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野生罗汉果种群分布格局研究及克隆结构RAPD分析(可编辑)

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野生罗汉果种群分布格局研究及克隆结构RAPD 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 (可编辑) 野生罗汉果种群分布格局研究及克隆结构RAPD分析 广西师范大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 野生罗汉果种群分布格局研究及克隆结构RAPD分析 姓名:李媛 申请学位级别:硕士 专业:野生动植物保护与利用 指导教师:唐绍清 20060101野 生 罗 汉 果 种 群 分 布 格 局 研 究 及 克 隆 结 构 RAPD 分 析 广西师范大学生命 科学学院 2003 级研究生 李 媛 专业:野生动植物 保护与利用 研究方向:保护生 物学 导师 : 唐绍清博士 摘 要 罗汉果(Siraitia grosvenorii Swingle C.Jeffrey )是单性、雌雄异株的 葫芦科多年生藤 本 植 物, 它 可以 靠 藤本茎 进 行克 隆 繁殖 , 是我国 南 部特 有 的重 要经 济 植 物 。 有 关 罗汉 果 的 分类学、 地理分布、 形 态学、 开发利用和栽培 技术等方面已经有了较 深入的研究。 针对罗 汉果缺乏有关种群生态学方面研究的现状, 本研究采用方差/ 均值比率法 对 8 个野生罗汉果 种群的分布格局类型进行了分析, 同时采用负 二项式参数、 扩散性指 数、 丛生指数、 平均 拥挤度指数和聚块性指数等计测这些种群的空间集聚强度。 另外, 对克隆植物种群进行克 隆鉴定和克隆空间分布格局研究对于研究种群动态和进化有极其重要的意义。 因此, 我们 运用 RAPD 分子标记方法对其中的 4 个罗汉果 种群的克隆结构和克隆多样性进行了初步研 究。 本研究的目的 在于探讨野生罗汉果种群分布格局的特点及形成原因, 为掌握罗汉果的 生物生态学特性提供理论依据; 以及了解罗汉果的克隆多样性水平、 克隆结构及其影响因 素, 为进一步揭示其克隆生长过程和生态适应机制提供基础信息。 本研究获得如下实验结 果: 1. 在 较 大空 间 尺度 上,罗 汉 果 呈不 同 集聚 斑块的 嵌 式 分布 , 而斑 块内的 罗 汉 果种 群 分 布格局呈聚集分布或随机分布。 不同的罗汉果种群的聚集强度有所差异, 但聚集强度都不 高。影响罗汉果种群分布格局形成的原因主要与地质生境、罗汉果的生物学特性等有关。 2.采用 15 个 RAPD 引物对 4 个罗汉果种群 共 351 个样品进行 RAPD 分 析, 共得到 109 条可统计条带,其中 89 条为多态带,占总条带数的 81.7%。在四个野生罗汉 果种群中, 总 基 株 数 G126 ; 平 均 克 隆 大 小 Nc3.0854 ; 不 同 基 因 型 比 率 PD0.3445 ; 克 隆 多 样 性 Simpson 指数 D0.8627;克隆的基因型分布均匀性 Fager 指数 E0.7214 。 结果显示与其他 种类克隆植物相比野生罗汉果种群具有相对较高的克隆多样性 。 对克隆生 长空间格局分析 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明, 野生罗汉果 种群的克隆之间有明显的相互交错, 克隆构型为典型的 游击型。 不同克 隆之间存在较大的差异。 罗汉果种群具有较高的克隆多样性水平可能与罗 汉果的有性繁殖 和克隆繁殖方式,实生苗更新率以及干扰频率等因素有关。 关 键 词 :罗汉果;种群;分布格局;克隆结构;克隆多样性;RAPD IS t u d y o n d i s t r i b u t i o n p a t t e r n o f n a t u r a l S i r a i t i a g r o s v e n o r i i p o p u l a t i o n s a n d c l o n a l s t r u c t u r e r e v e a l e d b y R A P D m a r k e r s Li yuan ;College of Life Sciences, Guangxi Normal University ;Grade:2003; Speciality: wildlifes conservation and utilization; search direction: Conservation Biology; Supervisor: Pro. Tang Shaoqing Abstract Siraitia grosvenorii Swingle C.Jeffrey Cucurbitaceae, a dioecious ,perennial and liana plant with root tubers, which stems lowered to the ground can occurs clone growth, is an economically important species endemic to southern China. Analysis about Siraitia grosvenorii on taxonomy, geographic distribution ,mophology, cultivation techniques and exploitation have developed to a in-depth level, Whereas there is lack of the research population ecology currently. The distribution pattern of eight natural Siraitia grosvenorii populations in Guangxi were analyzed by the variance/mean ratio method, and their aggregated intensities were measured by using the following indices: negative binomial parameter, dispersal index, clumping index, crowing mean index and patchiness index. Inaddition, the identification of clones and their spatial distribution is neccessary to study the dynamics and evolution of clonal plant population. Therefore, clonal structure and clonal diversity of four from the eight Siraitia grosvenorii populations were inferred from random amplified polymorphic DNARAPD markers. The purpose of this study is to infer the spatial pattern of natural Siraitia grosvenorii populations and analysis the reason to provide a theoretical basis for the biological characteristics of Ecology; to understand the clonal diversity, clonal structure to further reveal its clonal growth process and based information of mechanisms of ecological adaptation. This study get to the conclusion thereinafter: 1. The results showed that, in the larger space scales, Siraitia grosvenorii populations have different style of inlay distribution; the distribution patterns were random or clumped, and the intensity was different among different populations but was not high. The distribution of populations are influenced mainly by its biological characteristics and microtopography. 2. A total of 351 plants sampled from four populations of eight were analyzed using 15 IIRAPD primers ,which produced 109 scorable amplified fragments ,of which 89 81.7% are polymorphic. 126 genets were indentified among 351 samples taken from the four populations.The clonal diversity indexes were respectively: average number of clones Nc3.0854, proportion distinguishable PD0.3445, cloned diversity of genotype Simpson’ s index D0.8627, distributional uniformity of genotype Fager’ s index E0.7214. The results show that natural Siraitia grosvenorii populations exhibited high levels of clonal diversity compared to other clonal plant species. The analysis of clonal structure demonstrated that there were obvious staggers among clones of natural Siraitia grosvenorii populations and the spatial pattern of clonal growth was typical guerilla architecture. The size of different clones, however, varied greatlt. High level of clonal diversity of Siraitia grosvenorii populations may be caused by sexual reproduction and clonal growth strategy, seeding recruitment rates and frequency interference. Key words: Siraitia grosvenorii ; population; distribution pattern; clonal structure; clonal diversity; RAPD III论 文 独 创 性 声 明 本人郑重 声明 : 所 提交的学 位论文 是 本人在导 师的指 导 下进行的 研究工 作 及 取 得 的 成 果 。 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外 , 本 论 文 不 含 其 他 个 人 或 其 他 机 构 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 。 对 本 文 的 研 究 作 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集体,均已在文中以明确方式标明 。本人承担本声明的法律责任。 研究生签名: 日期: 论 文 使 用 授 权 声 明 荐 本人完全 了解广 西 师范大学 有关保 留 、 使用 学位论文 的 规定。 广西师范 大 学 、 中 国 科 学 技 术 信 息 研 究 所 、 清 华 大 学 论 文 合 作 部 , 有 权 保 留 本 人 所 送 交 学 位 论 文 的 复 印 件 和 电 子 文 档 , 可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 其 他 复 制 手 段 保 存 论 文 。 本 人 电 子 文 档 的 内 容 和 纸 质 论 文 的 内 容 相 一 致 。 除 在 保 密 期 内 的 保 密论 文 外 , 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅 , 可 以 公 布 ( 包 括 刊 登 ) 论 文 的 全 部 或 部 分 内容。论文的公布(包括刊登)授 权广西师范大学学位办办理。 研究生签名: 日期: 导 师签名: 日期: ‖ 西壮族石?、 龠/\ 哦/ \ ::, \第 一 章 前 言 1.1 罗 汉 果 简 介 罗汉果 (Siraitia grosvenorii Swingle C.Jeffrey ex //0>. et //.ng ) 是单性、 雌雄 异 株 、 多 年 生 草质 藤 本、 宿 根 的 葫 芦 科(Cucurbitaceae ) 植 物 , 是 我国 特 有 的 药 用 植物 , 同时从果实中提取的罗汉果甜甙可用于食品添加剂、 药物及甜味替代品, 具有极高的经济 [1] 价值 。 1.1.1 罗汉果的地理分布和生境类型 罗汉果主要分布于广西, 湖南、 广东等省也有 零星分布。 广西罗汉果野生资源十分丰 富,分布相当广泛;东起梧州市的昭平县,西至百色市的凌云县,南起钦州市的浦北县, [2] 北至桂林市的临桂县,均有零星分布,垂直分布于海拔 250~1000m 。罗汉果是喜阳的攀 援植物。一般生长在山谷、溪边,也有生长在湿润的山坡上。 1.1.2 罗汉果的研究进展 由于罗汉果具有极高的药用价值与经济价值, 长期以来一直引起国内外有关专家和学 者 的 重 视 和 研 究 兴 趣 。 早 期 有 关 罗 汉 果 的 分 类 地 位 存 在 较 大 的 在 争 议 , 到 了 80 年 代 , Jeffrey 、 路安民、 张志耘 等提出的分类主张得到了普遍的接受, 将罗汉果的学名定为: Siraitia [3,4] grosvenorii Swingle C.Jeffrey ex //. et //.ng 。1953 年,Darlington 就 对 罗 汉 果 [5-7] 的染色体数目进行了研究, 后来国内也有一些 相关的研究报道 。 随 着 罗汉果的重要化学 [8 , 9] [1 0 , 11] 成 分 ? ? 罗 汉 果 甜 甙 的 发 现 , 以 及 药 效 药 理 的 研 究 的 开 展 , 有 关 罗 汉 果 化 学 成 分 [12-17] 方面的研究及开发利用的报道不断涌现 , 为更好的利用与开发其药理作用提供了基础。 研究的不断深入使得罗汉果的用途日益广泛。 [18-20 ] [21-26] 罗 汉 果 是 桂北 地 区的 重要 经 济 作 物, 关 于罗 汉果 种 质 资 源 、 栽培技 术 、 病 虫 [27-33] [18] 害防治和病毒病 等方面的研究也是相当丰富。 周良才 (1981) 等指出, 广西永福县、 临桂县为罗汉果栽培起源地, 长期的自然选择和人工引种栽培, 形成了较多的品系、 品种 和类型。传统的罗汉果栽培是采用压条来进行繁殖,到了 90 年代,在采用组织培养方法 [34-36] 脱毒获得无病罗汉果种苗的试验研究取得了重大进展之 后,组培苗技术不断发展 ,在 生产实践上也得到了的推广。 虽然改变了传统的繁殖方式, 而采用组培苗 进行栽培, 罗汉 [37, 3 8 ] 果的品质和产量都得到了改善和提高, 但是随之而来也出现了一些新的难 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 , 这 也 说 明了组培苗技术还不够成熟, 还有待进一步的改善和提高。 目前一些学者如李伯林博士等 正在针对组培苗栽培新出现的问题而努力的开展相关研究。 近年来我们实验室开展了对罗汉果种质资源及其遗传多样性的调查研究, 相关的报道 [39] 如彭云滔等(2005) 应用 ISSR 分子标记方 法对采自广西和广东的 7 个罗汉果野生居群 共 130 个个体进行了遗传多样性分析。 研究表明, 罗汉果不同居群的遗传多样性水平差异 [40] 较大,但是总体的遗传多样性水平较低。周俊亚等( 2005) 采用用 ISSR 分子标记对栽 1培罗汉果样品进行了遗传多样性分析。 结果表明主要的栽培品种青皮果、 红毛果和爆棚籽 的遗传多样性很低, 但有少数形态差异较大的样品具有较大的遗传差异; 而茶山果和冬瓜 [41] 汉具有较高的遗传多样性。 周俊亚 (2006) 采用 RAPD 方法对 75 份栽培罗汉果样品进行 分析,得到的结果与 ISSR 的结果相似,讨论了栽培罗汉果的遗传多样性低的现状是由于 栽培罗汉果主要是采用营养繁殖方法进行繁殖的结果, 并提出有必要扩大栽培罗汉果的遗 传基础。目前,关于罗汉果种群分布格局和克隆结构方面的研究尚未有报道。 12 种 群 分 布 格 局 研 究 种群空间格局研究始于 20 世纪 20 年代,距今已有 70 多年的历史。由于该理论具有 很广阔的应用空间, 目前仍然是种群生态学研究的一个重要方向。 种群分布格局 ( Pattern) 或 称 散 布 ( dispersio n ) , 是 指 在 种 群 这 一 水 平 上 , 种 群 内 个 体 在 一 定 范 围 内 水 平 空 间 的 分布状况, 它是种群生物学特性、 种内种间相互关系及环境条件综合作用的结果, 是种群 [42] 空间属性的一个重要方面,也是种群的基本数量特征之一 。 植物种 群的 空间 分布 格 局是植 物种 群生 物学 特 性对环 境条 件长 期适 应 和选择 的结 果, 是植物种群的基本数量特征之一, 是研究种群特征、 种群间相互作用及种群与环境关系的 重要手段。 植物种群的 空间格局不但因种而异,而且同一种在不同发育阶段、 不同的生境条 件下也有明显差别。研究种群分布格局的目的不仅在于对种群水平结构进行定量的描述, [43] 更重要的是揭示格局的成因,阐述种群及群落的动态变化 。 [44] 种群格局一般分为随机分布、 集群分布、 均匀 分布 3 个类型 。 已有 的研究表明, 随 机分布和均匀分布很少出现。 自然情况下, 植 物种群个体常为集群分布。 集群分布格局的 成因主要为: ?种子传播距离的有限性。 由于重力作用, 降落在母株周围的种子萌发后产 生的幼株群; 营养繁殖的植物通过根茎从母株蔓延开去, 形成植丛的簇生现象, 此种格局 [42] 类型实为“形态的格局” 。?环境的空间异质性。?种间相互关系 。 [45-48] 植 物 种 群的 空 间格 局 及动 态 目 前在 国 内研 究 得最 多 的 是木 本 植物 种 群 , 关 于草 本 [49-51] [52-53] 植物的也有较多报道 。而有关攀援植物的种群生态学研究的报道相对较 少 。 13 克 隆 植 物 生 态 学 研 究 1.3.1 克隆植物生态学研究的意义 植物的无性繁殖是自然界普遍存在的一种生物学现象, 其中有一类无性繁殖是在植物 营养生长过程中实现的, 这种过程就是克隆生 长 (clonal growth ) 。 克 隆生长是在自然条件 下产生新的、 具有潜在独立生长能力的、 基因型一致的分株的过程。 如横生根茎或匍匐茎 和某些部位产生不定枝或枝叶和不定根。 一定时间后, 横生根茎或匍匐茎断裂或失去功能, 形成多个遗传结构一致的独立新个体。 具有克隆生长习性的植物即克隆植物 (clonal plant ) [54] 。 克隆植物在生态系统中是重要的组成部分,在不同类型的群落中发挥着重要的作用。 2多 年 生 的 草 本 和 灌 木 植 物 大 多 数 都 是 克 隆 植 物 , 例 如 我 国 竹 林 中 所 有 的 竹 类 都 是 克 隆 植 物。克隆植物能有效的寻找空间,利用异质性生境,增加种群适合度,因此 ,它们在群落 及生态系统中起着重要的作用。 克隆植物存在于几乎所有的生态系统类型 中, 克隆植物在 [55] 群落中的出现影响着群落的物种组成,物种多样性以及群落的格局与动态 。 克隆植物具有生长的空间拓展性――觅食行为和宽广的生态对策谱, 及较非克隆植物 有较高的 CO ,光能与 水分资源利用能力。具有较强的适应恶劣环境的能力和较强的生存 2 竞争能力, 它们在更新恢复生态过程中起着重要的作用。 克隆植物是一个在自然界中广泛 存 在 的 植 物 类 群 , 它 们 不 仅 是 自 然 生 态 系 统 的 重 要 组 成 部 分 也 与 人 类 社 会 生 活 有 密 切 关 [56] 系,因此对克隆植物生长机理的研究和调控 克隆生长都具有重要的意义 。 目前, 生物多样性保护已成为生物学研究的重点和热点领域之一, 而克隆植物的遗传 多样性研究是生物多样性保护的一个不可缺少的组成部分。 国际上有关克隆植物生态学的 研究已经取得了多方面的进展, 并成为当今植物生态学研究的热点之一。 对种群内基株数 目和克隆多样性的估计是研究克隆植物的重要内容之一。 随着分子标记技术的应用, 准确 的鉴定克隆基株和分株已成为可能, 从而为植物繁殖策略、 克隆生长和动态研究提供了技 术上的保证。 因此采用可靠的遗传标记对克隆植物开展遗传多样性方面的研究显得十分必 要和迫切。 但目前国内对克隆植物遗传多样性的研究还比较少。 鉴于克隆植物特殊的生殖 模 式 和 扩 散 方 式, 对 其 遗 传 多 样 性 的 研 究 可 以 使 我 们 了 解 在 无 性 情 况 下, 生 物 的 遗 传 变 异 产 生 、 维持 和分 布 情况,通 过 与有 性繁 殖 的比 较, 可 以更 好地 了 解有 性繁 殖 的进 化意 义,也 可了 解 克 隆 繁 殖 得 以 在 进 化 中 占 有 一 席 之 地 的 原 因 。 研 究 克 隆 植 物 的 遗 传 多 样 性 对 进 化 遗 传 学、生态遗传学等都有一定促进作用。 1.3.2 克 隆 植 物 种 群 生 态 学 研 究 的 主 要 内 容 克 隆 植 物 种 群 生 态 学 主 要 是 研 究 克 隆 植 物 自 然 种 群 中 分 株 和 基 株 种 群 动 态 , 克 隆 构 型,分株空间分布格局,基株(基因型)多样性等。 1.3.2.1 克隆生长格局研究 克隆植物的生长格局分为两个层次: 一个是表征克隆分株的水平空间分布格局, 对这 [56] 方面进行的研究较多。 另一个是表征构件排列方式的克隆植物构型或生长 型 。 克隆构型 Clonal architecture , 即克隆分株种群Ramet population 在空间内的放置格局。 克隆构型是 由克隆生长过程中 3 个形态学性状决定的:1 间隔子长度,2 分 枝强度和3 分枝角度。 一般而言,间隔子长, 分枝少,并不断沿原方向生长,在水平方向迅速扩展,形成近直线 型 的 子 代 分株 链 。 具有这 种 生 长 格 局 的 植 物被称 为 “ 游 击型guerilla ” 克 隆 植 物, 如 许 多 根茎型,匍匐茎型克隆植物。相反,间隔子短 ,分枝度强,但方向性 差,扩展慢,形成不 规则圆 形株 丛。具 有这 种生长 格局 的植物 被称 为“密 集型phalanx ” 克隆植 物, 如许多块 根 块 茎 型 , 球 茎 鳞 茎 型 克 隆 植 物 。 “ 游 击 型 ” 克 隆 植 物 的 分 株 通 常 被 别 的 物 种 所 包 围 , 而 “密集型” 克隆植物的分株常常被自己产生的分株包围。 克隆构型被认为是植物在其进化 3[57] 过程中形成的与其利用环境 (如资源) 异质性能力相关的性状 。 例如, “游击型Gurilla ” 构型植物具有很强的克隆扩散Clonal expansion 能力, 易于利用分散 分布的资源。 相反, “密 [58] 集型Phalanx ”构型 植 物的克隆扩 散能力有 限 ,宜于利用 非常局部 分 布的资源 。因此, 克隆构型和分株种群是植物克隆生长及其生态适应对策研究的基本内容。 [59-61] 人 们 对 克隆 植 物生 长 格局 研 究 多借 用 群落 调 查的 方 法 (如 : 区组 样 方法 ) 。随 着 一 些 先 进 的 数 学 成 果 在 生 态 学 中 是 应 用 , 各 种 数 学 模 型 已 经 被 用 来 进 行 克 隆 生 态 学 研 究 [62] 。 数学的发展和计算机技术的应用将使精确描述克隆植物的生长格局及其动态发展成为 可能。 在未来的克隆植物研究中, 数学模型将起关键作用, 提供关于复杂格局和过程的可 检验预测和假说。 1.3.2.2 克隆植物的遗传多样性 长期以来, 人们一直普遍认为克隆生长将会导致种群内基因型变异和遗传变异的下降 [63] 。 早期的研究一般是根据形态变异和其他的表型性状进行克隆鉴定, 或者直接根据分株 之 间 的 连 接 情 况 来 确 定 克 隆 关 系 。 比 如 有 些 克 隆 植 物 可 以 通 过 挖 掘 地 下 根 或 茎 来 确 定 分 株, 但是老的分株和母株之间的连接在一定时间之后会消失, 所以根本无法进行准确的判 断。而且该方法不仅费力,对植物的破坏也极大。另外,由于可利用 形态性状太少,而且 [54] 对许多形态性状的遗传基础不了解,鉴定效率低,其应用受到很大的限制 。 近年来随着分子遗传标记技术的发展, 利用分子标记 (如等位酶、 RAPD 、 AFLP 和 ISSR 等) 进行克隆多样性的研究越来越多, 研究发现克隆植物的遗传多样性水平并没有人们预 [64-71] 期的那么低,一些克隆植物种群具有较高的遗传多样性 。 也有一些研究,特别是对一些水生湿地克隆植物的研究发现其遗传多样性水平较低。 [72] Mashburn 等(1978) 对香蒲属 Typha 的研 究发现其遗传多样性很低。紫菀科根茎植物 Wyethia reticulata,其种群仅由少数几个很大的基株组成,种群内遗传多样性水平较低 [73] 。 既然很多克隆植物的多样性并不象人们预期的这么低, 但是遗传变异从何而来呢?对 于兼性克隆植物 (除克隆繁殖还可兼性有性繁殖) 来说, 其遗传多样 性水平与有性繁殖和 无性繁殖的相对比例关系密切, 它可以通过有性繁殖来补充遗传变异的损失、 提高种群内 的遗传变异水平并降低种间的差异。 对于专性克隆繁殖的植物, 其遗传变异来源是其本身 就是多克隆的,并保持有较高的多样性,或者是由于幼苗更新(seeding recruitment )在克 [74] 隆植物种群发展的某个阶段发生过,其残余的遗传多样性 也会较高 。 [69] [75] 在一个新的地方 出现一 个新的克隆种群 通常是 由种子来建立 。Eriksson (1993) 提出植物种群中种苗补充格局通过两种不同的机理来维持高水平的克隆多样性: ?初期种 苗补充 (ISR ) 。 种群发展早期很短的一段时间内有大量的种苗定居, 在初期侵殖阶段过后, 定居种苗减少。 在这个阶段, 随着时间推移和对多变的生态环境发生响应的种群承载能力 的降低, 可能发生遗传多样性丢失。 ?种群发展过程中的种苗重复补充 (RSR ) , 当一个新 的区域被一克隆侵入后, 幼苗更新重复地发生。 如果没有进一步的幼苗更新, 由于选择性 4消除基因型或植物的随机死亡,预计种群的克隆多样性在一定时期之后将会降低。但是, 如果幼苗更新重复发生, 即使每年只有一次少量的幼苗建立, 只要连续发生, 可能就足以 避免遗传漂变 (genetic drift ) , 防止种群中只由 一个或少数几个基因型占统治地位, 以保持 [76、77] 克隆植物原有的遗传多样性 。 这一补充模式将对种 群 总 的 遗 传 动 态 、 自 然 选 择 的 作 用 和在生活进化史上有极其重要的影响。 1.3.3 研 究 的 方 法 1.3.3.1 克隆植物空间结构研究的基本取样方法 合理取样是生物多样性有效保护、 利用和研究所面临的最基本问题, 它在很大程度上 [78] 受到植物自身的生物学特性、环境条件和取样目的的影响 。 克隆多样性的估计受采样尺度、 基株的数目和空间分布以及遗传标记的数目和可变性 [64] 的影响 。 为了得到更为准确的结果, 在克隆植物遗传多样性和克隆结构的研究中, 选择 适 当 的空 间 尺度spatial scale 也 很 重 要, 如 果选 择 的采 样 尺度 太小 ,比 如 小于 或 等于 营 养 繁殖散布一步的距离, 就无法得到清晰的克隆结构; 而太大的采样尺度会错过小尺度的克 [79] [80] 隆结构 。针对不同克隆习性的植物,我们可以采取不同的采样策略 。 ?系统 (机械) 取样 :针对密集型的草本或灌木植物, 我们可以采用 以下方法对种群 内的个体采取网格采样(如图 1) 。网格的大小可以根据种群的大小、数量来决定。 图 1 网格取样法 Fig. 1 Grid sampling ?权重取样 (比率) 取 样: 就是根据种群的分布情况来决定取样的数量 (如图 2) 。 该 方法适合于分布较随机, 比较分散的种群, 如 果全部取样, 工作量相 当大, 但是如果采用 网格法取样,又会造成取样不合理,不能很好的反应实际情况。 5图 2 比率取样法 Fig. 2 Ratio sampling 另外, 如果植物种群呈斑块分布, 而且种群内的个体数目比较少的情况下, 我们可以 采取斑块内全部采样。 总之, 要针对不同种群的分布状况来决定采样策略, 只有合适的采 样尺度才能更准确的反映种群的克隆结构。 1.3.3.2 分子标记在克隆鉴定中的应用 个体是 组成 种群 的基 本 单位, 种群 的特 征, 结 构和动 态都 是由 个体 体 现的。 而在 克隆 生长占优势的植物中, 由于个体可以通过分枝, 根出条等生长单位说所体现, 如何确定遗 传上的独立个体 (即克 隆鉴定) 就成了研究克 隆植物的关键。 在克隆 植物中, 一个种群 的 遗传有效大小不能通过对现存的无性系分株计数来得到, 而是由基株数目决定, 即具有相 同基因型的个体被视为一个基株或克隆, 作为一个遗传个体。 由于采样单位和遗传上的独 立个体之间容易混淆, 个体鉴定的可靠性就成了研究克隆植物的关键, 只有知道居群中个 体(分株)是由多少遗 传上独立个体(基株) 构成,才能准确的掌握种群的大小、结构和 [54] 动态机制, 进一步研究种群中各种遗传参数, 如基因流等 。 一个看起来 “大” 的分株种 2 群在基因型的意义上来说可能很小, 例如 Populus tremuloides 的一个基株, 覆盖面积 43km , [81] 包含 47000 多个分株 ;黑蕨(Pteridium aquilinium ),据报道它的一个基株可扩张到一公 [82] 里以上 。 因此, 对种群内基株数目和克隆多样性的估计是研究克隆植物的第一个重要步 骤。 [83] DNA 分子标记是上世 纪 80 年代产生的以 DNA 的多态性为基础的 遗传标记 。DNA 分子标记一般指在 DNA 水平上、以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记, [84] 它是 DNA 水平遗传变 异的直接反映。与表型标记相比,分子标记具有以下优越性 :? 直接以 DNA 的形式表现,在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到,不受季节、环 境限制,不存在表达与否的问题;? 数量极多,遍及整个基因组;? 多态性高,自然存在 着 许 多 等 位 变 异 , 不 需 专 门 创 造 特 殊 的 遗 传 材 料 ; ? 表 现 为 “ 中 性 ” , 即 不 影 响 目 标 性 状 的表达 ,与 不良 性状无 必须连 锁; ?有 许多分 子标记 表现 为共 显性(condominace ) , 能够 鉴别出纯合基因型与杂合基因型, 提供完整的遗传信息。 近年来, 由 于分子标记的巨大优 6越性,DNA 分子标记技 术已经广泛地应用于研究群体遗传多样性、 保护生物学和生态学等 、 [85 86] 科学领域中 。这 种技术发展迅猛,至今已有 10 余种分子标记技术相继出现,并在各 个领域得到应用。 近年 来, 利用分子标记进行 克隆多样性的研究越来越多。 一般来说, 在 所有多态位点上都具有相同基因型的分株可以被认为属于同一克隆系。 克隆鉴定的结果一 般都通过图谱的形式来表现, 这种克隆图谱能清楚地表明各个基因型的分株在种群中的位 置。 在克隆鉴定上应用得比较多的分子标记有: 同工酶 (等位酶) 、RAPD 、AFLP 、ISSR 、 [65、87-99] 微卫星 DNA 等。 在国 内外等位酶标记曾经广泛的用来进行克隆鉴定 。 但是在大多 数 类群中等位酶标记能检测出的遗传多样性都很低,而且很难进行有效的个体鉴定。 自 从 Millis1986 年 首 创 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction, PCR 技 术 以 后 , Williams 和 Welsh 领导 的 两 个 研 究 小 组 于 1990 年 几 乎 同 时 建 立 了 检 测 最 机 扩 增 多 态 性 DNA 的技术。 由于 RAPD 具有几乎是无限的信息量, 快速, 高效, 自动化的特点, 加上 该方法的成本较地,灵敏度高,20 世纪 90 年 代以来被较广泛应用于遗传多样性研究。因 [69-71、100、101] 此采用该方法来进行克隆鉴定和克隆多样性研究的相关报道也比较多 。 AFLP 是 1992 年 由 Zabeau 和 Vos 发展 起来的一种新的检测 DNA 多态性的方法。 它 继 承了 RFLP 的可靠性和 PCR 的方便性, 该方法 的优点是结果稳定可靠, 重复性强; 是显性 和共显性共存的一种标记;多态性很强,在不需要知道 DNA 序列的情况下,可在一次单 个反应中检测到大量的片段。AFLP 技术是一 种新的而且有很大功能的 DNA 指纹技术。 采 [102-105] 用 AFLP 来进行克隆鉴定的研究也有不少 。 微卫星 DNAMicrosatellite DNA ,又称简单重 复序列(simple repeat sequence,SRS 或 SSR ) , 是一类以 1~6bp 的核苷酸为基本单位、 呈串联重复状散在分布于整个基因组的重复 序列。微卫星 DNA 表现为共显性,遵循简单孟德尔遗传定律。与其他分子标记相比,具 有数量多、 分布广且均 匀、 多态性丰富、 分析 快速方便等一系列优点, 在基因组研究中作 为一种主要的分子标记技术, 已广泛应用于遗传图谱的构建、 比较基因组研究、 遗传多样 性分析和系统学研究之中。 具有重要的理论意义和深远的应用前景。 但它的一个主要问题 是需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆和序列分析, 费时费力且代价昂贵。 故 [106-109] 采用该方法来进行克隆结构方面的研究比较少 。 ISSRinter-simple sequence repeat 又称简单重 复序列间扩增, 是近年来发展 起来的一类 新型的分子标记技术。用于 ISSR-PCR 扩增的引物通常为 16~18 个 碱基序列,由 1~4 个 碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成, 通过 PCR 扩增 SSR 之间的 DNA 片段。 SSR 在真核生物中分布 非常普遍,且进化速度很快,因而锚定引物的 ISSR-PCR 可以检测 到基因组许多位点的变异。 该技术通常为显性标记, 且具有很好的稳定性和多态性, 因而 是一种非常理想的用于构建 PCR 为基础的分子图谱的分子标记技术。 它可以揭示比 RFLP 、 RAPD 、SSR 更多的多 态性。但目前采用 ISSR 方法来进行克隆多样性的研究的报道不多 [110-112] 。 71.4 研 究 目 的 罗汉果 (S. grosvenorii ) , 是我国重要的经济作物。 由于罗汉果一方面能开花结实进行 有性繁殖, 另一方面又能通过其藤本茎进行无性繁殖。 未能攀援到支持物的藤本茎, 有的 地方接触到地面, 并形 成不定根, 最后形成块 根, 茎在冬天枯死, 块 根于下一年形成新 的 无性系植株。 因此罗汉果是典型的兼性克隆植物。 在野外考察中我们发现有少数罗汉果植 株出现在别处扎根的现象。 但是很少看到有开花结果的植株, 而且也无法 从形态上辨认地 面上的幼小植株是实生苗还是克隆分株。 由于罗汉果具有经济价值, 未等其果实彻底成熟, 就已经被附近的村民采摘。 因此, 我们推测野 生罗汉果的克隆生长现象应该普遍存在, 较 大种群很有可能存在一个或几个较大的克隆。 某些克隆植物的克隆程度可以通过挖掘来确 定, 很显然这种鉴定方法对罗汉果是无效的。 因此, 使用分子标记来鉴定该种群的基因型 和克隆空间结构是最有效的方法。 目前, 关于罗汉果种群分布格局和克隆结构方面的研究尚未有报道。 本研究采用方差 / 均值比率法对 8 个野生罗汉果种群进行种群分布格局研究, 同时采用 RAPD 方法对其中的 4 个野生罗汉果种群进行克隆鉴定。 本研究的目的:1. 在于探讨野生罗汉果种群分布格局 的特点及形成原因, 为 掌握罗汉果的生物生态学特性提供理论依据;2. 了解野生罗汉果的 克隆多样性水平、 克隆结构及其影响因素, 揭示种群内的克隆大小和空间分布格局, 为进 一步揭示其克隆生长过程和生态适应机制提供基础信息。 8第 二 章 研 究 材 料 与 方 法 2.1 种 群 分 布 格 局 研 究 2.1.1 取样地点和方法 研究地点设在野生罗汉果分布较多的广西永福县、 兴安县和三江县。 在充分勘察野生 罗汉果种群分布状况的基础上, 根据不同的海拔高度和生境条件等差异, 选取 8 个有代表 2 性的种群 (见图 3) 作 为调查样地, 实行斑块内全部取样, 总取 样面积为 4150m 。 调查样 地海拔 280~1130m , 罗汉果自然种群保存相对比较完好, 群落覆盖度 0.4~0.6, 各样地的 自然概况见表 1。 根据罗汉果分布情况来确定各样地的样方数, 基本样方大小为 5m×5m。 调查过程中记录每个样方内的个体数和每株的坐标。 图 3 采样位置图 Fig.3 The localities of the samples of S. grosvenorii 9表 1 8 个罗汉果种群的自然条件。 Table 1 Environmental conditions of the eight S. grosvenorii populations in Guangxi ,China. 种群 地 点 地理位置 海 拔 坡向 生 境 Population Site Geographical location Elevation Exposure Habitat code (m ) A 三江县 109?41.316 ?N 25?39.775?E 310 北 人 工 毛 竹 斗江乡 林,林下 B 三江县 109?41.861 ?N 25?40.379?E 340 西 人 工 毛 竹 斗江乡 林,林缘 C 三江县 109?41.052 ?N 25?40.633?E 300 西 人 工 毛 竹 斗江乡 林,林下 D 三江县 110?41.101 ?N 25?39.739?E 280 西北 人 工 毛 竹 斗江乡 林,林下 E 兴安县 110?18.167 ?N 25?49.983?E 780 南 人 工 毛 竹 金石乡 林,林下 F 临桂县 109?49.503 ?N 25?25.793?E 640 南 阔 叶 林 , 黄沙乡 边缘 G 永福县堡 110?04.868 ?N 24?46.898?E 360 北 人 工 毛 竹 里乡 林,林下 H 金秀县 110?13.012 ?N 24?06.145?E 890 南 阔 叶 林 , 林下 2.1.2 数据处理 2.1.2.1 格局类型 2 [113] 采用方差 (S ) / 均值 ( X ) 比率法判断种群空间分布格局类型 (Greig-Smith, 1952) 。 n n 2 2 n x x ? 2 i i S i ?1 i ?1n X n ?1 x i i ?1 式中,n 为样方总数;x 为第 i (i1 ,2,3„,n)个样方中种群的个体数。 i 2 2 2 当 S / X 1 时,种群为随机分布,当 S / X 1 时,种群为集群分布,当 S / X 1 时 , 种群为均匀分布。实测与预测的对 1.0 的偏离程度用 t 检验来确定: 2 S /x -1 t2/n-1 102.1.2.2 聚集强度的测定 [114] Water 1959 负二项参数 K : 2 2 K X /SX K 值越小,聚集程度越大,如果 K 值趋于无穷大,则接近随机分布。 [115] Morisita 1959 扩散型指数I : δ 2 2 SXX n I × δ 2 X n ?1 当 I 1 时,为随机分布;I >0 时,为聚集分布。 δ δ [116] David 和 Moore 1954 丛生指标 I : 2 I S / X ?1 当 I0 时,随机分布;I >0 时,集群分布;I<0 时,均匀分布。 [117] Lloyd 1967 平均拥挤指数m* 和聚块性指数m*/m : n xi i ?1 m* N m*/m1+1/K 式中,K 为负二项分布值;m* 表示平均每个个体有多少个在同单位的其他个体数,m 表示均值。当 m*/m1 时,为随机分布;当 m*/m >1 时,为集群分布;当 m*/m <1 时, 为均匀分布。 2.1.2.3 格局规模检验 、 [113 118] 按 Greig-Smith 1952,1962 所提出的邻 接格子方法 对 A 、B 、D 三 个 呈 集 群 分 布 的种群进行格局规模检验。以各区组的均方值为纵坐标,以区组的单位格子数为 横坐标, 绘制格局分析图, 确定格局规模。Greig-Smith 方法是一种修正的方差分析方, 其基本原理 n 是通过单位格子样方的两两合并, 用 2 的方法 划分区组 (n0,1,2„„) 使每个区组样方面 积逐级扩大, 对各级区组样方面积上的观测值作方差分析, 分别计算其均方。 对一个集群 分布的种群,均方队区组大小的曲线将产生一系列峰值,峰值的位置指示了格局的规模, 峰值的大小表明了格局的强度。 2.2 种 群 的 克 隆 结 构 研 究 2.2.1 取样地点及取样策略 材料取自上述 8 个野生罗汉果种群中的 A 、E 、F 、G ,样地所处位 置如图 3 所示。采 样时间为 2004 年 8-2005 年 9 月。
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