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【doc】PCR—SSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用.doc

【doc】PCR—SSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用

海淀区迷失表参道
2017-10-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《【doc】PCR—SSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用doc》,可适用于社会民生领域

【doc】PCRSSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用PCRSSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用钍l一PCRSSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用左矿:国科院医究墨n塑述旱薯竺审棱山东医科大学l于修覃…嚣譬务精青法苯t舟绍,牲朱鹤聚合酶链反应一单链构象多态性分析(singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionprodUcts,PCRSSCP)是近年来发展起来的一种基因分析新方法由于该方法为基因变异,尤其是为单碱基置换点突变的检测和筛查提供了可靠而简捷的手段,自阿世以来,倍受各国学者推崇目前已广泛应用于癌基因,抑癌基因突变,遗传病基因诊断等领域结合非同位索标记方法使其应用前景更为广阔本文仅对其方法学及其在人类肿瘤研究中的应用作一介绍一,PCRSSCP技术()原理及方法年Orita等首先报道了PCRSSCP分析技术其基本原理为,在非变性条件下,单链DNA的构象决定于其碱基序列长度相同,但碱基序列不同(甚至单个碱基改变)的单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶中电泳时因构象的差异形成迁移率不同的条带,呈现泳动变位(mobilityshift)PCRSSCP分析技术中,首先作PCR扩增持定的靶序列,利用引物标记或碱基掺入法使扩增产物带有同位素标记物然后将扩增产物变性何调节的胚胎血管形成,肿瘤血管形成及伤口愈合中的血管形成之间有何差别血管形成刺激剂与血管形成抑制剂之间是如何保持一种平衡以维持生理状态下血管形成处于相对静止人们根据血管形成因子的特性进行了刺激或抑制血管生长的研究,并已取得较满意的结果,例如用bFGF的中和抗体能够明显抑制明胶移植所诱导的新血管形成,应用抗VEGF抗体能够明显的抑制肿瘤的形成与生长参考文献】FolkJBiolChem:l,FolkmanJAriaSurs,lS:,Burse~sWetaAnnRcvBioehemI:,Moscat~iliDe'alJC~PhysioI:,Sehw~iscrcrLctENature,}CoonGecaProcNat】AcadSciuSA,*LshikawaFetaNature:,SchreiberLecaSciencel{,FoxEetaInMol~ularBiolQSYoftheCardiovascularSystem一I,SshaplroRctaProcNadAeadSeiUsA】:,儿HockeIMctaJCIinInv~t:,l$pornMctaNaturer:,'B~utlerBctaNature】{:昌,|TaylorSctEINature,,:~PhillipsDecaJBiolChem一{=,IMaloneDecaScience=,LuttyGtaJ(ellSel:,MurrayJecaJBiolChem,~l:',{』EzekowitzR耐aNEnslJMed一:,|期第馨船第月,国外医学肿瘤学分册为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果改良的非同位素PCRSSCP,采用荧光素等非同位素标记PCR技术,或常规PCR扩增后通过硝酸银或溴化乙锭染色显示SSCP分析结果一SSCP结果分析较为复杂,但一般而言,与正常序列相比呈现泳动变位的DNA分子即提示有突变存在在进行肿瘤学研究时,为避免DNA多态性的影响肿瘤标本和正常对照标本应取自同一个体据上所述,PCRSSCP分析利用DNA单链构象差别检测基因点突变,不需要特殊仪器和昂贵试剂,操作相对简便易行那么其检测灵敏度如何呢根据多数实验室的报道,对于小于bp单链DNA片段,SSCP分析的检测灵敏度可达,一般认为,随DNA长度增加,其检测灵敏度相应减弱然而,大多数哺乳类动物基因组外显子均小于bp,因而适用于PCRSSCP分析Fan等报道在,bp范围内,突变的位置(居中或靠近某一末端)及类型(转换或颠换)似乎对SSCP检测灵敏度无明显的影响Saad等研究发现如采用MSSCP(multiplexSSCP)则可有效检出长达bpDNA片段中的点突变(二)影响因素PCRSSCP分析的成功与否受到以下因素的影响,如单链DNA的长度,DNA变性的条件凝胶的浓度,交联度,温度,甘油含量以及电泳缓冲液浓度等人们一致认为保持电泳中凝胶内温度的恒定是SSCP分析最关键的因素温度有可能直接影响到DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出为控制温度一般可采取以下措施:应用恒温控制循环器或简便的循环水冷却及空气玲却薄胶(如ram)和低功率电泳室温条件下,凝胶中加入少量甘油(,l),往往可获得满意结果原理尚不甚清楚,有人认为可能甘油有稳定单链DNA构象的作用不同DNA片段的最适条件可能不同,进行几种不同电泳条件下的SSCP分析,有助于保证其突变检出有效率在严谨控制试验条件的前提下,SSCP可获得较好的重复性(三)方法学新进展非同位素SSCP(IRSSCP)方法的发展使PCRSSCP的应用前景更为广阔避免了同位素方法的诸多不便方法更为简便,安全,快速,适于临床检测的需求SSCP银染色法(silverstaining)是目前应用最多的一种IRSSCP方法"一其利用银离子可与核酸结合的特性,在甲醛作用下银离子还原使凝胶中DNA条带显色染色方法简便,经济,快速(,小时),灵敏度虽略低于同位素方法但完全可达到检测要求因而多数学者认为银染方法可取代同位素方法用于l临床标本的检测另一通过染色显示SSCP条带的方法是溴化乙锭(EB)染色法此方法由Yap等首次应用缺点是安全性较差,灵敏度也低于银染方法但Hongyo等在以上基础上改进并采用了"coldSSCP"方法,使SSCPEB染色法灵敏度大为提高,成功检测了临床肿瘤标本中p和fas等基因突变荧光标记SSCP(FSSCP)l'使IRSSCP技术在高效,灵敏,自动化等方面又向前迈进了一步采用半自动凝胶电泳系统,结果可通过计算机处理,但上述方法多需要特殊设备,不适用于一般小型实验室总之,以PCR为基础的SSCP分析技术,在快速,简便,非同位素化等方面已得到了较大发展,为分子肿瘤的研究奠定了方法学基础二,分子肿瘤学研究中的应用近年研究揭示,人类肿瘤的发生与细胞内原癌基因激活和抑癌基因失活有关,在DNA水平上主要表现为基因的突变和缺失等PCRSSCP分析技术在肿瘤发生的分子机制研究方面有许多的优势和特点,极大地加速了对恶性肿瘤发病机理以及肿瘤的诊年月第卷第期断,预后监测等工作的研究进程(一)特点及优势()PCRSSCP能有效地检出其它技术不易检出的单碱基置换点突变操作及技术条件较易掌握适于大量临床肿瘤标本的筛查,并为进,步的研究提供了方便()适用于各种肿瘤标本,如活检,手术后新鲜组织以及石蜡包埋组织甚至小至内窥镜或细针穿刺活检组织()除点突变外,PCRSSCP分析尚能同时显示短核苷酸序列的缺失或插入口这在分子肿瘤学研究中有重要意义研究已表明抑癌基因失活常表现为一个等位基因突变而另一等位基因的丢失如p抑癌基因点突变伴随p杂合性丢失(ossofbeterozygosity,LOH)的机率在结肠癌,肺癌,食管癌等恶性肿瘤中很常见()PCRSSCP对于检测突变位点不固定的基因(如p基因)有较大应用价值对于已知固定突变位点(如ras癌基因)PCRSSCP可通过不同的带型显示多种突变类型【()突变的mRNA也可检出,从而可自基因表达水平进行研究在此方法中,细胞中提取的总RNA,在逆转录酶作用下反转录为eDNA从而用于PCRSSCP分析(二)理论意义及应用前景()肿瘤分子机制的研究口抑癌基因功能失活与人类肿瘤的关系是目前肿瘤发病机理研究的一个热点借助于简便,快速的PCRSSCP技术许多学者对p基因赛变在多种恶性肿瘤笈生发展过程中所起的作用进行了研究见表研究发现人类大多数恶性肿瘤存在p基因突变点突变是导致p功能失活的最主要方式约点突变发生于p基因高度保守的第,外显子区域内,且多为错义突变似乎在多数肿瘤中P基因错义突变常能明显延长p蛋白半衰期导致肿瘤细胞内蛋白聚积,并常发生于浸润强的癌肿中在少数肿瘤如原技性宫颈癌,鼻咽癌等,p基因突变率很低,提示p基因突变并非每种癌变发生所必需鉴于宫颈癌和鼻咽癌分别与HPV和EBV感染密切相关,研究认为病毒癌蛋白与野生型p蛋白作用而使其功能丧失可能是此种肿瘤p失活的另一途径或者是有其肿瘤增殖力学研究的方法学及z第三军匡大学新桥医I~(oo),旦工述晏才杰审棱摘要肿瘤增殖力学的研究对探讨肿瘤生物学特性,指导床治疗和顸后评估有着重要价值肿瘤增殖力学(neoplasmproliferationkinetics)是研究肿瘤细胞群体在增殖周期申动态变化规律的学科早在年代Howard和Pelc用磷掺人大豆根进行研究提出了细胞分裂周期中各时相的概念,奠定了现代肿瘤增殖力学发展的基础近年来随着研究技术的不断改进肿瘤增殖力学的研究已从单纯的形态学观察深入到分子定量水平使它潜在的位于p,llpp等的抑癌基因失活参与了其癌变过程()肿瘤的早期诊断和预后判断:某些癌基因点突变可发生于肿瘤发生的启动阶段,借助于先进的分子生物学技术,攻克癌症早期诊断这一难关已成为可能目前研究最多的是ras癌基因已在大肠癌,胰腺癌及肺癌的癌前病变组织中检到Kgas突变尤其引人注目的是Sidaranky和Tada已分别自大肠癌患者粪便以及胰腺癌病人胃抽吸液及粪便中成功地检测出了K:ras基因突变,从此开辟了无创伤性基因诊断的新途径胰腺癌组织中Ktag基因不同寻常的高突变率(O,)已引起学者们的关注有作者认为Ktas基因突变有望成为用于区别胰腺癌和其它胰豫肿块自有用诊断标记p基因突变是人类肿瘤中最常见的基因改变在多数肿瘤中,p基因突变似乎是一癌变的晚期事件,影响着肿瘤的进展和转归许多研究已表明在常见恶性肿瘤中(如大肠癌,非小细胞肺癌,乳腺癌等),p基因突变与肿瘤的恶性程度,转移率及复发率呈正相关p基因突变有希望成为肿瘤预后判断的检测指标之一,有助于发现预后不良的肿瘤病人指导对肿瘤病人的临床处理参考文献OritaMeta】Oenomics,:,AinsworthPJetal,Nu~lrcAcidsRes,{I,HongyoTetaNucleicAcidsRes,lI:,AsakTFetaPCRMethodsApplII:HayashiKPCRMethodsAppl,lt,FanEetaMutationR髑,{:,SaadFActaPCRMethodsAppl:鲫,LerenTPetalPCRMethodsAppl,l:,IHayashiKGATA,I():~Sug~moKLaboratorytigation{:,INoguchiMetDiagMolPath:Ma~awaCetalJapJCancerResMurakamiYMetOneogene:,TsudaHHiroha~hiSatJCancer{:,SossiTctantJCancer{,张德凯等中毕噩学遗传学杂志,,~TsdaHetaJapJCanerRl:,~ChooKBetaV~rology}:,GaHKetaCancerRes,}l~WinandNMetaIntJCancer,tE~Z,*nqwalaMeLantJCancer}lOF,EffertPetaJVtrol,:FearonetJNC,I,}:Frel~uryTet$NCI{:

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