎。活动季节一般在每年4月下旬够至9月中、下旬，但以6月下旬至8月中、下旬小雨、雨后或者晨露未干之前时数量最多，也极为活跃。夏季至秋初在石块下、枯枝落叶中、草丛和松土内以及地表丛生的苔藓中产茧。冬季仅偶而见与青苔和草被的下面‎‎。 图9-4 日本山蛭 Haemadipsa japonica Whitman, 1886 a. 背面观全形图χ7;b.头部背面观 ?10; c. 雌性和雄性生殖系统?10 an. 肛门;au. 耳状突;cs. 尾吸盘;cod. 总输卵管;de. 射精管;ds. 背感器; eb. 射精球;ep. 贮精囊;eyes 眼;o. 卵巢;od. 输卵管;pr. 前列腺; ps. 阴茎囊; st. 条纹;te. 精巢;va. 阴道囊; vad. 阴道管; vd. 输精管。 (a，c笔者图;b自宋大祥等，1978) 图9-5 天目山蛭 Haemadipsa tianmushana Song, 1977 a. 背面观全形图χ4.5;b. 雌性和雄性生殖系统?10 an. 肛门;au. 耳状突;cs. 尾吸盘;cod. 总输卵管; ds. 背感器; ep. 贮精囊;eyes 眼;o. 卵巢;od. 输卵管;pr. 前列腺;ps.阴茎囊; sp. 斑点;st. 条纹;te. 精巢;va. 阴道囊;vad. 阴道管; vd. 输精管。 (笔者图，1996) 9.3 医学蛭类的唾液腺分泌物及其活性‎‎成分 蛭类动物的消化系统都是由口、口腔、唾液腺、食道、嗉囊、肠、直肠和肛门等部分组成的，而所有吸血蛭类的口都开口在前吸‎‎盘的腹中，口内是一完全围绕咽的口腔部分，在口腔内通常有3个(或2个)呈三角形排列的肌肉性‎‎颚，在颚的脊缘上有几丁质或部分是钙质的单列齿，通常唾液腺开口在颚脊上的齿之间，但在牛蛭属中则开口在颚两侧分散着的乳突上‎‎。由辐射肌和横肌构成的颚能牢固地贴在哺乳动物或人的皮肤上，借助三条或两条环形锯一样的齿列往复地动作即可将皮肤‎‎割成“Y”形切口。当口腔后的肌肉形咽鼓动时，由于负压的作用血液可以自由地流入消化道内‎‎。与此同时，咽头和食道两侧的唾液腺分泌包含有水蛭素(hirudin)在内的抗凝剂(anticoagulant)、血管舒张剂或叫类组织‎‎胺(histamine)以及麻醉剂的分泌物。将其注入伤口并与血液‎‎混合，从而使伤口血流量大增，流进嗉囊储藏的血液不‎‎会凝固，来自内共生细菌的抗菌素则保护血‎‎液使之不致在消化之前‎‎就变质(见图9-6)。医学蛭类在医疗临床上的许多新用途，无疑是以对其唾液腺分泌物中生物‎‎活性成分的深入了解为基础的。随着对医学蛭类唾液腺分泌物中生物活性成分‎‎认识的不断深化，它们在医疗临床以及其它生命科学中必将发挥更重要的作‎‎用。 图9-6 日本医蛭 Hirudo nipponia 消化系统解剖图 a. 消化系统;b. 和 c. 颚及其附属器官 an. 肛门;cr. 嗉囊; cs. 尾吸盘;int. 肠;ja. 颚;mth. 口; oe. 食道;rt. 直肠; salg. 唾液腺; wr. 纵褶。 (笔者图，1996) (一) 水蛭素(Hirudin) 关于天然水蛭素的研究、报道和专利，决大部分是利用欧洲医‎‎蛭(Hirudo ‎‎) inalismedic 的头部和整个身体做材‎‎料的，经乙醇脱水，然后加丙酮沉淀等一系‎‎列的步骤而得到水蛭素粗制品的。1970年德国马克沃德特(F. Markwardt)采用乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得了水蛭素‎‎纯品。1985年沃尔斯曼(P. Walsmann)和马克沃德特改进了纯化方法，采用离子交换与亲合色谱相结合而获得了高纯度的水蛭素‎‎。1986年约翰尼斯(Johannes)等人报道了一种五步纯化法，其中使用了高效液相色谱新技术。根据前人的研究得知水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子量多肽，其中谷氨酸和天门冬酰‎‎胺的含量较高，分子量为7000左右，含有三个二硫键。已分离鉴定出7种异构体。二硫键是决定其分子构型稳定性，保持高抗凝活性的关键。当二硫键被氧化或还原，或者分子发生了蛋白降解，则失去其抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化，或失去酸性的C-端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。水蛭素的等电点较低，在3.8 – 4.0之间。在室温下能长期稳定，而在70?以下可以保持活性，干样也可以保存一年，在水中加入百里酚结晶‎‎亦能保存6个月，其热稳定性随pH值的减小而增加。水蛭素能被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶破坏，却不受血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶A 的影响。水蛭素通过阻塞凝血酶的底物结合基团致使凝血酶失去活性，处在特异空间部位的水蛭素自由羟基与凝血酶自由氨基通过静电引力而结合，产生的络合物在凝血酶保持活性的整个PH范围内不会解‎‎离。1970年德国马克沃德特首先报道了一种测定水蛭素含量的方法 - 凝血酶滴定法，即根据水蛭素与凝血酶反映速度快‎‎，在化学计量学上呈正相关关系，可以用抗凝血酶单位来表示水蛭素‎‎的含量，一个抗凝血酶单位(AT-U)是指在37?下使1个国际单位的凝血酶失活所需的水蛭素量。一个抗凝血酶单位对应‎‎于0.1微克的纯水蛭素，一条成熟的吸血水蛭约‎‎含有285个抗凝血酶单位的水蛭素。由于水蛭素具有活性高、结构稳定、不易失活以及后期纯化成本低的优点，是开发抗凝、溶栓新药的理想原料。 (二)水蛭透明质酸酶(Hyaluronidase, HAse) 克劳德(Claude, 1937)首先报道了在医蛭提取液中有一种“扩散因子”，后来林克尔等人(Linker et al., 1960)证明这是一种透明质酸酶。由于能够专一水解透明质酸的内葡萄糖苷酸键，因此是一种内切 – β– 葡糖苷酸酶(endoglycuronidase)，只降解透明质酸而不降解其它粘多‎‎糖，活性能被10ˉ5mol/ LHg++ 完全抑制，但不被肝素抑制。不同于从哺乳动物和其它动物组织中提取出来‎‎的内切 – β– N乙酰氨基葡糖苷酸酶和从微生物体内提取出来的内切己‎‎糖胺酶。它是分子量为28500的单体蛋白质，在50?以下稳定，催 化作用的最适pH是5.5，最适温度是38?，可溶于50%的硫酸铵溶液，在70%饱和度硫酸铵溶液中的溶解度最小，冻干制剂能保持活力许‎‎多个月。水蛭透明质酸酶的活力单位被定义‎‎为:在pH5.5和38?的最适条件下，一小时内从透明质酸中释放1微克葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。一个这样的单位大约相‎‎当于对从哺乳动物来源的透明质酸酶规定的国‎‎际单位的20倍，比活力规定为每毫克蛋白含有的单‎‎位数。赫斯特(Hirst, 1941)证实了水蛭透明质酸酶‎‎强有力的抗菌性能在于能溶解体内和体外细菌的多糖被膜并形成抗体。水蛭透明质酸酶能促进药物迅速穿‎‎透皮肤并在皮内扩散，在治疗血栓性疾病时不‎‎被肝素抑制，因而具有比哺乳动物来源的透明质酸酶更大的‎‎应用价值。芭格达萨萝娃(Bagdasarova, 1969)首先发现水蛭透明质酸酶在治疗青光眼(白内障)方面有很好的效果。英国人用其治疗心血管病，也取得了良好的效果。由于水蛭透明质酸酶能降解在细胞间起联系作用的粘多糖‎‎–透明质酸，如果将它与水蛭胶原酶一起使用则可以分散动物组织的细胞，便于挑取单个细胞进行分代培养或细胞克隆，这在生物工程中特别是细胞工程中‎‎应用很广泛并已成为眼科和整形医学中的有力工具。不像哺乳动物来源的透明质酸酶，水蛭透明质酸酶不能降解软骨素或硫酸软骨素，故可以在生物化学上用来原位鉴定‎‎透明质酸，研究滑液、HA – 纤维蛋白以及其它含HA分子的细胞间基质。 (三)前列腺素(Prostglandins) 俄罗斯国立莫斯科大学巴斯柯娃等‎‎人(Baskova et al., 1987)应用放射免疫方法从欧洲医蛭的头部和整个身体中检测出前列腺素并‎‎且是以6 – Keto – PGF (简称 6 – KF) 的前体形式出现，这是一种前列腺素转化成的产物，具有明显的抑制血小板聚集和抗动脉硬化的功能特性，副作用也小，而血小板聚集是引起动脉粥样硬化和心肌梗塞的主要起因‎‎。6 – KF 前体多为一个具有五碳环和两个双键侧链的二十碳脂肪酸‎‎(PGI2),它能迅速转化为性能稳‎‎定的最终产物6 – KF，利用检测6 – KF的含量变化可以判‎‎断PGI2的含量以及消长变化。研究表明前列腺素是人体内分布最广，作用极大的一类生物活‎‎性物质,它通过对某些激素的调节来控制人体平滑肌的收缩、血液供应(血压)、神经传递、发炎反应、电解质出钠以及血液凝固等生理过程。在实际应用中可以作为‎‎消散血栓和抗动脉脉粥样硬化的药物，是制造一系列具有良好‎‎性能药物的原料。 (四)安逖斯塔辛(Antistasin) 美国费城宾夕法尼亚医院的生物化学家加西克‎‎等人(Gasic et al., 1983-1986)从一种墨西哥水蛭(Haementeria officinalis)的唾液腺中分离出来一种含有119个氨基酸的多肽，取名安逖斯塔辛(Antistasin，ATS)。无数动物的和离体的，用水蛭的以及重组体的安逖斯塔辛‎‎(rATS)做的实验证明ATS能通过抑制含有fxα因子的血清酶来阻止血液凝固以及动脉和静脉血栓形成，抑制培养的主动脉光滑肌增生，也能减少实验动物肿瘤细胞的扩散‎‎，使肿瘤细胞保持运动状态而无法聚集在一处。这样十分有利于肿瘤患‎‎者体内的免疫 系统将肿瘤细胞各个‎‎击破。ATS还在免疫组织化学实验中常常用来发现‎‎含有fxα因子的恶性细胞一小细胞癌，是一种具有巨大治疗优‎‎势的fxα因子抑制剂‎‎。fxα因子是一种培养光滑肌细胞的促细胞分裂剂并且能造成从内皮细胞来的促细胞分裂剂的释放。在体内，这些影响可能是对内膜过度增生促‎‎成的主要因素，因此ATS有抑制从内膜细胞来的以及在培养‎‎中来的fxα因子的作用。在动物模型中已证明ATS的体内治疗半寿期‎‎在30小时以上，它是一种稳定的多肽抗凝剂。常用的抗凝剂肝素有较低的治疗学指数以及较高的出血危险，有可能危及血小板功能的安全并且对抗凝血酶?缺乏症病人的治疗是无效的。重组体的安逖斯塔辛(rATS)在体内有长的治疗半寿期，不会因治疗剂量产生出‎‎血或影响出血时间。因此rATS是一种对正常止血有最小影响的有效血栓抑制剂。概括地说安逖斯塔辛(ATS)是一种有效的，实用的，具有出血性并发症最小危险的抗凝剂，至少有等于促红细胞生‎‎成素(erythropoietin, EPO)一样的商业价值。 9.4 医学蛭类化学感受器的特异性以及唾液腺分泌‎‎物的采集 蛭类动物为了取食、生殖和自身的防御必须不断地通过光、水波、化学物质及物理刺激来接受周围环境的信息，对每种信息又有相应的‎‎感觉结构。在水蛭身体中部体节上有由两极细胞构成的皮‎‎肤感器(sensillae)，这种感器对微弱的水扰动和光刺激都非常敏感，可以发现和传导这些微‎‎弱刺激。水蛭对包括食物在内的种种化学刺激，特别是吸血种类对血液刺激的反应‎‎都局限于头部背唇及口部皮肤上的化学感受器(chemoreceptors)。所有的皮肤感受器都是通过神经系统的传导，使身体作出相关行为反应的。美国埃利奥特博士(Elliott,1987)发表了她用扫描和透射电子显微镜观察排列在欧洲医蛭头部及口部皮肤上化学感受器的结果。发现头部背唇皮肤上有‎‎大小不同的两类纽扣状的纤毛墩(mound)，较大的一类直径约35微米，较小的一类直径约10微米，它们由具有均匀长度的多纤毛细胞组成，这与具有长鞭状纤毛和‎‎短硬纤毛的皮肤体节感器在形态和功能上都不‎‎相同。除了背唇皮肤上的纤毛墩以外，在口的内侧皮肤上还发现了一类由‎‎3一4根短棍棒状突起构成的结构‎‎，也起到化学感受器的作用。同时她发现了吸血水蛭对氯化钠和精氨酸的简单混合液有如对全血一样的作用，通过头部背唇及口部皮肤上的化学感受器引起‎‎取食反应。 图9-7 吸血水蛭化学感受器的扫描电子显‎‎微镜观察 1 日本医蛭头部背唇化学感受器扫描‎‎电镜图;2 日本医蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图;3 湖北牛蛭头部背唇化学感受器扫描‎‎电镜图;4 湖北牛蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描‎‎电镜图;5 日本医蛭口部内侧皮肤上的短棍棒‎‎状突起扫描电镜图;6 湖北牛蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描‎‎电镜图 (笔者图，2001) (一) 扫描电子显微镜观察 为了弄清我国两属吸血水蛭化学感受器的特异性，笔者与武汉大学电子显微镜室的同事合作做了日本医蛭和湖北牛蛭头部背唇及口‎‎部皮肤的扫描电镜观察以及取食行为实验。扫描电镜观察结果证明‎‎我国两种吸血水蛭头部背唇皮肤上也有两类大小不等的纤毛感觉墩，呈带状排列，约150个左右，每个墩的中央是由长度均一的纤毛状突起构成的纽扣状结构，前者的纤毛较稠密，后者的纤毛较稀疏。较大的一类纤毛感觉墩在光学显微镜下不具色‎‎素斑点，而在扫描电镜下日本医蛭每纤毛感‎‎觉墩约有30根等长的纤毛，湖北牛蛭每纤毛感觉墩 约有25根等长的纤毛‎‎，前者呈稠密的丛状，后者呈稀疏的环状(见照片图组I: 1, 2 和3，4)。在口部内侧皮肤上也有由3 – 4 根短棍棒状突起构成的结构，日本医蛭的突起呈密集丛生状，湖北牛蛭的突起呈稀疏‎‎丛生状(见照片图9-7: 5和6)。 (二) 取食行为实验 为了验证以上两种吸血水蛭化学感受器的分布位置与取食‎‎反应的关系，笔者特用两组小玻璃杯分别盛以新鲜的猪血和牛血，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现日本‎‎医蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜猪血的小玻璃杯非常敏感并喜食猪血，湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜牛血的小玻璃杯非常敏感并喜食牛血。同时又用经过手术切除头部背唇和口部皮肤以及只部分切开而不摘除头部背唇和‎‎口部皮肤的两种饥饿吸血水蛭做了以上实验，重复多次之后发现切除头部背唇和‎‎口部皮肤的个体对盛有新鲜猪血和牛血的小玻璃杯均无任何取食反应发生，然而部分切开又不摘除头部背唇和口部皮肤的个体对以上的小玻璃杯有与不切除头部背唇和口部皮肤的个体同样的‎‎取食反应发生。这进一步证明了两种吸‎‎血水蛭的化学感受器均‎‎分布在头部背唇和口部‎‎皮肤上。 (三) 吸血水蛭化学感受器的特异性以及唾液腺分泌‎‎物的采集 为了验证猪血和牛血中何种成分可以通过两种吸血水蛭化‎‎学感受器引起取食反应。笔者用三组小玻璃杯分别盛以哺乳动物血液中‎‎均含有的150mM氯化钠，1mM L精氨酸以及150 mM 氯化钠和1mM L精氨酸，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现两种饥饿的吸血‎‎水蛭均对盛有150 mM 氯化钠和1mM L精氨酸的小玻璃杯非常‎‎感兴趣，有如取食血液一样地取食这种混合液。这种对哺乳动物血液中固有成分(氯化钠和精氨酸)必须浓度的选择性识别是专一的，这在引起起取食反应的过程中起决‎‎定作用。由于氯化钠和精氨酸都是以很高的浓度存在于哺乳动物血‎‎液和汗液中的，我们可以利用哺乳动物的血液和汗‎‎液在野外诱扑各种吸血水蛭，也可以利用必须浓度的氯化钠和精氨酸在室内从饥饿的活体吸血水蛭体内大量提取重要的心血管药物原料一医学蛭‎‎类唾液腺分泌物。一条饥饿的活体吸血水‎‎蛭可以反复使用6 – 7 次，这比用头部或整个身体匀浆后做生化提取、分离和纯化要节省大量‎‎的试剂、时间和金钱。吸血水蛭唾液腺分泌物大量提取技术的解决，将大大促进医学蛭类的药物开发和‎‎利用。 9.5 医学蛭类唾液腺分泌物活性成分的分离、纯化与活力测定 (一) 水蛭素的分离、纯化与活力测定 此段以我国产的日本医蛭为对象，先将其充分饥饿再采用以上唾液腺分泌物的采集方法大量提取唾液腺分泌物，置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250 – 300 ml加进4倍置冰箱中‎‎?4下预冷的含15%水的冷丙酮，搅拌后置冰箱中4?下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷‎‎的三氯乙酸(约25 ml)使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。 阴离子交换柱层析 取适量二乙基氨基纤维素阴离子交‎‎换剂(DEAE-C)52 加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、 0.5mol/L的HCl及 0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱(2cm x 60cm)至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L 柠檬酸钠缓冲液平衡;用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙‎‎酸溶液上样进行梯度洗‎‎脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时。经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩脲法测总蛋白质含量，继续以下凝胶过滤柱层‎‎析。 双缩脲法测总蛋白质含‎‎量 取一系列试管分别加进‎‎0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 的标准牛血清白蛋白溶‎‎液(6mg/ml),用水补足至2ml，然后分别加进4ml的双缩脲试剂‎‎(每 升溶液中含1.50g CuSO4• 5H2O和 6.0gNaKC4H4O• 4HO, 30gNaOH)，在室温下62 放置30分钟，用721分光光度计在‎‎540nm处比色，光密度分别为0，0.066，0.135，0.210，0.285，0.340。以光密度为纵坐标，牛血清白蛋白(BSA)含量为横坐标绘出标准曲线。取2.0 ml于透析袋中用甘油浓缩后的样品按上述方‎‎法测540nm处的比色，便可以在标准曲线上查到对应的蛋白质含量的‎‎微克数。用测得的蛋白质含量结合用凝血酶滴定测得的数据，便可以求算出样品中水‎‎蛭素的比活力。日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化‎‎总得率为15%;纯化后的产物的比活力为6708 AT-U/mg 蛋白。 凝胶过滤柱层析 取适量的交联葡聚糖离‎‎子交换剂(SephadexG)加蒸馏25水浸泡4小时，按常规方法用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱(1.5cm x 50cm)至所需高度，用pH7.4的0.1mol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样，洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩。再检测活力后，待用DU-70贝克曼分光光度计‎‎在200nm至400nm波长范围内扫描，便能确定所得产物的纯‎‎度。 凝血酶滴定法检测水蛭‎‎素的含量 这是德国马克沃德特(Markwardt，1970)首先报道的一种测定水蛭素含量的方法，这种测定方法用得十分‎‎广泛，至今仍然被美国Sigma 生化试剂公司和英国水蛭生物药物公司作为标准测定方法而列入水蛭素的规格和价目表中。具体步骤是用微量进样‎‎器将50微升未知水蛭素含量的被测日本医蛭唾液腺分泌物提取液加‎‎至溶有0.5%牛血纤维蛋白原的200微升pH7.4的 0.1mol/L Tris-HCl-NaCl缓冲液中，混合均匀后在室温下以每分钟1微升的速度递次加入100抗凝单位/毫升标准凝血酶稀释液并及时搅拌，让其与牛血纤维蛋白原和未知水蛭素含量的被测溶液充分‎‎混合均匀，当在1分钟内出现胶冻状凝块时即为滴定终点。从滴定的凝血酶量，可以推算出被测溶液中水蛭素的活力单位。研究表明水蛭素与凝血酶之间相互‎‎作用的部位主要处于水蛭素分子的‎‎C端。测定结果表明日本医蛭唾液腺分泌‎‎物提取液中水蛭素的含量为4抗凝单位/毫升(AT-U/ ml)。凝血酶滴定法是一种简易、省时、准确、稳定的水蛭素活力测定‎‎方法，然而测定结果受到环境温度和凝血‎‎酶活力的影响很大，也受到操作人员对方法‎‎掌握的熟练程度的影响‎‎。气温太高或太低、凝血酶活力丧失以及试剂稀释不恰当均能造成测定结果的‎‎较大偏差，其最适温度范围应在25 -37?之间。除此之外，还有分光光度法、光散射法和血纤维蛋白肽A 放射免疫法等几种方法可以采用，这里不加多写。 (二) 蛭透明质酸酶的分离、纯化与活力测定 通过硫酸铵分级沉淀进行酶的分离‎‎与纯化 分别取一定体积的日本‎‎医蛭和湖北牛蛭唾液腺分泌物提取液，缓慢加固体硫酸铵至40%饱和度，在冰浴中搅拌10分钟，并在700转/分钟下离心20分钟，取上清液调硫酸铵饱和度至80%，同上离心取沉淀，将此沉淀悬浮于10 ml pH7.0的70%饱和度硫酸铵溶液中，充分搅拌并同上离心取‎‎沉淀，溶于5 ml pH7.0的50%饱和度硫酸铵溶液中，同上离心取上清液，装入透析袋中对无离子‎‎水透析，直至用10% BaCl2检测无沉淀时终止，量取透析后液体体积，留适量用作测酶活及测蛋白质含量。整个过程采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法监测酶活。 通过二乙基氨基纤维素阴离子交换‎‎剂(DEAE-C)柱层析进一步分离与纯‎‎52 化酶 将预处理的DEAE-C52装柱(1.5cm x 50cm)，用pH7.1的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液平衡过夜。上样后，待记录仪基线平稳后再‎‎依次用pH6.0的0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液，pH5.6的0.1 mol/L 乙酸缓冲液(含0.1 mol/L NaCl), pH4.0的0.1 mol/L 乙酸缓冲液(含0.2 mol/L NaCl)洗脱，流速为40ml/小时。测定结果表明pH5.6下的洗脱峰水蛭透明质酸酶(HAse)酶活力最高。将该峰的洗脱液装入透析袋中对无离子水透析‎‎，然后加入3倍体积的冷丙酮沉淀，最后将沉淀抽干置-20?下保存。 制定葡萄糖标准曲线 用15?下烘干到衡重的葡萄糖‎‎配制250微克/毫升的标准液，在成梯度容量的各标准‎‎液中加3毫升3，5-二硝基水杨酸(DNS),在沸水浴中5分钟显色后用自来水冷却至室温并加蒸馏水‎‎稀释。用72型分光光度计在 550nm处测定光密度OD值 ,用OD55微克数做标准曲线。 0对葡萄糖 样品中酶活力的测定 在0.8 ml pH5.5的0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液中加 0.2 ml 的5mg/ml透明质酸溶液和0.2 ml 待测样品于38?水浴中精确保温30分钟，然后将试管浸入沸水中‎‎终止反应。取0.1 ml以上降解液加3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂显色，同时用0.2 ml煮沸的酶液作对照‎‎测A550(吸光率)，根据光密度OD550从标准曲线上查出还原糖的微克数‎‎。每毫升样品中酶活力单位数(I.U./ml)= 还原糖在标准曲线上的‎‎微克数X 12。结果表明用常规糖定量3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测水蛭透明质酸‎‎酶(HAse)较传统浊度法更简单和可靠，灵敏性和专一性都较好。日本医蛭的产率为17.8%，湖北牛蛭的产率为14.3%。 用福林(Folin)-酚试剂法测蛋白质含量‎‎ 首先按照常规方法测定‎‎吸光率A5，制定出牛血清蛋白(BSA)标准曲线。蛋白质含量(mg/ml) = Ax 3.91,取1.0 40540 ml样品按上法测A5在标准曲线上查到对应‎‎的微克数。用测得的蛋白质含40便可以 量可以推算出样品的比活力。结果表明日本医蛭的比‎‎活力为3529u/mg, 湖北牛蛭的的比活力为‎‎2352 u/mg。从以上结果看出，两者在分离和纯化之后‎‎比活力都提高很多，且比活力之比在纯化之‎‎后下降了。从理论上看，经过纯化之后两者的比活力应该很接近，但其比活力之比仍大于‎‎，1这说明湖北牛蛭纯化的结果不如日本医蛭理想‎‎。 9.6 我国对医学蛭类及其天然水蛭素的应用现状与‎‎前景 近年来，我国各相关部门对医学蛭类及其天‎‎然水蛭素的开发与应用‎‎开始重视，做了不少的工作。根据中文科技期刊全文数据库的统‎‎计，从1994年至2002年底全国各科技期刊发表了与水蛭医药应用有关的文章‎‎多达1000篇以上，然而明确注明以吸哺乳动物血液的医学蛭类为对象并指明‎‎蛭类种名的文章不多，其中大多数文章以及中药市场销售的水蛭中成药实际上用‎‎的是不吸哺乳动物血液，只取食螺类体液的宽体金线蛭做原料的。由于宽体金线蛭不含医学蛭类体内含有的水蛭素等生物活性物质，其体内所含有的成分及‎‎其作用机理都没有搞清楚，因此笔者未将这部分文章和水蛭中成药产品包括在本章的内容中。以下介绍一些应用效果明显和具有很好应用前‎‎景的例子。 湖北省中医药研究院通过药理、药效、毒性和临床试验，研制并经国家医药局批准的医学蛭类国家级新‎‎药 – 脉血康胶囊(肠溶)，系用日本医蛭经冷冻、匀浆、干燥、研磨和钴60照射灭菌等步骤制成。该药富含水蛭素、透明质酸酶、血管扩张剂、纤维蛋白酶抑制剂、抗血栓素等成分，具有极强的活血化 瘀、破血散结作用。通过对日本医蛭唾液腺分泌物提取液及整体匀‎‎浆液的生化和药理实验表明它们均‎‎有较强的抗凝血酶活性，对家兔血浆的复钙时间、凝血酶原时间均有显著延长作用，具有较强的纤溶活性，随着剂量的增加而加强活性呈量效关系。能有效地抑制血栓形成和血小板黏附，明显缩短红细胞电泳时间，降低血清胆固醇TC及血清甘油三‎‎酯TG，对微循环有明显的改善‎‎作用。通过安全性动物实验证明日本医蛭无毒无副作用，对肝、肾无损害。临床试验治疗脑中风有效率达86%，是用于治疗与血栓形成有关的心脑‎‎血管疾病的有效制剂。可用于治疗脑血栓、颅内血肿、缺血性中风、动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛、高血脂症、高血压引起的头痛和胸闷等。此药已在重庆多泰药业有限公司万盛制药厂投产并上市销‎‎售。 中国科学院水生生物研‎‎究所由笔者负责的医学蛭类应用研‎‎究课题组于1987年8月至10月与湖北医学院附属第二医院骨科彭建强等医生合作，开展了将医蛭吸血法用于治疗断指再植术后瘀血的研究。这是我国首次应用饥饿‎‎的吸血种日本医蛭对五例经过高难度末节显微外科再植手术的断指进行的治疗处理，取得了明显的治疗效果，使原来没有把握接活的断指都存活‎‎了下来。通常断指再植手术之后，静脉血管回流往往发生障碍，从而减少了动脉血液的‎‎供应，引起组织的坏死。外科医生曾尝试过用各种机械和化学的方法来‎‎预防组织坏死都没有成功，然而利用饥饿的吸血水蛭却可以清除闭塞组织‎‎中淤积的血液，使静脉血管变得通畅，防止了坏死发生，从而为毛细血管长入组织赢得了时‎‎间，这是一种理想的治疗方法，其细菌感染的危险性也极小，可以说比机械和化学的方法都要安全、经济和简便。第一例断指病人系被汽‎‎车发电机切断左手食指和中指后13个小时做的显微外科再植手术，食指仅接通动脉而没有找到静脉;第二例断指病人系冲床夹断右手食‎‎指后4个半小时做的显‎‎微外科再植手术，食指仅接通动脉而没有找到静脉;第三例断指病人系右手‎‎5指和左手3指被切纸机切断后4个小时做的显微外科再植手术，其中右手中指没有找到‎‎静脉，环指虽然吻合了静脉，但回流不通畅。所有的断指显微外科再植手术之后‎‎，立即用经100毫升生理盐水加4万单位庆大霉素浸泡15分钟的饥饿日本医蛭‎‎对以上再植的断指进行吸血治疗，每日2 – 3次。吸血治疗之前先在再植的断指末端切一小口，并用生理盐水搽洗伤口‎‎，然后用2 – 4条处理好的日本医蛭在切口上吸血。在治疗期间，同时用青霉素、氨苄青霉素给病人注射‎‎，以提高抗感染能力。五例再植断指病人的断‎‎指经过4 – 5天的吸血治之后，继续注射以上抗生素15 – 30天，肿胀渐渐消失，青紫或发白的断指逐渐变得红润，血液循环也恢复正常。再植的断指生长良好，均未出现细菌感染(见照片图9-8)。这项工作的成功也为在我国开展耳‎‎朵、鼻子、脚趾、皮瓣静脉瘀血和脉管炎等显微外科手术，使用医蛭吸血法治疗术后瘀血提供了方法和经‎‎验。1985年一个5岁的美国男孩和他被狗咬掉了的耳朵一起被急送到‎‎波士顿儿童医院进行再植手术。因为耳朵的血管非常细，几乎肉眼都难以看清，极易产生药物难以奏效‎‎的并发症，通常很难再植成功。经过12 小时的再植手术才将断了的静脉和动脉接了起来，血液开始在接上的血管里流动了。但是，由于在静脉里形成的血‎‎块阻碍了 血液流回心脏‎‎，手术后3天再植的耳朵就因为血管充血而呈现‎‎紫黑色，尽管使用了肝素和小切口放血，情况仍然危急。在不得已的情况下，医生从英国水蛭生物药物公司得到一批处于饥饿状态下的医用水蛭并被空运至美国波士顿。经过一星期使用医蛭吸血法治疗术‎‎后瘀血，共用去24条医用水蛭，男孩再植缝合的耳朵重新竖了起来并显示出了血气，血液循环恢复了正常，两周后男孩出了医院，这真是一个医疗的奇迹‎‎。 湖北医学院附属第二医院骨科彭建‎‎强、陈振光等(1988)在湖北医学院学报第9卷第4期上报道了医蛭吸血法用于用于处理皮瓣静脉淤血‎‎的实验研究，他们在大白鼠下腹部岛状皮瓣上制成淤血皮瓣模型，尔后用日本医蛭吸血，取得较好的效果。吸血组皮瓣总存活率为‎‎93.9%(46/49)，未吸血组仅为14.3%(5/49)，小切口放血加肝素生理盐水冲洗组‎‎为25%(8/32)。实验结果表明医蛭吸血法能有效地解除组织静脉淤血，故可将此法用于吻合血‎‎管皮瓣移至或者断指再植术后静脉淤血不宜手术探查的病‎‎人。 图9-8 应用医蛭吸血法治疗断指再植术后‎‎瘀血 a. 左手食指和中指再植手术后用医蛭‎‎吸血治疗; b. 吸血治疗结束后的左手食指和中指‎‎; c. 右手5指再植手术后用医蛭吸血治‎‎疗; d. 吸血治疗结束后的右手‎‎5指 (杨 潼，彭建强等，1988) 中国中医研究院廖福龙、李文等人使用我国产的日本医蛭、菲牛蛭、湖北牛蛭、尖细金线蛭、宽体金线蛭和光润金线蛭干粉提取‎‎制备成0.12克/毫升原液，用其做的抗血小板聚集实验和抗凝全血与血浆复钙实验，完成了七种水蛭抗血小板聚集与抗凝血研究。他们选用健康的新西兰种家兔为供‎‎血动物，用光密度法测定血小板聚集的百分率，用常规枸橼酸钠抗凝血‎‎。结果显示日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表‎‎现出抗血小板聚集作用，其中日本医蛭在3.08毫克/毫升浓度下抑制ADP诱导作用;菲牛蛭在9.23毫克/毫升浓度时对血小板最大聚集百分‎‎率(PAm)和一分钟时血小板聚集‎‎百分率( PAr)都有显著的抑制;湖北牛蛭则需要较高浓度才抑制腺‎‎苷二磷酸(ADP)诱导血小板聚集作用;几种金线蛭超声提取物则表现了不同程度的促血小板聚集作用，前两种金线蛭的水煎提取物则表现了显著的抑制血小板聚集作用。日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现了强大的抗凝血作用;三种金线蛭的抗凝血作用相对较弱‎‎。又据该院欧兴长、张秋海等人(1996)在天然产物研究与开发‎‎第8卷第2期上报道了四种水蛭抗凝血酶作用‎‎的研究。结果表明日本医蛭和菲牛蛭两个吸‎‎血种具有很强的抗凝血酶活性，宽体金线蛭和光润金线蛭两个非吸血种则只有‎‎很弱的抗凝血酶活性。 上海中医药大学吴大正、韩志芬等人(2002)在上海中医药杂志第8期上报道了水蛭素对凝血酶造成的血管内皮细胞单层通透性增高的抑制作用。他们将新生牛主动脉分离获得的单个内皮细胞培养于微孔滤膜上，直至形成致密的单层细胞。通过灌流Hanks液或含5克L1白蛋白的Hanks 液后，测定经10 单位/毫升凝血酶溶液或经10单位/毫升凝血酶溶液加10单位/毫升水蛭素处理的液体滤过系数(Kf)、液体滤过流量(JV)和蛋白质渗透压反射系‎‎数(Q)。结果证明水蛭素能够抑制因凝血酶‎‎造成的Kf和JV降低，以及Q的升高。凝血酶能够引起血管内皮细胞单层通透性的增高，而水蛭素则能减轻凝血‎‎酶的作用。 成都中医药大学附属医院眼科袁晓辉、王万杰等人(2000)在眼科新进展第4期上报道了水蛭素预防眼内增生性病变的初步观察‎‎。他们为了探讨用水蛭素预防眼内增生性病变的效果，采用建立实验性眼外伤动物模型，随机分为实验组和对照组。在实验组玻璃体腔内注入小剂量的‎‎水蛭素(每只眼10抗凝单位)，对照组采用空白对照，分别观察2组1、3、5、7、14 d玻璃体混浊及眼底增殖膜形成情况。结果是实验组1、3、5 d玻璃体混浊及眼底增殖膜形成明显低于对照组(p < 0.05)。结论是水蛭素对眼内增生性病变形成有早期的预防作 用。该院眼科郑燕林与重庆医科大学蒋‎‎纪恺(2001)在中国眼科杂志第1期上报道了水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变细胞外‎‎基质的影响。他们为了探讨水蛭素对外伤性增生性玻璃体视‎‎网膜病变(PVR) 细胞外基质形成的影响。制造穿孔性眼外伤的动‎‎物模型，将水蛭素0.1ml (10单位)注入兔玻璃体腔内，对照组注入0.1ml的生理盐水，用放射免疫法测定玻璃体腔内粘连‎‎蛋白(Laminin, LN) IV型胶原(IV collagen, IVC)的含量。结果在外伤后1周水蛭素组与对照‎‎组比较LN和IVC含量下降(p < 0.05)。结论:水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网‎‎膜病变(PVR)细胞外基质的形成具有一定的抑制‎‎作用。 福建中医学院祁明信、黄秀榕等人(2001)在眼科研究第3期上报道了水蛭滴眼液防治半乳糖白内障的实验研究‎‎。他们用SD大鼠复制半乳糖白内障模型，配制水蛭滴眼液并以白内障滴眼液‎‎作为阳性对照，动态观察并比较两组滴眼液对半乳糖白内障的‎‎影响。在实验第10天测定两组晶状体的超氧化物歧‎‎酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)和可溶性蛋白(SP)的含量。结果表明水蛭滴眼液组较对照组晶状体浑浊速‎‎度慢，程度也轻。水蛭滴眼液组SOD，GSH-PX, GSH的含量均显著高于对照组。同时也证明水蛭滴眼液具有较好的延缓和减轻半乳糖白内‎‎障的作用。 第四军医大学第二附属医院实验动物中心杨文‎‎清、施新猷等人(1999)在上海实验动物科学第‎‎4期上报道了光化学法致大鼠脑血栓及水蛭提‎‎取物的治疗作用。他们根据光化学原理以自制的冷光‎‎源(LG105B)诱导大鼠大脑中动脉血‎‎栓形成并观察其后动物行为学改变、脑水肿程度、脑梗塞面积以及尿激酶和水蛭提取物的治疗作用。结果为诱导后4、12、24小时出现的行为学‎‎改变，以24小时最显著;脑水肿也以24小时最为严重;脑梗塞灶约占脑(嗅球、小脑和低位脑干除外)切片面积的10.51%;尿激酶和水蛭提取物处理后以上改‎‎变均有明显的改善。以水蛭提取物(2克/公斤)处理可使脑水肿程度下‎‎降29%，脑梗塞面积缩小45%。结果还表明用冷光源(LG105B)可成功建立大鼠大脑中动脉脑血栓模型，水蛭提取物可减轻其脑梗塞程度。他们还在该校学报(2001年第2期)上报道了水蛭提取物对大鼠脑血栓‎‎后脑组织MDA、SOD和 NO含量的影响。为了探讨光化学法诱导大鼠脑血栓形成中丙二‎‎醛(MCA)，NO和SOD含量的变化及水蛭提取物(EFH)对脑组织保护作用的机理，采用光化学法诱导大鼠‎‎大脑中动脉(MCA)脑血栓形成模型;观察脑缺血后以及药物‎‎作用后4小时、24小时脑组织匀浆中MDA、SOD和 NO的含量变化。结果表明大鼠脑缺血后‎‎4小时脑组织匀浆中MDA的含量增高，24小时明显增高;24小时EFH治疗组的MDA明显降低，由4.77?0.24 mol?L-l降为2.51?0.44 mol?L-l (P<0.05),与模型组相比24小时SOD的活性明显增高(P<0.05)，NO的含量在脑缺血后‎‎2小时降低。24小时与假手术组相比明显升高‎‎。 安徽医科大学附属第一医院陈贵海、李孟峰等人(1998)在中国危重病急救医学第5期上报道了水蛭对脑出血大鼠血三碘甲状‎‎腺素T、甲状腺素T、PRL、34生长激素GH、CS的影响。他们用不同剂量的水蛭粗提液喂饲脑出血大鼠‎‎，第7 天取血以RIA法测激素浓度，结果证明水蛭对脑出血‎‎大鼠血中T、T、PRL、GH、34CS浓度异常有缓解作用并呈量效‎‎关系, 水蛭可改善出血后下丘‎‎脑-垂体-靶腺轴的功能紊乱。 在国外，英国新科学家杂志曾报道印度医学专家用水蛭治疗静脉曲‎‎张，取得了很好的效果。静脉曲张一般由腿部静脉中控制血液单向流动‎‎的瓣膜功能失常引起，其症状主要表现为因血液过分淤积‎‎而造成患者腿部肿胀，甚至发生溃疡。通常用腿部打绷带的办法来对静脉曲张患者进行治疗，但这一过程往往比较痛苦，而且还容易引发皮肤过‎‎敏。印度孟买KEM医院等单位利用水‎‎蛭有效地去除了静脉曲张患者腿部的淤血，最终消除了患者的溃疡‎‎或肿胀症状。研究人员发现相对于含氧量较多的动脉血，吸血水蛭更“钟情”于静脉血，他们利用吸血水蛭对20名患者进行了试验，结果所有患者的溃疡都‎‎得到治愈，18名患者腿部的肿胀大幅度地减轻。国外研究人员还发现吸血水蛭的唾‎‎液腺分泌物提取液能明显阻碍转移性肺肿瘤的生长，能抑制肿瘤细胞胶原酶‎‎活性，两种吸血水蛭唾液天门冬酸酶能抑制血小板分泌三磷酸腺苷，从而阻止了血小板的聚‎‎集。近代研究证明凝血酶是调节多种细胞功能的活化剂，如对成纤维细胞和脾细胞的增殖;血小板和内皮细胞的分泌;血小板、内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞的前列腺素合成;对单核细胞的趋向性以及平滑肌的‎‎收缩性都有影响。凝血酶通过与细胞表面‎‎结合点的作用，影响细胞的功能。当凝血酶与水蛭素结合后，则失去了与这些细胞表面结合点作用的能力。又据雅虎新闻网转载2003年11月4日路透通讯社健康新闻报道医学蛭类有助于减缓关节炎的疼痛。现今医学蛭类的应用仅限于外科手术后血液凝固问题的治‎‎疗，Kliniken Essen-Mitte 的 Gustav J. Dobos博士及其同事最近断言医学蛭类唾液含有能减‎‎轻关节炎症状的抗炎症物质和其他化学物质。在一项膝关节炎病人的‎‎研究中，Dobos博士的小组将用4至6条吸血水蛭做的单一治疗与用一种对关节炎常见的治疗作了比较。吸血水蛭被用于24个病人患病的膝关节疼痛点并让其在‎‎上吸血大约70分钟，直至离去。该新发现已在内科学年刊中报道。七天之后，疼痛伤痕在吸血水蛭组中比在用常见的治疗方法组中有了较大程度的改善。而且，在功能、僵硬和总的关节炎症状方面的受益能维持直到‎‎治疗后的91天， 该治疗安全而且容易被‎‎接受。据路透社2004年6月28日华盛顿讯，美国食品及药品管理局‎‎(FDA)批准了用吸血水蛭作为愈合皮肤、移植和恢复循环的工具，还批准了法国 Ricarimpex SAS 公司的吸血水蛭可以用于医疗上市‎‎。 9.7 医学蛭类的生殖生物学与饲养繁殖‎‎ (一) 医学蛭类的生殖和发育‎‎ 蛭类动物是雌雄同体动物，雄性生殖器官先成熟，行异体受精并且借助在‎‎前端滑出头部的茧(cocoon)繁殖后代。医学蛭类包括的医蛭科和山蛭科种‎‎类的雄性生殖器官除10 对精巢和输精管外，精管膨腔较为复杂，由一包有单细胞前列腺层的球状基部和包有阴茎的阴茎鞘组成。阴茎鞘是一甚粗大的肌肉性管，其内是一盘曲的管状阴茎，可以翻出体外。交配时两个个体的头部‎‎方向相反地腹面紧贴，一个个体的阴茎插入另一个体雌性生殖孔内的‎‎阴道内传递精子。事实上大多数的交配都是单方面输送精子到对方，而不是同时互相交换精子。雌性生殖器官由一对或多或少伸长的卵巢囊及其包含的卵‎‎巢组成，它们在前面伸出输卵管并汇合成一条肌肉性的总输卵管，再经由阴道和雌生殖孔开口向外(见前面生殖系统图)。卵从卵巢囊中产生并与从另一个体来的精子结‎‎合，最后被输卵管中的蛋白包上。一旦受精完成，受精卵就会通过雌孔迅速地产到由身体前部少数生殖体节的腺体或称环带腺分泌成的茧内。通常从交配到产茧要经过数十天至一个月的时间，这大概是精子经过组织‎‎进行迁移所需的时间。环带区的体壁有两类为形成茧提供物质的腺体‎‎:一类是分泌茧外壁物质的腺体;另一类是分泌蛋白液的腺体，受精卵在茧内悬浮于此蛋白液之中‎‎。在医蛭科和山蛭科种类中，茧在形成过程中不是被压扁而是保‎‎持圆形。整个身体的前段由于肌肉的收缩而变得长而细，往身体和茧壁之间的空‎‎隙里注入蛋白营养液和一些受精卵。然后缓缓地向后移动身体并从茧内脱出，当头部通过茧的前、后孔时借助前吸盘腺体产生的填塞物将这两个孔封闭起来‎‎。在这个阶段茧是无色的和半透明的松软囊状物，几天之后变成暗棕色而‎‎且几乎不透明的坚硬囊(见图9-9)。此外，茧壁通常分化成一蜂窝状或海绵状的外层和一光滑的内层。由于医蛭科和山蛭科种类的茧产在陆地上，海绵层的作用之一是减少水分的损耗。海绵层是环带腺分泌物夹杂空气形成的泡沫经‎‎过干燥之后形成的。蛭类动物受精卵的分裂是以螺旋型为基础的，首先在垂直面上分裂，以便将受精卵分裂成4个大裂球。每个大裂球然后在动物极一端分割出一个小裂‎‎球，由于在分割时卵裂轴的倾斜而使小裂球稍偏向一侧。当首一层以顺时针方向移位时，第二层则以反时针方向移位，反过来也是一样，每一层都是从前一层相反的方向来弥补。较早几层小裂球同时继续按照倾斜的轴分割，最后形成一个在大裂球顶上具有小裂球盖的中空囊胚并通过反转或外包法形成原肠胚。我国云南西南部的日本山蛭在每年‎‎5 – 9月的雨季里进行繁殖‎‎，7月初可以见到幼蛭，到8月初时特别多。每下一场雨即 图9-9 两种医学蛭类茧的外形‎‎和卵裂 a. 海南山蛭的茧;b. 日本医蛭的茧 c. 螺旋卵裂的图解 (a, b 自宋大祥，1978;c 自Waddington, 1956) 孵出一批幼蛭。通常长约5 – 9厘米，呈圆柱形，背面的斑纹不太明显，生长迅速。我国海南岛东部和中部山区的海南山蛭在每年‎‎8 – 9月及11 – 12月有两次产茧期，每隔5 – 7天产下一个茧，可以接连产4 – 10个茧。茧的大小为12 – 14毫米?11 – 12毫米，外层呈蜂窝状，为五角形或六角形的一‎‎个个碗状窝。 (二) 医学蛭类的饲养和繁殖‎‎ 医学蛭类的饲养和繁殖在欧洲已经‎‎有了100多年的历史，1990年于以色列耶路撒冷召开的第三届国际水蛭科学‎‎家会议上，从事了40多年水蛭饲养和繁殖的法国水蛭养‎‎殖家J. Desbarax提出了一篇“水蛭养殖‎‎100余年以及我本人40余年的历史回顾”，值得我们借鉴，现将其摘要如下。1845年2月在法国Bordeaux港船坞附近，一个叫Bechade的人开了一间批发水蛭的商号，这已不是一个新兴的行业。在那段时间里，许多马和牛的主人养大‎‎水蛭，然后按重量卖给商人并赚得一些利‎‎润。Bechade的任务是收购、养殖和出售水蛭，他并没有成为富翁而于‎‎1867年将这一业务传给了他的‎‎女婿DeBest。随着营业、储藏和生产基地的扩大，这家商号便改名为DeBest – Bechade，在1870年至1880年间平均每年用柳条筐和运货马车运输并批‎‎发掉25万至40万条医用水蛭。1881年Ricard接收了该商号的业务并将其更名‎‎为Ricard – DeBest – Bechade，他开始通过邮局出售水蛭，首先使业务扩大到法国各大城市，而后至西欧各国，在1900年代销售量增加至每年‎‎80万条。1911年一位采矿工‎‎程师Lucien Desbarax,也就是文章作者的父亲‎‎继承了Ricard的事业，他试图改善原 有的营销方式和养殖方法，但是随着第一次世界大战的到来使‎‎这项事业不得不搁置下来。战后的1930年至1938年间业务扩大到‎‎每年营销4吨重的医用水蛭，Lucien Desbarax只好组织了有‎‎60多人的渔民在春、秋季节去沼泽和湖泊里扑捉。在第二次世界大战期间这项事业更‎‎加困难了，1943年Lucien Desbarax因健康恶化而死去，两年后文章作者的母亲通过与供货人和主顾的‎‎接触而保住了这项事业，使这家公司至今没有倒闭和更改名‎‎称。约在1945年，文章作者J. Desbarax接管了这家公司，由于老的渔民都已退休了以及都市化使天然的沼泽和湖泊也消失了，无法提供足够的用于繁殖的水蛭原种，也不能达到战前的经营水平，只有一些为了基础研究的实验室能带给他们一‎‎些订货。由于屠宰场供应血液的不方便，促使他们寻找到一种氨基酸混合物制成的血液‎‎代用品，但是其效果无论如何也比不上在同样时间内取食新鲜血液。关于这项事业是否有前‎‎途,文章作者的结论是可能有，但是毕竟是有限的。要想在水蛭的饲养和繁殖方面有一光明的前景，他认为不能忽略以下几‎‎个条件:1. 要有一完全适宜的稳定温度，冬季不能太冷，夏季不能太热;2. 要有大量充足的非污染和非硷性水‎‎的供应;3. 要及时清除饲养池中的死虫，要不厌其烦地保持周围‎‎环境处于清洁状态;4. 要像所有企业一样，严把质量检查关。凭借他40余年的经验，经历过数百次的叮咬，也根据处理过数吨医用水蛭的全体同事的经验‎‎，从来没有发生过一次细菌性感染，这是真实的事实。由于医学蛭类的繁殖率‎‎十分有限，其饲养和繁殖的规模难以达到能容许一个医用水蛭制药企‎‎业的存在，从而引导生物化学家们采用基因克隆等生物技‎‎术方法来合成重组水蛭‎‎素，大大推动了重组水蛭素在药理和临床治疗等方面研究工作‎‎的开展。1983年在英国南威尔士由水蛭专家索耶博‎‎士(Roy T. Sawyer)在世界上首先创建了“英国水蛭生物药物公司”，专门从事吸血水蛭的养殖和药物开发，他们面向全世界几十个国家的医院、研究所和高等院校出售活体医学蛭类以及从其唾液腺分泌物中分离和纯化出来的近20种生物活性成分，提供给这些部门从事基础研究和医疗临床试验。二十年来该公司有了很大的发展，不仅在荷兰和美国分别‎‎设立了欧洲和美洲分公司，还在南非、意大利、韩国和日本等地设立了销售部。目前像这样的水蛭公司还有设在纽约的“美国水蛭公司”， 设在德国Erlangen的“动物药物公司”以及设在莫斯科和圣•彼得堡的两家水蛭公司，这也说明了在科学和技术发达的国家活体医学蛭类以及从其唾液腺分泌物中分离‎‎和纯化出来的生物活性‎‎成分是有一定的市场需‎‎求的。 近十几年来，我国也有越来越多的人试着养殖水蛭，而且大多数人养殖的是不吸食哺乳动物血液只‎‎取食螺类的宽体金线蛭。由于他们缺少对这一领域知识的了解，对一些快速致富的小册子和信息小‎‎报里出现的大量不实 宣传 免费孕前优生健康检查孕期保健知识宣传1冬季预防流感知识宣传手足口病防知识宣传森林防火宣传内容 不能分辨真伪，以致上当受骗，在经济上蒙受很大损失。同时也在社会上出现了不少以炒卖水蛭“种子”和传授水蛭“养殖技术”为营业目的的单位，大肆宣扬“蚂蟥生命力强，繁殖极快，易于饲养管理。养殖水蛭规模可大可小，投资少，效益高，一亩水田可产150 – 400公斤水蛭”，甚至还说“只要往水池里泼洒豆浆和猪血就可养大”。这些都说明他们即没有做过这项工‎‎作，也没有关 于水蛭饲养和繁殖的基本常识，是在误导那些缺乏科学‎‎知识又急于想脱贫致富‎‎的群众。1986年笔者乘赴英国威尔士斯旺西市出席第一届国际水蛭科学家会议的机会，参观了设在那里的英国水蛭生物药‎‎物公司 医学蛭类饲养和繁殖室，回国之后便展开了对我国两种水蛭(日本医蛭和宽体金线蛭‎‎)的饲养和繁殖研究工作，又于1997年至1998年上半年亲赴重庆多泰药业有限公司万盛‎‎药厂开展了吸血种日本医蛭的饲养和繁殖研究工作，现以日本医蛭为对象介绍医学蛭类‎‎的饲养和繁殖的一些关键性问题。 (1)繁殖 在长江中、下游地区，每年的4月中、下旬当平均气温在13.1至15.4?时日本医蛭开始交配。通常是躲藏在绿肥田和春花田内小水沟的土块下进行交配‎‎，这些小水沟是上年晚稻收割后搁田排水时开的‎‎，水深仅1.0至2.5厘米，水温约为10.0?。交配持续时间约2小时，交配后约经一个月开始产茧，产茧期是在平均气温19.2至21.3?的5月中旬至6月中、下旬。卵茧多产在田埂边或水渠边的泥土‎‎内，但必须是不太干不太湿又比较松软的土壤。成熟个体先在土中钻成‎‎一个宽约1厘米，长5至6厘米的穴道，有的还分成2至4个叉道。交配过的亲蛭前端朝上‎‎停息在穴道中，环带分泌一种稀薄的黏‎‎液，由于夹杂有空气而成为肥皂泡沫状，然后再分泌另一种黏液变成为一层茧壁包于环‎‎带的周围。每个亲蛭可以产4 – 8个茧，产一个茧的过程历时半个多小时，每个茧中有3 – 22个受精卵，多数10个左右，每个受精卵发育成为一个幼蛭。大约在5月底至6月上旬幼蛭开始从茧较尖的后端小孔逸‎‎出，6月中旬至7月中旬为孵出盛期，此时的平均气温在21.3至32.1?。幼蛭的体形很像成熟个‎‎体，一经孵出茧即能大量吸血，有时还可以见到许多幼蛭叮在成熟‎‎个体身上吸血。一个月幼蛭的体长平均‎‎增长15毫米以上，到8月中旬达到20毫米以上的个体已占幼蛭‎‎总数的60%，个别的体长可达36毫米。总地看来整个蛭类动物的繁殖率远没有鱼、虾、蟹等类动物的繁殖率高，这是限制医学蛭类饲养‎‎和繁殖高产而且规模难以达到能容‎‎许一个制药企业存在的‎‎主要原因。 (2)温度 日本医蛭是生活在长江中、下游地区稻田以及与之相通的沟渠、池塘和沼泽里，相比之下较生活在大湖里的宽体金线蛭更能忍耐高温，但就这类动物来看它们仍然不能忍耐很高的温度和暴风雪，对冷比对热更能适应。通常保持在水温15至25?下最理想，应避免水温超过30?，决不能放在水泥池里或在阳光下暴晒。只有处在恒定的温度下交配与产茧‎‎的周期才能较长，所以最好是在室内或地下室的箱子或水池里进行饲养和繁‎‎殖。日本医蛭可以在8?左右的低温下交配，也可以在16?下产茧。只有在低温下(4至12?)蛰伏越冬1-3个月的成熟个体才能交配和产茧，高温的夏天和低温的冬天是不能繁殖后代的。 (3)水质 饲养和繁殖日本医蛭使用的水即要有充足的氧气，又要是无污染和非硷性的。如果是含氯气的自来水，必须在一储水池里暴气‎‎24小时以上才能使用。要尽可能保持饲养容器内水的清洁，避免因水受到污染和缺氧造成水蛭的死亡。喂食时应将所有日本医蛭从有水的容器中捞出‎‎，放在干的容器中投 食。喂完食后，应将虫体身上的污血尽可能洗干净，再放回有水的容器中。由于吸进体内的血液通过肾管和肾‎‎孔进行浓缩，排出大量的水分、残渣和黏液，会污染容器及其内部的水，需要及时清洗容器和更换容器中的‎‎水。特别是在炎热的夏天，几乎每天都要清洗容器和更换容器中的水，并且要及时清除死去的水蛭尸体。清洗和换水的频度要依据水温、饲养水蛭的密度以及水蛭个体的大‎‎小来决定，流水控温系统最为理想并可以减少劳力的支出。夏季高温时，还可以采取减小密度、往水中补充氧气和降温的办法来提‎‎高水蛭的成活率。换水可用网筛、虹吸管以及在水池一角安装带网筛的阀门以避免水蛭的丢‎‎失。 (4)容器和防逃 因为日本医蛭是两栖生活的种类，喜欢爬来爬去并在泥土里钻成穴道越冬和产茧，也能通过狭窄的缝隙去寻找食物，所以采用带有细密纱网盖子的容器防逃是必要的。应以室内养殖水蛭为主‎‎，只有这样才能在看得见、摸得着并在有的放矢的情况下进行操作。将水蛭投入水田、池塘或庭院的水池里放养是闭着眼睛的无的放‎‎失做法,所以初学者首先应在室内摸清养殖规律。在室内可以用塑料箱和木架进行立体养殖，也可以用水泥板和砖块筑成水池养殖，但必须做到防逃、方便换水和清洗才行。容器的盖子用尼龙纱做‎‎成并用环氧树脂(性能最好的防水胶)黏贴尼龙搭扣，这样可以使容器边缘与‎‎盖子边缘能够紧密闭合在一起并达到防止水蛭外逃的目的‎‎。在室内饲养和繁殖日本医蛭，也要做好整个养殖室的排水和防逃‎‎设置。 (5)底泥 日本医蛭在底泥穴道中蛰伏越冬和产茧，如果需要在室内容器里进行繁殖和产茧，就必须加进适量的无污染和非硷性‎‎土质松软的底泥。大部分的底泥不能浸泡在水中，因此可以用木块或砖块‎‎将容器放底泥的一端抬高，在另一半无土的部分加进适量的水。当容器中干土层里的茧‎‎孵出幼蛭并爬过土表进入容器另一半的水中或附着在水边的容器壁上时，可以用小镊子将其夹至‎‎一小容器然后转入另一大的无土容器里饲养。如果是在室外水池里进‎‎行繁殖时，必须在池的中央筑一高‎‎出水面30 – 50厘米的土台，让成熟的种蛭在土台内交配、产茧和孵出幼蛭，但是这样做很难收集和饲养管理幼‎‎蛭。 (6)种源 凡是健康成熟的个体均可以用作繁‎‎殖的种蛭，决不是炒卖水蛭种子的人说的只有他们卖的水蛭才能做种蛭。长江流域各地必须在每年的4月中、下旬至5月上旬就近到出产日本医蛭的农村收购，或在稻田、沼泽和水沟边亲自捕捉，然后用浸湿的薄布袋装运回去，在途中要注意做到防逃‎‎、透气和保持湿度。运回的日本医蛭要放入水中进行分选，选出个体大的以及头后有棕红色戒指状生殖带腺的种蛭，点数放入有底泥的繁殖箱中产茧和‎‎孵出幼蛭。头后的棕红色戒指状生殖带腺体，说明该个体已在野外交配过了，即将产茧在泥土里。小的未成熟个体要另外放入无土的饲养箱里继续喂养至成‎‎熟，待到次年用来繁殖后代‎‎。如果是在7月份气温达到30?时才运回来的日本医蛭，即使是成熟的个体也可能不再产茧到繁殖箱里了，因为这些成熟的个体已将茧都产到‎‎野外的泥土里了。一定要把握好4月中、下旬至5月上旬这个关键时间到野外去收购或捕捉种蛭，才能收到好的繁殖效果‎‎。 (7)工具 必须人手各一把大镊子和小镊子，大镊子用来夹取较大的或成熟的日本医蛭活体以及死去的尸体，小镊子用来夹取刚孵出‎‎来的以及正在饲养的幼蛭。塑料箱、尼龙网筛、虹吸管、粗橡皮管、剪刀、瓢和水桶等用来清洗、换水和喂食。充氧泵用来往水中补充氧气。冰箱或冰柜用来冷冻新‎‎鲜的水蛭以及存放经处理的新鲜猪血、猪小肠、试剂和药品等。 (8)密度 饲养日本医蛭的密度应随温度和个体大小而定，通常气温低和个体较小时的放养密度可以大些，若密度过大会因引起缺‎‎氧而大量死亡。采取分级饲养的方式十分必要，同样个体大小的日本医蛭放在同一‎‎饲养箱或池里饲养，不能大小不同的个体混‎‎杂在一起，也不能喂过食的个体与‎‎未喂过食的个体混杂在一起。幼蛭可以先放在较小的容器里饲养，随着个体的逐渐增大，可以分段将其转移至更大的容器里饲养。需要用作繁殖后代的种‎‎蛭，要预先喂饱后再放在有底泥的箱中并在低温下蛰伏越冬，密度不得超过每平方米‎‎500条。室外池养的密度较难掌握，但应比室内饲养的密度‎‎小得多。 (9)饵料及喂食 日本医蛭在野外是以水中经常遇到的蛙、牛和人的血液以及吸饱食物的其它日本医蛭个体或其它种水蛭个体作‎‎为食物的。在室内主要是以加有肝素钠或柠檬酸纳的新鲜或冷冻后解冻的猪血喂养。在繁殖箱里蛭茧孵出幼蛭期间，要有专人用小镊子每天从箱里将幼蛭夹到小容‎‎器里，再将其转移至无土的饲养容器里。幼蛭最理想的吸血对象是活青蛙和‎‎吸饱血的大个体日本医蛭，但是这样较难做到。因此可以用在3厘米长?1厘米直径的塑料管中加注以上混‎‎有肝素钠或柠檬酸纳的新鲜或解冻的猪血并在管口用猪小肠外的被膜覆盖严密，然后投入饲养容器中喂‎‎食。幼蛭的取食量颇大，个体增长也迅速，所以几乎要每天喂食一次并且要及时清洗和换‎‎水。随着个体的逐渐增大，喂食的血量也随着增多，但喂食的频率将逐渐减小，直至成熟个体可以数月至半年才喂食一次。可以将加有肝素钠或柠檬酸纳的新鲜或解冻的‎‎猪血灌入洗干净的猪小肠中，然后用塑料绳扎成许多小段的血肠，再用其来喂食较大个体的日本医蛭。未用完的以上加有肝素钠或柠檬酸纳的新鲜猪‎‎血可以分装在小塑料管和大塑料瓶中放入冰箱或冰柜里冷冻起来，解冻后可以继续用来喂食日本医蛭幼蛭和较大的个体。由于饥饿的日本医蛭个体常常攻击‎‎饱食的个体，所以决不能将饥饿的日本医蛭个体‎‎放入饱食的个体中。饱食的个体应以较小的密度放在较低温度和氧气充足的水中，在刚喂食后的几天里要‎‎更勤地清洗容器和换水‎‎以清除排泄物，否则就会引起箱内日本医蛭的大量‎‎死亡。 (10)防天敌 老鼠是室内饲养的日本医蛭主要的天敌，特别喜欢吞吃饱食猪血的大个体的日本医蛭，这是因为新鲜猪血富含营养物质的‎‎关系。所以必须设法在室内、外消灭老鼠并将通向饲养室的所有道口都堵塞‎‎好。鱼、虾、蟹和水生昆虫的幼虫是室外池塘养殖日本医蛭的天敌，所以要在池塘投放日本医蛭种苗之前进行清塘，用茶饼、巴豆、漂白粉等药物将以上天敌生物杀死，但决不能用生石灰，因为水蛭不能忍耐碱性水质。清塘杀死水中天敌之后‎‎，要间隔一段时间，让池塘里水的理化性质有所恢复。 (11)防治细菌性传染病 日本医蛭容易得细菌性传染病，特别是由于饲养的密度过高，又有从野外来的携带细菌的个体加入时，就有可能发生持续的大量死亡，即所谓爆发性细菌传染病。经笔者研究发现在水温‎‎20?时，每立方米水中加进0.2至0.4克的呋喃唑酮全池泼‎‎洒，保持10天左右不换新‎‎水，可以有效地控制日本医蛭细菌性传染病的发生‎‎和发展。2002年我国农业部曾发出 通知 关于发布提成方案的通知关于xx通知关于成立公司筹建组的通知关于红头文件的使用公开通知关于计发全勤奖的通知 在养鱼业中禁止用包括‎‎五氯酚钠和呋喃唑酮在内的一些毒性较大的鱼药，所以在鱼药商店里已难买到以上鱼药。目前中国科学院水生生‎‎物研究所鱼药商店(武汉)出售一种毒性小，清塘、杀虫、杀菌均有效的新型鱼药‎‎—白点灵，可以有效地控制日本医蛭细菌性传染病的发生和发展。白点灵的有效用量为每立方米水体8 – 10克，一周内不能换水，如果换水应立即再施药，维持一个月药的剂量可以取得明显‎‎的效果。如果是在饲养箱内使用，可以依照以上剂量推算施放药物。 从以上各点可以看出日本医蛭的饲养和繁殖是一件具有相‎‎当难度的工作，费时费工，又必须细心和耐心才能获得成功。希望欲搞医学蛭类养殖的读者要谨慎行事，不要轻易相信社会上一些毫无根据的宣传和抄‎‎作。在动手做这一件工作之前要向真正‎‎懂得这方面技术的专家咨询并去访问真正实践过这一工作的人。虽然养殖医学蛭类的规模难以达到容许一个制药企业的存‎‎在，但是用来提供科研院所、高等院校和医院等部门从事科学研‎‎究和临床试验是完全必要和可行的。 9.8 关于重组水蛭素及其在我国的研究‎‎进展 由于用医学蛭类提取和纯化出天然水蛭素非常困难，产量太少大大限制了对它的研究和应用。近二十年来，分子生物学和基因工程‎‎技术迅速发展，使得大量合成重组水蛭素成为可能，从而推动了重组水蛭素‎‎在药理学和医疗临床方‎‎面的研究工作。自从1986年以来，国外及我国国内已有许多实验室利‎‎用DNA重组技术将化学合成的水蛭素基因克隆进大肠杆菌和酵母细胞中，并得到了具有生物活性的重组水蛭素。从医学蛭类头部提取RNA,再应用CDNA法合成水蛭素基因也获得了成功。目前国外已有多家生物技术公司正‎‎在尽力将重组水蛭素开‎‎发成为治疗脑心血管疾‎‎病的新药，如法国的Transgene公司和Sanofi公司，德国的Genbiotec公司和Hoechst 公司，瑞士的Ci-ba-Geigy公司，美国的Sri公司和Biagen公司等。据我国的国外医药杂志报道欧共体‎‎已批准Novartis公司的重组水蛭素上市，美国批准了Medicines公司的重组水蛭素衍生物‎‎(片段)比伐卢定(Bivalirudin, Angiomax TM)上市，德国Hoechst Marion Roussel公司的抗凝药Lepirudin (商品名Refludan ;化学名 1 - L - 苏氨酸-63-脱硫水蛭素已在欧美上)市。在美国 Sigma生化试剂公司现今的产品价目表中也列出 了用酵母菌细胞生产的重组水蛭素以及各种重组水蛭素片段的规格和价格‎‎(见附录I)。我国也有多个科研院所和高等院校正在用不同的方法进行‎‎重组水蛭素的合成研究和药物开发，国家也已将其列为“八五”科技攻关项目,其中复旦大学分子医学教育部重点实验室宋后燕教授领衔研究的“注射用基因工程双功能水蛭素”获得国家有关部门批准正式进入临床研究。北京大学生物化学与分子生物学系朱圣庚教授‎‎领衔研究的转基因水蛭素技术已转让给汕头双骏生物医药有限公司。现将有关方面的国内、外情况分别介绍如下。 (一) 重组水蛭素的合成 目前各国合成重组水蛭素主要采用了以下几种‎‎方法: Bergmann, C. 等人(1986)在 Hoppe-Saler生物化学杂‎‎志第367期上报道了应用化学合成的寡聚脱氧核苷酸，通过酶连接到水蛭素基‎‎因226-bpDNA上。在大肠杆菌中，在乳糖启动子的控制下，水蛭素的合成基因与β半乳糖苷酶-一起作为一个融合蛋白‎‎获得表达，或者在αPL启动子控制下，作为一个非杂交蛋白获得表达。这种非杂交蛋白产物具有水蛭素的生物活性。具体做法是根据已知水蛭素的氨基‎‎酸序列，设计18个寡聚脱氧核苷酸片段。为了促进整个基因的合成，将其分成A, B, C三段，并装配有适当的限制酶的切位点。作者在基因装配方面用了两种方法，一种是首先合成短的交叠互补寡聚‎‎核苷酸(10-30核苷酸单位)，再用酶促连接方法产生‎‎双链DNA片段;另一种是合成较大的单‎‎链DNA片段(30核苷酸单位以上)，经退火得到完整的双链‎‎DNA片段。后者称为补平法，只需合成和纯化少量的‎‎寡核苷酸，就能获得5 – 10倍的双链基因片段‎‎，又能去掉磷酸化步骤。补平法制备全长的双链‎‎DNA片段产率较高，片段的克隆也更容易完成。用非融合蛋白表达水蛭‎‎素更加合适， Dodt, J. 等人(1986)在FEBS Lett. 第202卷第2期上报道了应用硷性磷酸酶信号序列在大肠杆菌中表达、分泌和加工水蛭素。首先合成一个为大肠杆菌硷性磷酸酶(PHOA)信号肽编码的DNA片段，并将此片段插入PKK2233表达载体中。在此信号肽的末端紧随‎‎Hind酶切位点。将化学合成的水蛭素基因插入此酶切位点中，在半乳糖苷酶启动子的控制下，该杂交蛋白得到表达，并分泌到大肠杆菌的外周胞质中。具体做法是寡聚脱氧核苷酸SP1和SP2以固体硅胶作支持剂手工‎‎合成，SP3和SP4用磷酸酰胺法在‎‎DNA合成仪上进行装配‎‎，然后用HPLC纯化这些寡核苷酸。用这四个合成的寡聚脱‎‎氧核苷酸SP1至SP为4合成一个硷性磷酸酶信号肽编‎‎码的DNA片段。此DNA片段插入PKK2233表达载体的EcoR1和Hind酶切位点处。形成的载体PHIR21含有水蛭素基因，该载体在一半乳糖苷酶启动子的控制下，进行融合蛋白的合成，这个合成过程从N端开始，首先合成信号肽PhoA，紧接着是水蛭素的合成‎‎。大肠杆菌BMH71-18在含有氨苄青霉素(100µg/ml)LB培养基中在37?下培养，应用IPTG诱导基因表达其浓度‎‎为0.5mM。水蛭素活性，是在25?下通过生色底物ChromzymTH来测定。基因表达诱导24小时后，从大肠杆菌(BMH71-18)载体 PHIR21的胞质抽提液测得3 50AT-U的水蛭素抗凝活性单位。将大肠杆菌的胞质抽提‎‎液通过DEAE-Sephadex-25柱进行分离纯化并‎‎用HPLC进一步纯化，最后得到的两个色谱峰的抗凝活性为550 – 570 AT-U/mg。 Loison, G.等人(1988)在生物技术学杂志(Bio/technology‎‎)第6期上报道了用酵母细胞有效地生产重组水蛭素变异体‎‎?(r–HV–2 )。他们将成熟的水蛭素编码序列放入‎‎酵母Mfal基因前序列框架中，可转录不同融合基因的多拷贝质粒含有Mfa1的启动子，在尿嘧啶原营养型中用此质粒转化一个酵母菌‎‎株。从其酵母培养基上清液中蛋白质的‎‎分析表明，在所有的情况下水蛭素都能有效地分泌。但是只有紧随着YSEF裂解位点含有成熟的水蛭素变异‎‎体?(HV–2)序列的前体，才能够正确加工产生具有生物活性的水蛭素。具体做法是从医学蛭类头部分离出‎‎一种多A•RNA,制备一个c – DNA库。从此c – DNA库(天然水蛭素编码HV–2)分离出一个Pst1片段，克隆进PBR322 的Pst1位点(pTG717)。从pTG717所得的Pst1片段(含有水蛭素基因)经纯化后，用Hinf1 和Aha111酶解，此Hinf1―Aha111片段(225bp)与合成的寡核苷酸混合。这些设计的寡核苷酸用以重新构建成熟的水蛭‎‎素变异体?(HV–2) 编码序列，并在5?―末端加上一个ATG起始密码。重新构建的基因插入 pTG880的Bg111和Sma1位点，新生成的质粒pTG 882 中，水蛭素序列在PGK转录信号控制下进行表达‎‎。质粒pTG1819装配pTG 881，这里的Mfa1编码序列是在PGK启动子控制下，取代它原来的启动子。在pTG1818发酵液中，用反相层析HPLC进行纯化，得到一个重组水蛭素活性峰的比活‎‎性为13000 AT-U/mg，得到另一较低的重组水蛭素活性峰的比活性为‎‎4000 AT-U/mg。 在pTG1833发酵液中，用反相层析HPLC进行纯化，得到一个重组水蛭素活性峰的比活‎‎力为13000 AT-U/mg，N端序列与水蛭素变异‎‎体?(HV–2)序列相符合。水蛭素分子N端的1 – 5个氨基酸与C端区形成紧密的结合，而此结合状态直接影响‎‎水蛭素的活性。当天然水蛭素(HV–2)的N端略微延伸几个氨基酸，将大大降低水蛭素的活‎‎性。当N端多加一个蛋氨酸时，重组水蛭素变异体?(r–HV–2)抗凝血酶降低活性5倍。实验结果表明应用大肠杆菌生产水蛭素的产率很低，原因之一是在其N端需要多加一个蛋氨酸作为起始密码，另一原因是水蛭素在大‎‎肠杆菌细胞中发生蛋白质的降解作用。用酵母菌可将异质蛋白‎‎质分泌到培养基中，而且形成的多肽不含有多余的起始密码一蛋氨‎‎酸。 中国科学院生物物理研‎‎究所申同建等人(1991)在中国科学B集第8期上报道了人工合成的水蛭素基因在酵母中的表达。他们根据水蛭素变异体?(HV–2)氨基酸序列设计并合成了水蛭素基‎‎因，在酵母α– 因子表达系统中表达。经过诱变得到稳定的携带水蛭素表达质粒的酵母菌株，在培养基中培养36 – 48小时后，可以在培养液中测得10 – 20AT-U/ml分泌水蛭素表达产物。经纯化得到色谱纯(HPLC)的水蛭素，其N端氨基酸序列与天然产物完全相同，具有强烈的抗凝血和抑制凝血酶活‎‎性。从500 ml培养液中可以得到约3000 AT-U的纯水蛭素，比活力为‎‎6600 AT-U/mg。 中国医学科学院血液研究所郭娟、王荷碧等人(1995)在中华血液学杂志第9期上报道了水蛭素变异‎‎物1活性多肽基因的化学合成及克隆。她们根据水蛭素变异物(HV1)的氨基酸序列，选择在原核细胞中高表达的密码子‎‎，设计了221个硷基对长度的HVI DNA片段。分成14个寡核苷酸片段进行化学合成，各片段连接成为HVI全基因后，细EcoRT、BamHI切点克隆入PUC18/19质粒，转化大肠杆菌JM105，兰白菌落法筛选阳性克隆。限制性内切酶实验以及DNA序列分析证实了HVI全基因的正确性，克隆成功并获得了活性‎‎表达。 上海医科大学分子遗传研究室顾银良和罗春真‎‎(1996)在上海医科大学学报第3期上报道了水蛭素衍‎‎生物基因的克隆及其在哺乳动物细‎‎胞中的表达。他们设计了特异性更高的水蛭素新变异体，化学合成了编码水蛭素‎‎基因，并融合了RGD3肽编码序列。通过连接、克隆、酶切筛选、DNA序列分析得到真核表达质粒pAPR – HD, 表达质粒转染CHL细胞，经G418 筛选，获得了表达克隆。结果:细胞培养液中，重组水蛭素衍生物的活‎‎性达到10AT-U/ml, 并有抗血小板凝集作用。结论:水蛭素新变异体具有预防血栓性疾病的应用前‎‎景，但其表达水平和稳定性有待进一步‎‎提高。 军事医学科学院毒物研究所刘刚和‎‎慕邵峰(1998)在中国药物化学杂志第‎‎1期上报道了合成水蛭素羧端肽段及其类似物的抗凝活性‎‎。水蛭素C端肽段为抗凝的活性部位。为了进行构效关系的研‎‎究，构建C端肽段类似物的化学库，他们首先利用同步多中心合成技术‎‎合成了7种水蛭素C端肽段类似物。经HPLC制备纯化，纯度为96%以上。电喷雾质谱确认了合成肽的分子量。用新鲜人血浆进行了凝血酶原激酶时间(APTT)，凝血酶时间(TT)及凝血酶原时间(PT) 测定。显示水蛭素羧端20个氨基酸残基肽片是抗凝活性必须的‎‎基本骨架。其中应当包含封闭凝血酶催化位点和阴离子结合位点的特异结合序列‎‎以及保持量者间多功能性的连接桥。该院生物工程研究所刘凤云和李秀‎‎珍(1998)在军事医学科学院院刊‎‎第12期上报道了水蛭‎‎素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达。为了获得即能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达，她们通过化学合成水蛭‎‎素12肽基因编码序列，采用DNA重组技术将水蛭素12肽基因片段连接到低分子量尿激酶‎‎cDNA片段5?端，构建成融合基因。结果构建成了水蛭素12肽与低分子量尿激酶的融合基因，并在大肠杆菌中获得了‎‎表达。重组融合蛋白具有抗栓与溶栓的双功能。得出的结论是:运用DNA重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗‎‎凝活性。 中国药科大学生物制药教研室谭树‎‎华、吴梧桐等人(1998)在药物生物技术第1期上报道了水蛭素变异体‎‎?(HV3)基因合成、克隆与鉴定。她们根据水蛭素变异体‎‎?(HV3)的氨基酸序列设计并合成了六对共‎‎12条寡核苷酸链。经退火配对，连接成完整的HV3编码基因228bp)，并克隆到载体 PUC18中。通过α-互补及小量抽提质粒酶切鉴定，筛得阳性重组水蛭素，克隆其中PUCH33，经正、反向引物测序、鉴定，与设计的序列完全相符。谭树华、吴梧桐等人(1999)在中国药科大学学报第‎‎1期上报道了在大肠杆菌中分泌表达水蛭素变‎‎ 异体?基因的初步研究。她们设计合成了两对(四条)寡核苷酸链，经退火、拼连成L―门冬酰胺酶信号肽简并‎‎基因，同时利用密码子的简并性在该基因‎‎′3端基因内引入了一个Nhe I限制酶切位点。此外，用PCR技术在HV3基因5?端引入Nhe I限制酶切位点，利用该酶切位点将信号‎‎肽基因与HV3基因进行连接并且保护原有阅读框架不变，构建了重组质粒pUCSH，测序结果表明融合基因核苷酸序列与设计 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 完全一致，将该融合基因插入pKK2332中构建成HV3分泌表达质粒pKSH并在大肠杆菌中分泌表达。谭树华、吴梧桐等人(1999)在中国生化药物杂志第‎‎1期上报道了新型大肠杆菌融合表达系统表达‎‎水蛭素变异体?基因研究。她们选用大肠杆菌L―门冬酰胺酶(ASPs II)高效表达质粒PKA作为融合表达载体，将水蛭素变异体?(HV3)人工合成编码基因插入‎‎pKA质粒的ASPs II编码基因 ansB中，使ASPs II 1N端的89个氨基酸残基通过甲硫氨酸残基与HV3形成融合蛋白，从而构建成ASPsII – HV3 融合蛋白表达质粒pKAH，通过基因操作将该质粒的低拷贝数复制原点更‎‎换成pUC 高拷贝数复制原点，进而构建成 ASPs II – HV3融合蛋白高效表达载体pUKAH。该质粒在大肠杆菌JM105宿主细胞中表达‎‎后，融合蛋白(15.6KD)占细菌总蛋白的105%。该校李兵、谭树华等人(2002)在药物生物技术第2期上报道了水‎‎蛭素基因工程菌培养。他们采用了正交实验法优化了水蛭素基因工程菌的发酵培‎‎养基，得到较佳的培养基配方及培养条件，优化了发酵 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 。摇瓶培养22小时，发酵液抗凝血酶活性可达850 AT-U/ml。25升发酵罐培养18小时，发酵液中抗凝血酶活性‎‎亦可达800 AT-U/ml。水蛭素表达量在原有基础上有了大‎‎幅度提高，为大规模培养及工业化生产建立了‎‎可行路线。 中国中医研究院基础所‎‎王克林、徐琦等人(1999)在中国海洋药物第1期上报道了热启动聚合酶链反应快速扩增水蛭肽基因的研究‎‎。他们指出应用这种技术可使DNA为221bp, 这与理论预计相符，同时确定了退火温度为‎‎50?时的扩增反应结果较好，这为进一步探讨水蛭肽‎‎基因克隆、表达与调控规律打下了基础。徐琦、王克林等人(2000)还在中国中医基础医学‎‎杂志第5期上报道了水‎‎蛭抗凝多肽基因在大肠杆菌中的表达。他们应用我国产的吸血‎‎水蛭通过逆转录酶和PCR技术取得了水蛭素基因并将其克隆进质粒‎‎PGEM – 32f(+)中，应用所得水蛭素基因克隆进我国特有的表达载‎‎体PBV – HV菌株。该菌株通过发酵实验获得了高效表达并得到具有生物活性的水蛭素。菌体粗提液经乙醇分级沉淀、分子筛柱层析和HPLC纯化得到了纯品水蛭‎‎素。 南京大学生物化学系范‎‎尧、王进等人(2001)在生物化学与生物物理‎‎进展第1期上报道了一种水蛭素类融合蛋白与凝血酶作用的动力学模‎‎拟。他们通过将凝血酶抑制剂水蛭素的‎‎C端20肽片段嫁接到血小板结合‎‎蛋白Annexin V上，可以期望获得即具有抗凝血活性，又具有导向性的新型工程蛋白质分‎‎子，利用计算机辅助分子设计手段模拟该融合蛋白质分子结构，并对该融合蛋白对凝血‎‎酶的抑制作用进行了分子动力学模拟，验证了上述想法。 第二军医大学附属长海医院心内科‎‎穆瑞斌、秦永文等人(2002)在中华医学 杂志第9期上报道了重组多功能抗凝多肽的表达及活性测定。他们设计了一个具有多重抗凝功能的重组多肽分子结构，由谷胱甘肽S转移酶(STST)作为载体蛋白与重组抗凝多肽融合而成。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据氨基酸序列逆向翻译后经人工合成，并插入表达质粒pGE x 5 x 3 中，与其中的编码GST序列的3′端融合。采用大肠杆菌DH500进行原核表达。应用亲和层析的方法得到纯化的融合蛋白。重组抗凝多肽含有31个氨基酸，由3个功能部分组成。 长春中医学院附属医院和长春生物制品研究所‎‎翁梁、刘丹等人(2002)在中国生化药物杂志第‎‎2期上报道了PCR方法在水蛭素基因克隆方‎‎面的新用途。他们改进了传统的PCR方法，根据已知天然水蛭素基因序列设计‎‎了一对123 nt且3′端具有15 nt互补序列的单链‎‎DNA。通过低温复性使其互补结合后，进行延伸反应，得到微量双链水蛭素基因。再以该基因作为模板设‎‎计一对引物，进行常规PCR扩增反应。结果获得了水蛭素基因。此法对于获得象水蛭素‎‎基因这类序列，已知片段不太长，且为不易得到的基因提供了一种可‎‎行方法。 南京理工大学化工学院李大力等人(2002)在生物技术第3期上报道了水蛭肽基因的克隆及其转化甘蓝。他们将合成的水蛭肽基因转移至甘蓝，构建了水蛭素的植物表‎‎达载体PROK – L，使用甘蓝的下胚轴和根瘤农杆菌的共培养实现了转化，再生植株经卡那霉素筛选，检测结果表明所得到的‎‎抗性植株均为转化基因植株，获得了转化水蛭肽基因的甘蓝植株。又据悉上海农业科学院等单位正合作进行水蛭‎‎素转基因作物种植与相关深加工的‎‎研究。 (二)重组水蛭素的药理学研‎‎究 重组水蛭素与天然水蛭素在结构上‎‎稍有不同，即位于63位酪氨酸处是非硫酸酯化的，这使得它与凝血酶的结合能力只有天然水蛭素‎‎的1/10 – 1/15。如果将重组水蛭素硫酸酯化，则与天然水蛭素的作用相差无几。血管内血栓的形成，虽然有多种原因，但最根本的过程还是凝血酶引起的凝血作用。许多血栓形成的动物模‎‎型已用于重组水蛭素的抗栓作用研究，有的还和肝素作了比较。现将有关重组水蛭素的‎‎药理学研究现状分述如‎‎下。 Nowak, G.等人(1988) 在Folia Haematol.(溶血)(Leipzig) 第115期上报道了重组水蛭素在狗体内的药物动力学研究。雌性警犬的体重为17 –19.5公斤，在给药前和给药后的一定时间间隔内，检测血样和尿样，直至480分钟为止。给药的方法是静脉注射，静脉点滴，皮下注射。重组水蛭素与天然水蛭‎‎素在狗体内的动力学行为很接近。不论是静脉给药还是皮下给药，两种水蛭素都能得到几乎相同的血‎‎浓度。两者的差别主要表现在重组水蛭素‎‎通过肾脏的排出率比天然水蛭素的排出率要高‎‎20% – 25%。重组水蛭素只通过肾脏‎‎排出，几乎不经过其它代谢的‎‎消除过程。Henschen, A. 等人(1988)在该刊同一期上将两种水蛭素通过肾脏前后进‎‎行了比较，通过反向HPLC分离，氨基酸组成和序列分析证明了水蛭素是经过肾脏以不改变活性的形式从尿中排出‎‎的。 Doutremepnich, C.等人(1991)在止血杂志(Haemostasis)第21卷增刊1上报道了三种重组水蛭素的抗静脉血栓作用，并与肝素作了比较。重组水蛭素I是由酵母菌制得的，重组水蛭素II和?是由大肠杆菌制得的，肝素未经分馏。实验结果表明肝素的高‎‎剂量组(400µg/kg)和重组水蛭素II的各个剂量组及重组水蛭素?的高剂量组(50µg/kg)均有明显的抗血栓作用‎‎，重组水蛭素I的各个剂量组虽然能使血栓重量有一定程度的减少，但无统计学上的意义。这表明三种重组水蛭素的活性也是不完全一样的，这可能是由于合成方法的不同而得到不同结构的重组水蛭‎‎素造成的。Talbot, M. D. 等人(1991)在该刊同一期上报道了重组脱硫水‎‎蛭素(desulphatohirudin)对大鼠动脉血栓症的作用。他们通过机械损伤(用夹子反复夹紧大鼠的动脉血栓)形成模型。损伤部位血液 111I标53Cr标125I标成分标记的放射性强‎‎弱(记血小板，记红细胞，记纤维蛋白原和纤维蛋白)作为定量测定血栓形成程度的指标。他们研究了重组水蛭素的抗动脉血‎‎栓作用，并与未分馏肝素以及低‎‎分子肝素Fragmin作了比较。结果证明皮下注射重组水蛭素能够抑制纤维蛋‎‎白和血小板在损伤血管上的积累，并且这种作用与皮下注射剂量有关‎‎。又据Nowak, G.等人(1991) 在该刊同一期上指出重组水蛭素还能够抑制用各种方法在不同动物体内诱发散布的血管内凝‎‎血(DIC)。包括凝血激酶在大鼠体内诱发的DIC;内毒素在兔和猪体内诱‎‎发的DIC;同时静脉滴注肾上腺素和凝血酶的狗体内诱发‎‎的DIC。当重组水蛭素的浓度达‎‎到20 – 30µg/ ml时，则能抑制各种DIC的形成。Basic–Micic, M. 等人(1991)在该刊同一期上报道了‎‎重组水蛭素对不同的血小板功能的影响。试验结果表明在全血中用重组水蛭素，枸橼酸钠和未分馏的肝‎‎素抗凝，血小板的计数值相近。在富血小板的血浆中，重组水蛭素抗凝的血小板计数值比用枸橼酸钠‎‎抗凝的血小板的计数值稍高，而用未分馏的肝素抗凝的血小板的计数值比用‎‎枸橼酸钠抗凝的血小板的计数值还要低。在以重组水蛭素抗凝的富血小板的‎‎血浆中，血小板自发聚集受到抑制，肝素的抑制效果不如重组水蛭素。而在以枸橼酸钠抗凝的富血小板的血浆中，血小板自发地聚集。Narayanan, K. 等人 (1991) 在该刊同一期上报道了重组水蛭素在再造显微外科中的作用观察。他们用大鼠的股动脉吻合模型做试验，分成为生理盐水;1 mg/ml肝素生理盐水溶液‎‎;1µg/ ml重组水蛭素生理盐‎‎水溶液3组。在股动脉处做一标准切口，在伤口吻合过程中分别用以上3种溶液清洗伤‎‎口，3秒钟后观察结果。在防止伤口血栓形成方面肝素优于生理盐水，重组水蛭素又优于肝素。在再造显微外科手术中‎‎，常常因为在吻合处血管栓塞而导致‎‎失败，肝素可以用来作为抗凝剂，但是容易引起出血，重组水蛭素则可以避免‎‎这些副作用。 我国核医学国家重点实验室、江苏省原子医学研究所万卫星、张荣军等人(1999)在中华核医学杂志第4期上报道了99Tcm –重组水蛭素的制备及血栓动物模型显像研究。他们采用亚氨基噻吩盐酸盐修饰法‎‎制备99Tcm –重组水蛭素(99Tcm –rH)，并进行小鼠体内分布及兔股动脉、静脉血栓模型显像分析‎‎。结果表明:99Tcm –rH的标记率为90.8%，PD10过柱前后放化纯度分别为‎‎88.8%和93.9%，比活度为3292GBq/g; 在小鼠心、脑、肝、脾、肺摄取低，肾浓聚高， 15分钟达到(64.72?5.04)% ID，血清除迅速;兔股动脉、静脉血栓1小时可清晰显影，T/B分别为224和195。万卫星、张荣军等人(1999)在该刊同一期上报道了血栓动脉模‎‎型的99Tcm –重组水蛭素显像研究。为了探讨以凝血酶为靶，重组水蛭素(rH)为配基进行血栓显像的‎‎潜在价值。采用氯胺T法制备125 I–rH，以及体外放射配体结合‎‎法分析rH对凝血酶，纤维蛋白复合物的亲和‎‎、定量关系和时间反应动力学。采用亚氨基噻吩盐酸盐修饰法制备‎‎99Tcm –重组水蛭素(99Tcm –rH)，进行小鼠体内分布测定及犬动脉、静脉血栓模型显像。结果表明rH不能直接与纤维蛋白‎‎原结合，当凝血酶与纤维蛋白形成复合物后‎‎才能与其形成三元复合物，且这种结合呈高亲和，特异和可逆性。99Tcm –rH在小鼠心、脑、肝、脾、肺摄取低，肾浓聚高，15分钟达到(64.72?5.04)% ID，血清除迅速;兔股动脉、静脉血栓1小时可清晰显影，T/B分别为224和195。该室谭成、万卫星等人(2000)在核技术第5期上报道了重组水蛭素与血栓前体关系的研‎‎究。氯胺 – T法碘标水蛭素，采用固相饱和法，固相竞争法分析水蛭素与凝血酶 – 纤维蛋白原复合物的亲和力及定量结合关系，并分析水蛭素 – 凝血酶 – 纤维蛋白原复合物形成三元复合物，它们的分子配比为14 ?:14:1(水蛭素 : 凝血酶 : 纤翴蛋白原)。生理Ca(2+)浓度是它们的最佳结合环境，水蛭素与凝血酶 – 纤翴蛋白原复合物结合的亲合常数‎‎K-a为9.72 x 10?6L/mol;其结合反应可在30 – 45分钟达到平衡;提示重组水蛭素有作为‎‎新型血栓显像剂的可能。张荣军、万卫星等人(2000)在核技术第11期上报道了新型血栓显像剂99Tcm –重组水蛭素的实验研究。结果表明用间接法制备的99Tcm –重组水蛭素具有更高的放化纯和稳定性，更适合于血栓模型的显像研究。兔血栓模型显像结果表‎‎明99Tcm –重组水蛭素可在血栓部位浓聚;注入后1小时即可使血栓清晰显像，因此，可望成为一种新型血栓‎‎显像剂。 第四军医大学唐都医院心内科田建伟、赵连友等人(2001)在第四军医大学学报第21期上报道了重组水蛭素局部治疗兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄。他们为了探讨重组水蛭素经多孔球囊导管局部‎‎治疗对兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄的影‎‎响，用24只纯种日本大耳白兔随机分‎‎成对照组(n = 12)和重组水蛭素局部治疗‎‎组(n = 12)，采用兔髂总动脉球囊扩张术后内膜增殖和管腔狭窄模型，治疗组经多孔球囊导管‎‎于球囊扩张局部在 1 12个大气压下给于重组水蛭‎‎素(13.8?106抗凝血酶单位•g)1 mg•Kg，对照组给于生理盐水，术后2WK和4 WK复查血管造影，术后4WK取髂总动脉标本行HE染色、Masson三色染色、平滑肌肌动蛋白(α actin)免疫组织化学染色和增殖细胞核抗原免疫组织‎‎化学染色, 并进行了计算机画像分析。结果:治疗组术后2 WK和4WK平均髂总动脉直径均较对照组显‎‎著扩大[2WK(86?5)% us(56?10)%, P<0.01; 4WK(77?13)% us(56?10)%, P<0.01], 术后2 WK和4WK平均髂总动脉面积亦显著增加，术后4WK治疗组球囊扩张血管管腔面积较对照组显著增‎‎加([37?5)% us(84?5)%，P<0.01]，其管壁面积显著减少[(63?5)% us(38?10)%，P<0.01]，其中主要是内脏面积减少[(7?1)% us(38?10)%，P<0.01]，术后4WK治疗组球囊扩张血管管壁α–actin和 PCNA免疫组织化学染色阳性细‎‎ 胞均较对照组明显减少。结论:重组水蛭素经多孔球囊导管局部治‎‎疗可显著减轻兔髂总动脉球囊扩张术后新生内‎‎膜增殖和管腔狭窄。 中国药科大学生物制药教研室刘煜、谭树华等人(2002)在中国药科大学学报第3期上报道了重组水蛭素?的抗凝与抗血栓作用研究，为了研究自行研制的重组水蛭素?在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓‎‎作用。他们采用大鼠下腔静脉血栓模型和‎‎大鼠体外AV循环模型进行水蛭素‎‎?(HV3)的抗凝与抗血栓作用研究。结果给予重组水蛭素25，50µg/kg 两个剂量的大鼠下腔静脉血栓重量‎‎分别为21.30?7.35 mg和10.40?16.20 mg，生理盐水对照组为59.50?4.95 mg;重组水蛭素50，25µg/kg的血栓湿重为15.3?3.6 mg和21.5?5.3 mg，生理盐水对照组为48.6?4.9 mg。结论:重组水蛭素?可显著地减少静脉血栓重量，也能显著地降低体外AV循环的血栓湿重。 第四军医大学吕莉和大连医科大学‎‎李欣燕等(2002)在中草药第6期上报道了重组水蛭素抗凝活性的实验研究。研究重组水蛭素的抗凝‎‎活性，以便为水蛭素新药开发提供实验依据。采用家兔静脉注射重组水蛭素前及‎‎后心脏采血，应用血凝仪测定凝血酶‎‎时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶‎‎时间(APTT)，并考察其抗凝活性的量效和时效关‎‎系。结果重组水蛭素能明显‎‎延长TT和APTT，且呈剂量依赖性，但在所试剂量范围内对‎‎PT无明显影响;其延长TT和APTT的作用随时间而下降，作用持续时间60分钟。结论:重组水蛭素具有明显的抗凝作用，明显强于现有抗凝药肝素，且其作用强度与同剂量的德国产重组转基因水蛭素相同。第四军医大学吉林军医‎‎学院吕莉、王艳春、韩国柱等(2002)在中国药学杂志第9期上报道了重组水蛭素抗栓及抗弥散性血管内凝血作用的实验研究。重组水蛭素产品中仅变‎‎异体I、?、?具有抗凝活性，简称rHV、 rHV、 rHV，国内有关单位采用甲基营养型汉逊酵母真核表达123， 系统研究出的重组水‎‎蛭素(rH)与天然水蛭素HV1不同之处，除rH-63位酪氨酸脱硫基外，还有N末端为N-Ile-Thr2型，这为国内外首创，此文研究了此种rH的抗动、静脉血栓及家兔急性弥散性血管内凝血作用，旨在为重组水蛭素新药开发提供科学实验研究‎‎资料。结果表明rH具有强大的动脉、静脉和抗DIC作用，并呈明显的剂量依赖性关系，其抗静脉血栓有效剂量‎‎为12.5 – 100 µg- 11kgˉ,远低于抗动脉血栓的有‎‎效剂量(0.25–2.0 µgkgˉ),于与国外文献报道 1相似，rH抗DIC的有效剂量很低(15.625 - 125µgkgˉ), 当剂量仅为125µgkgˉ1时，试验过程中各项观察指‎‎标均与NS组相同，即完全对抗DIC，rH 抗静脉血栓作用强度约‎‎为肝素的4倍，其抗动脉血栓作用强度约为赖氨匹‎‎林的50倍，其抗DIC作用强度约为肝素的2倍以上，国产rH的抗动、静脉血栓及抗DIC作用强度与德国同类权威‎‎产品Refludan一致。发现静脉注射rH后效应，出现双峰现象，峰值时分别为15分钟和2小时。未出现血药浓度的双峰现象，提示效应的双峰现象与‎‎药动学过程无关，很可能是特殊的药效动力学因素所致。本品抗动脉血栓效应时程为单峰，似可用血管外给药需要经受吸收过‎‎程予以解释。此文描述的方法能够成功地诱发家‎‎兔急性DIC，此法简便，造模成功率高。 (三) 重组水蛭素的临床试验 Bichler, J. 等人 (1988) 在Arzneim – Forsch 第38卷第5期上报道了在16名健康志愿者‎‎身上做的重组水蛭素临‎‎床研究。他们用0.1 – 0.4mg/Kg皮下注射一次或用‎‎0.3 –0.5 mg/Kg皮下注射多次后，采用生色底物或ELISA方法测定血浆或尿中重组水蛭素的浓度，其血浆浓度可用开放的‎‎一房室模型来表示。药物动力学参数的平均值为:消除半衰期为127分钟，总消除为206 ml/分钟，吸收速度常数为0.86/小时，肾脏消除为66 ml/分钟，这些参数随着剂量的变化而稍有改‎‎变。在24小时内，进入人体的重组水蛭素‎‎有32%自尿中回收，血液凝固时间与重组水蛭素的血浆浓度有关。凝血激酶时间(APTT)是最适宜的检验指标。每8小时注射一次，共注射八次，结果在3秒钟时间内有效地延长了‎‎APTT。重复注射，在前一次注射的重组水蛭素未完全‎‎排泄前又注射一次，但在血浆内未见重组水‎‎蛭素积累。人体对注射的剂量是可以耐受的，血相、出血时间和血液化学成分均不受影响。一般无特异抗体发现，只有一名受试者在6周后皮试有阳性反应。 Klocking，H. B. 等人 (1988) 在Folia Haematol.(溶血)(Leipzig) 第115期上报道了对重组水蛭素做的全面毒性研究。无论是急性、亚急性毒性实验，都没有异常反应，对体重、血相、呼吸系统和心血管系统都没有影响‎‎，尿样分析、免疫学检查也都正常，半致死剂量为LD50 > 250mg/Kg。 Markwardt, F. 等人(1991)在止血杂志(Haemostasis)第21卷第21期上报道了用重组‎‎水蛭素做的临床药理研究，他们给健康的志愿者进‎‎行单次静脉注射，单次皮下注射或重复皮下注射。结果表明凝血酶时间和部分凝血酶原时间取决于血浆中重组水蛭素的浓度，血小板计数、纤维蛋白原水平和纤维蛋白分解系统保持不变，出血时间未延长。静脉注射时，重组水蛭素迅速分布到细胞外部空间并排出，半衰期为1 – 2小时，与静脉注射剂量有关。皮下给药时，重组水蛭素在血中的浓度在60 – 120分钟内达到最高值。大部分活性重组水蛭素以未改变的‎‎形式自尿中排出，实验结果与天然水蛭素‎‎的结果相近。 在我国国外医药杂志1994年第3期上报道了新型凝血酶抑制剂水‎‎蛭肽(Hirulog)对冠脉疾病的抗凝效果。这是一种选择性凝血酶抑制剂，取名水蛭肽(Hirulog)它是不同于肝素的新型抗凝药物，是仿照水蛭素(Hirudin)结构合成的含氨基酸的多肽，能有效地选择性地抑制那些结合于‎‎血块的凝血酶，而不因为血小板被激活‎‎而失效。45例作心导管检查的冠脉疾病患者，在心导管术中随机给予小剂量的水‎‎蛭肽(静脉注射0.05 mg/Kg，继续以滴注每小时0.2 mg/Kg)、大剂量(静脉注射0.15 mg/Kg，继续以滴注每小时0.6mg/Kg)或肝素(静脉注射500U)。给药期间定时连续测定活化部分凝血激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、激活凝血时间(ACT)和纤维蛋白肽A(FPA)。该刊1995年第1期上报道了水蛭肽(Hirulog)对不稳定性型心绞痛的治疗价值。文中指出人工合成的水蛭肽是一种‎‎直接的凝血酶抑制剂。20例男性不稳定性型心绞痛 患者经静脉滴注‎‎水蛭肽(每小时0.2mg/Kg)，连续5日;在治疗中保持活化的部分凝血激酶‎‎时间(APTT)大约延长200%。在连续静脉滴注水蛭肽‎‎5日期间，APTT由治疗前的‎‎26、84、0秒延长至61、610、2秒;凝血酶原时间(PT)由治疗前的12.1?1.3秒延长至16.1?2.0秒;纤维蛋白肽A(FPA)水平由治疗前的48?15.1 µg/ml降至27.4?9.5µg/ml。该刊1996年第3期上报道了水‎‎蛭肽(Hirulog)治疗不稳定型心绞痛。文中指出粥样硬化斑块破裂，血小板激活和冠脉血栓形成在不稳定型心绞痛发病原理中有重要作用‎‎。抗血小板药阿司匹林、抗凝药肝素已被列入不稳定型心绞痛的常规治疗药。但是肝素不能抑制结合于血块的凝血酶，使用时必须反复调整剂量，监测抗凝效果，可能引起大出血。水蛭肽则是一种高度特异性的游离和结合于血‎‎块的凝血酶抑制剂的直接抑制剂。410例不稳定型心绞痛患者，每日口服阿司匹林325 mg，随机恒速静脉滴注水蛭肽，剂量分别为每小时0.02 mg(160例)、0.95 mg(81例)、0.50 mg(88例)和1.0 mg(181例)，共计72小时，结果发现72小时和出院时水蛭肽剂量组明显好于阿司匹‎‎林剂量组。该刊1996年同一期上还报道了水蛭肽和肝素对冠脉成形术患者安全性的比较‎‎。文中指出冠脉成形术中应用的新抗凝药和抗血小板药几乎都使出血并发症增加。水蛭肽是凝血酶的直接‎‎抑制剂，在理论上同肝素相比有‎‎许多优点。4312例不稳定型心绞痛或梗塞后心绞痛作经皮穿刺冠脉内成形术‎‎(PTCA), 随机给予水蛭肽或肝素，以比较两者安全性。水蛭肽剂量是静脉注射‎‎1.0 mg/Kg，继续以滴注每小时2.5 mg/Kg，共4小时，再以每小时0.2 mg/Kg滴注14 –20小时。肝素剂量是静脉注射175 U /Kg，继续以每小时15 U /Kg滴注，共计18 – 24小时。结果发现水蛭肽组出血和其它副作用发生率低于肝素组;呕血人数分别为0.8%和1.9%(危险比0.41，90%)。该刊1996年第6期上报道了凝血酶抑制剂重组水蛭素CGP39393用于髋部置换术后深部静脉血栓的预防。文中指出深部静脉血栓‎‎(DVT)是较大矫形手术后严重而常见的并发症。近期的资料显示尽管用肝素预防，全俄的膝关节置换术后‎‎的DVT发生率为20 – 45%。水蛭素是一种天然的，特异性的几乎不可逆的人凝血酶抑制剂。本试验采用的CGP39393是一种通过‎‎DNA重组技术在酵母菌‎‎上表达的重组水蛭素。837例随机分成为‎‎4组:即CGP39393 10、15、20 mg以及混合肝素500 U共4组。CGP39393各组均为每日‎‎2次皮下注射，肝素组为每日3次皮下注射;前者首次给药是在麻醉手术前进行的，后者则在手术开始前2小时给药，治疗期间均为8 – 11天。结果显示手术后预防期‎‎内CGP39393 10、15、20 mg剂量各组静脉血栓的发生明显低于混合肝‎‎素组。该刊1998年第5期上钟倩报道了地西卢定预防髋部置换术后深部静脉血栓形成。文中指出据欧洲研究者‎‎报道Novartis公司的凝血酶抑制剂地‎‎西卢定(Dsirudin, 商品名Revasc)对进行髋部置换手术病‎‎人的深部静脉血栓(DVT)预防作用优于依诺肝素‎‎钠。在这一研究中，2051例来自10个欧洲国家进行全髋部置换手术的可评估病人随机接受本品‎‎皮下注射15 mg，一日两次(1028例)或依诺肝素钠皮下注射‎‎40mg，一日一次(1023例)，共治疗8 – 12天。病人在手术前30分钟接受首剂本品，而首剂依诺肝素钠在手术前夜给药。治疗过程中785例依诺肝素钠接‎‎受者和802例本品接受者可进行首次治疗分‎‎析评估。分析结果:依诺肝素钠组较本品发生大的 血栓栓塞。该刊1998年同一期上钟倩还报道了重组人抗凝血酶?影响肝素的抗凝血作用。文中指出Genzmpe Transgenic‎‎s公司和Genzpoe General 公司的重组人抗凝血酶?可影响用于进行冠脉旁‎‎路移植术(CABG)病人的肝素抗凝血作用。在美国圣地亚哥召开的美国血液学协会年度会议上，这两家公司的研究者陈‎‎述了一项D期临床研究结果。他们认为这是已成功完成的转基因‎‎产生的重组人治疗蛋白的第一个研究。此研究中的30例病人在首次进行冠脉旁路移‎‎植手术前接受了肝素和单次剂量的‎‎本品10 – 200 U /Kg。本品能增进病人对肝素的敏感性，并增强其抗凝血作用，这在CABG过程中可以保护关键的血液组分，从而减少微血管出血。本品的安全性在此研究中得到了证‎‎实。该刊1999年第4期上刘萍报道了抗凝药Lepirudin。文中指出此药的药效分类为纤维蛋‎‎白酶抑制剂，其作用不依赖于抗凝血酶?，主要通过抑制凝血酶触发的凝血因‎‎子V. m常见的活化以及凝血酶引起的血小板的活化而发挥作用。本品还能使血纤维蛋白酶失活，静脉注射给药预防血栓形成的药效‎‎可持续60分钟，用药后作用的持续时间与剂量有关。此药商品名Refludan ;化学名 1—F 苏氨酸—63—脱硫水蛭素;上市开发商:德国Hechst-Marion Roussel 公司, 1997年在德国上市‎‎，1998年在英国和美国上市。此外，中国药学杂志2002年第10期上罗鹃报道‎‎了美国食品与药品管理‎‎局(FDA)于2000年12月批准了Medicines 公司的抗凝新药比伐卢定(Bivalirudin, Angjomax x TM)NDAN 在美国上市，该药系注射用的20肽水蛭素衍生物(片段)，相对分子量2180。是直接的，特异的，可逆性的凝血酶抑制剂‎‎。 从以上研究的结果可以看出，重组水蛭素是颇有应用前景的活血‎‎化瘀药物，其适应症至少包括以下‎‎几个方面:1. 治疗外科手术后的静脉血栓，促进显微外科手术伤口的瘀合;2.治疗DI; 3.预防动脉血栓，尤其是在心脏手术后防止冠脉旁路的血栓形成‎‎;4. 预防动、静脉血管内溶解血栓后或者血管再造后形成血栓;5.改善体外血液循环，尤其是在血液透析操作‎‎中。